C20orf112蛋白的第295位Ser磷酸化在癌细胞增殖调控中的应用

c20orf112蛋白的第295位ser磷酸化在癌细胞增殖调控中的应用
技术领域
1.本发明属于蛋白质科学领域，特别涉及c20orf112蛋白的第295位ser磷酸化在癌细胞增殖调控中的应用。


背景技术：

2.癌症是世界上最难治疗的疾病之一，而目前结直肠癌(crc)是严重威胁人类生命的恶性肿瘤之一
1.，在全球恶性肿瘤死亡率居第二位。现有靶向cscs 的诊断与治疗并不理想，其中最重要的原因就是部分肿瘤干性调控因子仍未被发现。越来越多证据表明肿瘤增殖是肿瘤发展与复发的重要特征
2.，但其潜在机制尚不清楚。高度增殖的细胞，往往能产生异质性的肿瘤细胞，它们与胚胎干细胞有很多共性，在维持肿瘤发生与发展，促进肿瘤对化疗与放疗耐受中都发挥重要作用
[3
‑
4]。与普通细胞相比，高度增殖的细胞往往能躲过放疗和化疗等传统肿瘤治疗手段，转移到合适的转移灶，分化出肿瘤细胞以及各种肿瘤相关细胞形成转移瘤
[5]
。然而肿瘤的增殖调控非常复杂，目前针对肿瘤的诊断和治疗并不理想，其中重要的原因是许多肿瘤增殖调控因子尚未被发现。
[0003]
人类未知功能蛋白组是由功能上未被鉴定的蛋白组成，且未知功能蛋白组中含有丰富的肿瘤相关新蛋白，可用于深度挖掘。为了深入探索人类新蛋白质，人类染色体蛋白质组计划(chromosome
‑
centric human proteome project, c
‑
hpp)于2012年9月在悉尼召开的第九届国际蛋白质组学大会上正式提出的大型国际合作计划。旨在10年内(2012.09
‑
2022.09)完成人类24条染色体和线粒体上蛋白质编码基因产物本身及其修饰产物的检测、验证和确认，注销可能过度注释的编码基因，绘制基因图谱并实现人类基因组的重注释。为了分批解析和注释这些暗蛋白质，国际组织于2018年推出了一项新的计划： next
‑
cp50计划
[6]
，由全球12个国家的15个团队针对首先列出的50个upe1蛋白质进行细胞功能解析，为下一阶段研究其它暗蛋白质提供理论与实践基础。其中我们中国团队承担人类第20号染色体上的部分未知功能蛋白的功能研究。作为其中团队之一，我们关注于人类20号染色体上的未知功能蛋白c20orf112，首次发现该蛋白与结直肠癌增殖生长有密切关系。
[0004]
磷酸化是细胞内最重要的可逆蛋白质翻译后修饰之一，通过激酶将atp的磷酸基团转移到底物蛋白质的特定位点(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)上，磷酸化酶去除修饰的磷酸基团而完成可逆的修饰调控
[5]
。蛋白质磷酸化与去磷酸化过程参与调控胞内许多网络的信号转导，包括调节细胞增殖、发育、分化、凋亡及新陈代谢等过程
[7
‑
8]
。我们发现c20orf112的s295位点直接影响该蛋白的细胞定位，从而影响细胞的增殖。但目前尚未有研究c20orf112的295位ser磷酸化在结直肠癌细胞生长方面的关系的相关报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供第295位ser磷酸化的 c20orf112蛋白在制备调控癌细胞增殖和/或生长的产品中的应用。
[0006]
本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007]
第295位ser磷酸化的c20orf112蛋白在制备调控癌细胞增殖和/或生长的产品中的应用。
[0008]
所述的c20orf112蛋白的氨基酸序列在genbank的登录号为aah65370.1。
[0009]
编码所述的c20orf112蛋白的核苷酸序列在genbank的登录号为 nm_001351680。
[0010]
所述的第295位ser磷酸化的c20orf112蛋白为c20orf112蛋白的第295位 ser磷酸化，或c20orf112蛋白的第295位ser突变为asp。
[0011]
所述的调控为第295位ser磷酸化后的c20orf112蛋白抑制癌细胞的增殖和 /或生长。
[0012]
所述的癌细胞为结直肠癌细胞。
[0013]
所述的产品包括药物等。
[0014]
第295位ser磷酸化的c20orf112蛋白在制备防治结直肠癌的药物中的应用。
[0015]
所述的防治结直肠癌的药物抑制结直肠癌细胞增殖和/或生长。
