一种改善小鼠和犬猫肠道健康的复合Pickering乳液制备方法和应用与流程

一种改善小鼠和犬猫肠道健康的复合pickering乳液制备方法和应用
一、技术领域
1.本发明涉及一种菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液的制备方法，以及对小鼠腹泻的治疗和改善小鼠和犬猫肠道健康的应用，属于兽药制备技术及肠道健康应用领域。
二、

背景技术：

2.菊粉，又称菊糖，是一种天然果聚糖类碳水化合物，主要存在于菊科、桔梗科、龙胆科、百合科、禾本科，例如菊芋、菊苣、大理菊、蓟、大蒜、芦笋块茎等。研究证明，菊粉作为一种膳食纤维，能够有效调节脂肪代谢，降低血糖，增强免疫力，调节肠道微生物菌群平衡，改善肠道环境。甘寡糖是一种非吸收性的糖，有研究证明，甘寡糖作为饲料添加剂，可以增强机体免疫力，还可以促进肠道有益菌群形成。谷氨酰胺，是动物体内含量丰富的游离氨基酸，研究表明，谷氨酰胺能够改善小肠形态，有效提高肠屏障功能，提高体积免疫功能，具有良好的抗氧化作用和抗炎作用。溶菌酶，又称胞壁质酶，具有抗菌、消炎、抗病毒、抗肿瘤、促进肠道有益菌的繁殖等作用，并且对人类和畜禽无毒副作用和无药害残留，常用饲料添加剂使用。
3.壳聚糖(chitosan,cs)，又称脱乙酰甲壳素，是一种多糖类天然高分子，具有良好的生物相容性和生物可降解性。在体内可降成低分子的葡萄糖，生物安全性好。壳聚糖纳米粒作为药物的新型载体，能够有效保护药物，避免药物被酶降解，提高药物的稳定性，可以对药物进行缓慢释放，延长药物在体内的半衰期，提高药物生物利用度，还可以降低药物的毒性和刺激性。同时壳聚糖分子有大量游离氨基，携带正电荷，能够通过静电作用吸附带阴离子的大分子。壳聚糖纳米粒具有生物粘附性，可以增强药物的靶向性，直接作用于靶细胞和靶器官。大量研究表明，壳聚糖纳米粒包裹药物后，口服给药能够有效提高药物的生物利用度。
4.pickering乳液为颗粒稳定的乳液，纳米粒吸附的表面可以提供巨大的比表面积，可以大幅度提高药物的装载率，具有较强的界面稳定性。同时，pickering乳液可以增强肠道上皮细胞的亲和性，有利于肠道上皮细胞对pickering乳液和装载药物的摄取。另外，pickering乳液的制备方法简单，可以构建多级结构，有利于规模生产中的应用。
5.本发明首次制备了颗粒稳定的菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液，首先制备了壳聚糖纳米粒，再以壳聚糖纳米粒作为稳定剂，以菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合物为水相，大豆油或角鲨烯作为油相，将壳聚糖纳米粒溶解于水相后，与油相进行混合超声乳化后，制备得到菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液。首先对复合pickering乳液的粒径、多分散系数、表面电荷以及形态进行测定；其次建立番泻叶致泻小鼠模型，口服复合pickering乳液后，发现复合pickering乳液具有良好的止泻作用和抗炎效果，可以增强肠道黏膜免疫，调节肠道微生物菌群的结构组成，增强对肠道的保护。最后在临床上对患腹泻的犬、猫进行口服给药，发现复合pickering乳液能够有效治疗犬、
猫的腹泻。
三、

技术实现要素：

6.技术问题
7.本发明针对犬、猫腹泻和肠道健康的问题，提供一种稳定的菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液的制备方法，提高了菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶的口服生物利用度，降低菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶的使用剂量，达到治疗腹泻和保护肠道健康的作用，并应用于宠物临床。
8.本发明还要解决的技术问题是提供上述菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液的制备方法。
9.本发明最后要解决的技术问题是提供上述菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液的应用。
10.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
11.一种菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液的制备方法，它包括如下步骤：
12.一种菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液由以下质量百分比的原料配制而成：
[0013][0014]
所述的乳化剂为大豆油与角鲨烯中的一种。
[0015]
所述的菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0016]
步骤1：称取100mg的壳聚糖溶解到20ml浓度为1％醋酸溶液中，再配置1mg/ml三聚磷酸钠溶液，按体积比为1:1，将三聚磷酸钠溶液缓慢加入到壳聚糖溶液中，搅拌混合30min，冰水浴超声5min，即得到壳聚糖纳米粒混合悬液
[0017]
步骤2：按质量比为2:1:1:1称取50mg总的菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶混合物溶解到壳聚糖纳米粒混合悬液中，与油相大豆油或角鲨烯按照体积比为9:1进行混合，冰水浴超声5min后，即得到菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液。
[0018]
步骤1中，所述的壳聚糖纳米粒混悬液中的壳聚糖浓度为1％-10％。
[0019]
步骤2中超声的处理方法为：使用细胞超声粉碎仪，在300w功率下超声20～40次，每次2～5分钟，两次超声间隔1～5s。
[0020]
上述任意一项制备得到的菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液也在本发明的保护范围之内。
[0021]
上述的菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液在制备防治机体腹泻和提高肠道免疫的药物中的应用。
[0022]
上述的菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液能够有效治疗小鼠、犬猫腹泻；效降低炎症细胞因子的表达；对小鼠空肠损伤有一定的改善和修复作用；提高siga抗体的水平，增强机体的黏膜免疫应答，同时能够有效提高肠道益生菌的形成，改善肠道环境，具有较好的改善肠道健康的功能。
[0023]
有益效果
[0024]
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
[0025]
与现有技术相比，本发明优点如下：
[0026]
1.菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液的制备国内外未见报道。本发明一种菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液的制备方法，填补了国内外研究的空白；且本发明方法操作简单，易于推广。
[0027]
2.菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液的治疗腹泻作用未见报道。通过本发明的实施，证明菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶制备成复合pickering乳液后，能显著增强治疗腹泻的效果，表现为复合pickering乳液能有效降低炎症细胞因子的表达水平，修复空肠损伤。同时提高机体siga抗体的表达水平，增强黏膜免疫；还可以提高肠道益生菌的形成，改善肠道环境。因此，菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液可以作为改善犬猫肠道健康的新型兽药，为研制新型兽药提供了材料和示范。
[0028]
3.本发明方法制备得到的菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液，利用马尔文粒度分析仪对其粒径、多分散系数(pdi)及表面电视进行了分析，并通过冷冻扫描电镜对其结构进行了研究，发现其大小在1微米左右，体系均一。
[0029]
4.本发明方法制备得到的菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液不仅能够解决菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶在胃肠道分布不均的问题，而且促进其在肠道的吸收，可以使用药物缓慢的释放，有效的延长药效，能显著防治犬猫腹泻，对促进肠道健康有重要意义。同时，本发明作为一种新型兽药，没有副作用。
附图说明
[0030]
图1为实施例1中菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液的冷冻扫描电镜图；
[0031]
图2为实施例1中各组小鼠血清炎症因子tnf-α和il-6表达水平；
[0032]
图3为实施例1中各组小鼠空肠病理切片；
[0033]
图4为实施例1中各组小鼠小肠肠液siga抗体表达水平；
[0034]
图5为实施例1中各组小鼠肠道菌属水平相对丰度；
[0035]
图6为实施例1中各组犬、猫的粪便成型率
四、具体实施方式
[0036]
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0037]
1.菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液的制备
[0038]