[0016]
促进c20orf112蛋白第295位ser磷酸化的物质在制备抑制癌细胞增殖和/ 或生长的产品中的应用。
[0017]
所述的促进c20orf112蛋白第295位ser磷酸化的物质包括促进c20orf112 蛋白第295位ser磷酸化的试剂和/或药物等。
[0018]
所述的癌细胞为结直肠癌细胞。
[0019]
抑制c20orf112蛋白第295位ser磷酸化的物质在制备促进癌细胞增殖和/ 或生长的产品中的应用。
[0020]
所述的抑制c20orf112蛋白第295位ser磷酸化的物质包括抑制c20orf112 蛋白第295位ser磷酸化的试剂和/或药物等。
[0021]
所述的癌细胞为结直肠癌细胞。
[0022]
所述的产品为增殖和/或生长能力增强的癌细胞模型。
[0023]
本发明结合体外与体内实验，结果表明c20orf112的295位ser磷酸化可以抑制肠癌的生长。本发明提供c20orf112的295位ser磷酸化在肠癌发生中的分子机制，为癌症的发生机制研究和c20orf112这个未知功能蛋白质在生命活动中的作用奠定了理论基础。
[0024]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明通过基于数据独立获取的蛋白质组学对cscs和亲代crc细胞的差异进行定量比较，数据初步显示，功能上未鉴定的蛋白染色体20开放阅读框112(c20orf112)在cscs中上调，而蛋白质的磷酸化修饰已经被证实是生物体内主导细胞分化、生长以及迁移等生命活动的最普遍的调控手段，且许多磷酸化蛋白与激酶在肿瘤发生发展过程中发挥关键作用；本发明是首次报道人c20orf112蛋白质的295位丝氨酸(ser295) 磷酸化，即p
‑
c20orf112
‑
s295在crc增殖的维持中起到至关重要的作用，为针对该位点设计靶向药物的研发提供坚实的理论依据，且有助于研究结直肠癌发生的分子机制并为结直肠癌精准治疗的研究提供新的思路。
附图说明
[0025]
图1是c20orf112及c20orf112的130位、295位ser磷酸化和干性指标在肠癌细胞稳转细胞株中的表达情况图；其中，a为wb检测干性指标；b为wb 检测c20orf112在细胞核和细
胞质中的含量。
[0026]
图2是c20orf112及c20orf112的130位、295位ser磷酸化对肠癌细胞增殖的影响(生长曲线)图。
[0027]
图3是c20orf112及c20orf112的130位、295位ser磷酸化对肠癌细胞增殖的影响(克隆形成和肿瘤球形成)图；其中，a为各细胞株的克隆形成；b 为各细胞株的肿瘤球形成；c为克隆形成统计；d为肿瘤球形成统计。
[0028]
图4是c20orf112及c20orf112的130位、295位ser磷酸化在细胞中的定位情况图。
[0029]
图5是c20orf112及c20orf112的295位ser磷酸化对裸鼠皮下肠癌细胞的成瘤能力的影响图；其中，a为裸鼠皮下成瘤图；b为各细胞株的肿瘤体积检测结果；c为肿瘤重量分析。
[0030]
图6是c20orf112在细胞中调控细胞增殖的机理图。
具体实施方式
[0031]
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
[0032]
本发明中涉及的c20orf112蛋白的氨基酸序列genbank登录号为 aah65370.1。编码c20orf112蛋白的核苷酸序列genbank登录号为 nm_001351680(中国专利申请，申请号为“202011183379.6”、名称为“c20orf112 在制备促进癌细胞增殖产品中的应用”中也公开了其具体的氨基酸(seq id no.1) 和核苷酸序列(seq id no.2))。
[0033]
实施例1c20orf112的295位ser磷酸化调控裸鼠体内人肠癌细胞的增殖
[0034]
体外实验：对不同结直肠癌细胞系做稳转细胞株，然后通过wst
‑
1实验检测细胞生长速度，分别研究c20orf112过表达和c20orf112的295位ser磷酸化和非磷酸化对肠癌细胞增殖的影响。
[0035]
(1)过表达和295位ser磷酸化及非磷酸化突变的c20orf112的稳转细胞株western blot检测c20orf112过表达实验
[0036]
plvx
‑
puro
‑
c20orf112重组质粒的构建：在plvx