称取100mg的壳聚糖溶解到20ml浓度为1％醋酸溶液中(ph为5.5)中，再称取三聚磷酸钠溶解到超纯水(1mg/ml)中，按体积比为1:1，将三聚磷酸钠溶液缓慢加入到壳聚糖溶液中，搅拌混合30min，冰水浴超声5min，即得到壳聚糖纳米粒混合悬液。按质量比为2:1:1:1称取50mg总的菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶混合物溶解到壳聚糖纳米粒混合悬液中，与油相大豆油或角鲨烯按体积比为9:1进行混合，冰水浴超声处理5min后，得到稳定的菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液。
[0039]
对制备的菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液的表征进行测定，在室温下用zetasizer nano-zeta电位仪测定复合pickering乳液的粒径、多分散性指数(pdi)和表面电荷，每个样品重复测定3次，记录数据。通过冷冻扫描电镜对复合pickering乳液的形态进行观测。
[0040]
表1菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液的粒径、多分散系数和表面电荷
[0041][0042]
菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液的粒径、多分散系数和表面电荷结果如表1所示，纳米粒的粒径为1008.1nm，多分散系数为0.350，表明复合pickering乳液的分散分布比较均一，复合pickering乳液电势为4.4mv。
[0043]
如图1所示，菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液在冷冻扫描电镜下观测为多个纳米粒聚合成的球状粒子，表面有很多颗粒。pickering乳液粒径大约为1微米左右。
[0044]
2.菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液治疗腹泻效果
[0045]
以菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液为研究对象，以菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶混合物作为对照，研究它们对番泻叶致泻小鼠的治疗效果，测定小鼠血清中炎症细胞因子的表达水平、小鼠空肠的病理切片变化、小鼠小肠肠液的siga抗体水平以及小鼠肠道微生物菌群多样性分析。
[0046]
(1)番泻叶致泻小鼠模型的建立
[0047]
小鼠造模采用水煮提取法将番泻叶制成1:1浓缩液，按小鼠体重0.2ml/10g的剂量灌胃造模，每天一次，连续灌胃3天，模型小鼠出现腹泻症状，即造模成功。
[0048]
(2)试验分组及处理
[0049]
将80只icr小鼠(雌鼠，体重20g)随机分为4组，每组20只。分别为空白组，模型组，菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶混合物组和菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液组。其中模型组、混合物组和复合pickering乳液组，按照小鼠体重0.2ml/10g的剂量灌胃番泻叶浓缩液造模，连续灌胃3天，建立腹泻模型，对照组灌胃等体积的生理盐水。第4天，混合物组小鼠灌胃0.4ml菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶混合物，连续灌胃7天；复合pickering乳液组小鼠灌胃0.4ml菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液，连续灌胃7天；模型组和对照组灌胃等体积的生理盐水，连续灌胃7天。
[0050]
灌胃两天后，观察并记录各组小鼠状态。每组随机选择10只小鼠，乙醚麻醉后，摘眼球取血，4000rpm离心10min收集小鼠的血清。同时随机采集3只小鼠空肠，多聚甲醛固定后，he染色制成病理切片。
[0051]
灌胃7天后，小鼠禁食不禁水，第8天，各组小鼠脱颈处死后，收集各组小鼠的小肠肠液(用1ml含蛋白酶抑制剂的pbs冲洗液，冲洗8-9次，至肠液全部洗净，每组5只)。同时无菌收集各组小鼠盲肠粪便(n＝5)，放在无菌ep管中置于-80℃保存。按照试剂盒说明书提取粪便样品总dna，通过琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna完整性以及nanodrop 2000检测基因组dna质量，再对样本进行目的区域检测扩增，各样本添加特异性标签序列，文库进行定量及混合，文库质量检测，miseq上机测序等步骤，进行后续小肠肠道微生物菌群多样性分析。
[0052]
(3)小鼠整体状态观察
[0053]
灌胃两天后，各组小鼠的整体状态和粪便状态如表2所示，模型组的小鼠精神沉郁、反应迟钝、背毛耸立、弓背颤抖，粪便呈稀水样；混合物组的小鼠精神状态较好、背毛稍凌乱，粪便稀软；而复合pickering乳液组组的小鼠精神活跃、背毛光滑，粪便成型，颗粒状或较稀软。
[0054]
表2各组小鼠整体状态和粪便状态
[0055][0056][0057]
(4)小鼠血清炎症细胞因子水平
[0058]
通过对比各组小鼠血清中炎症细胞因子水平发现，模型组小鼠血清中的炎症细胞因子tnf-α和il-6水平最高，明显高于其他组(图2a和图2b)。混合物组的tnf-α和il-6水平明显低于模型组，而复合pickering乳液组的tnf-α和il-6水平明显低于模型组和混合物组。表明，混合物组和复合pickering乳液组都能够有效降低炎症因子tnf-α和il-6的表达，并且复合pickering乳液组的效果要优于混合物。
[0059]
注：*表示与模型组对比，#表示与复合物对比，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001，
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p《0.05,
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p《0.01,
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p
[0060]
《0.001。
[0061]
(5)小鼠空肠病理切片
[0062]
各组小鼠空肠病理切片结果如图3所示，空白组的肠组织整体结构正常，肠绒毛排列整齐，粘膜层未见上皮细胞明显脱落水肿，未见明显炎性细胞浸润；模型组的肠绒毛整体结构轻度异常，黏膜下层可见明显的大面积疏松水肿，肠绒毛结构及排列紊乱，伴有少量出血，并可见明显的上皮细胞脱落；混合物组肠道整体排列较造模组相比，黏膜下层水肿程度有一定程度的改善，肠绒毛排列基本正常，但仍存在少量出血并伴有稀疏水肿，未见明显的肠道上皮细胞脱落；复合pickering乳液组的肠道整体结构基本正常，除肠绒毛少量稀疏水肿外，整体未见明显异常，出血情况也得到明显改善。
[0063]
(6)小鼠小肠肠液siga抗体水平
[0064]
灌胃7天后，测定各组小鼠小肠肠液中siga抗体水平，结果发现，相比于空白组，模型组的siga抗体水平明显降低。灌胃菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶混合物和菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液后发现，混合物组和复合pickering乳液组组能够明显提高siga抗体的表达水平，并且复合pickering乳液组的siga水平明显高于混合物组。表明，复合pickering乳液组能够明显增强黏膜免疫应答。注：*表示与模型组对比，#表示与复合物对比，*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001，
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p《0.05,
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p《0.01,
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p
[0065]
《0.001。
[0066]
(7)小鼠肠道微生物菌群多样性分析
[0067]
lactobacillus、parabacteroides和bacteroides作为肠道益生菌，有助于肠道健康。相比于模型组，菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液组能够有效促进bacteroides、parabacteroides和lactobacillus恢复到正常水平，同时可以降低staphylococcus和prevotella致病菌的相对丰度。表明，菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液能够有效促进益生菌的形成，调节肠道菌群环境，从而缓解腹泻引起的菌群失调。
[0068]
根据上述动物试验结果，可以发现与混合物组相比，复合pickering乳液更能有效降低炎症细胞因子tnf-α和il-6的表达，可以有效改善腹泻引起的空肠损伤，增强siga抗体表达水平，从而增强黏膜免疫。复合pickering乳液还可以有效促进肠道益生菌的形成，改善肠道环境。说明本发明涉及的菊粉、甘寡糖、谷氨酰胺、溶菌酶复合pickering乳液能够有效治疗番泻叶引起的小鼠腹泻，具有抗炎、修复肠道损伤、增强黏膜免疫以及改善肠道微生物菌群的作用。
[0069]
3.临床上对腹泻犬、猫的治疗效果
[0070]
临床上分别收集犬腹泻的病例15例，猫腹泻的病例15例，共30例。分为三组，分别对患病的犬和猫口服使用混合物、复合pickering乳液或者不用药，每天一次，每次2ml，记录用药后不同时间段，患犬或猫的精神食欲和粪便成型率，评判疗效。
[0071]
口服使用复合pickering乳液后，患病犬、猫的精神状态逐渐改善，食欲增加。各组的粪便成型率结果如图6所示，口服使用复合pickering乳液的患病犬、猫的粪便成型率都要高于不用药组和混合物组。口服给药3天后，粪便成型率能够达到100％。结果表明，复合pickering乳液口服给药能够有效治疗犬、猫的腹泻。