‑
puro载体(clontech, cat#632159)的骨架上构建plvx
‑
puro
‑
c20orf112的重组质粒，利用同源重组方法，采用c112
‑
clonexpress ii one step cloning kit试剂盒(诺唯赞，cat#c112
‑
01)，将c20orf112基因片段(seq id no.2)插入到plvx
‑
puro载体中，具体步骤如下：
[0037]
1)提取人类结直肠癌hct116细胞(购于中国科学院上海生科院细胞资源中心)总rna，将其反转录产物作为cdna模板，然后通过pcr扩增实验、胶回收纯化获得c20orf112基因片段；其中，pcr上下游引物为c20orf112 up和 c20orf112 dw：
[0038]
c20orf112 up：5
’‑
ttctagagcggccgcggatccatgagcgactccaca
‑3’
；
[0039]
c20orf112 dw：5
’‑
gagggagagggggcgggatcctcatgctgaggtccg
‑3’
。
[0040]
pcr反应体系为：浓度为1μg/ul的cdna模板1μl、浓度为10μm的c20orf112 up 1μl、浓度为10μm的c20orf112 dw 1μl、pcr mix(2
×
)25μl、灭菌纯水(ddh2o)至50μl。
[0041]
pcr反应条件如下：98℃5min；98℃10s、60℃30s、72℃90s，共35 个循环；最后，72
℃10min；4℃30min。
[0042]
2)将plvx
‑
puro载体进行bamhi(takara,cat#1650)单酶切反应，酶切体系如表1所示，37℃金属浴中静置15min，然后分别进行胶回收纯化，得到带限制性内切酶粘性末端的plvx
‑
puro线性化载体。
[0043]
表1 plvx
‑
puro载体的酶切体系
[0044]
plvx
‑
puro载体1μg内切酶bamhi2μl酶切缓冲液(10
×
)2μl灭菌纯水(ddh2o)至20μl
[0045]
3)将c20orf112基因片段和plvx
‑
puro线性化载体通过同源重组连接酶连接，连接体系如表2所示。连接条件如下：37℃连接30min。
[0046]
表2 c20orf112基因片段和plvx
‑
puro线性化载体的连接体系
[0047]
plvx
‑
puro线性化载体160ngc20orf112基因片段52ng重组酶exnasetmⅱ2μl5
×
ce ii buffer4μl灭菌纯水(ddh2o)至20μl
[0048]
4)将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，具体如下：取连接产物20 μl与50μl大肠杆菌dh5α感受态细胞(od值为0.5)轻轻混合，冰上静置30min； 42℃水浴90s，冰上静置2min；加入400μl lb培养基，37℃、180rpm摇瓶培养60min。
[0049]
5)取200μl菌液涂在lb固体培养基平板上，挑选6个单克隆，接种于加有氨苄青霉素(100ug/ml)的lb培养基的12孔板中，37℃摇菌4～5h；然后进行菌液pcr筛选阳性单克隆：以菌液为模板，以上述引物c20orf112 up和 c20orf112 dw为菌落pcr引物，进行pcr扩增；接着进行凝胶电泳，筛选阳性单克隆；最后将阳性单克隆扩大培养，一部分提取质粒，送公司测序，另一部分保种：
‑
80℃液氮罐中保存。
[0050]
6)使用mut express ii fast mutagenesis kit v2试剂盒(诺唯赞，cat#c214
‑
01) 将c20orf112基因片段中130位和295位ser做突变处理(将c20orf112基因片段中的130位及295位丝氨酸(s)突变为丙氨酸(a)或天冬氨酸(d))。具体步骤如下：
[0051]
以c20orf112过表达质粒为模板进行pcr扩增反应，引物序列见表3。pcr 反应体系为：以浓度为1μg/ul的c20orf112过表达质粒为模板1μl、浓度为10 μm的c20orf112突变引物(f和r)1μl、pcr mix(2
×
)25μl、灭菌纯水(ddh2o) 至50μl。pcr反应条件如下：98℃5min；98℃10s、60℃120s、72℃90s，共35个循环；最后，72℃10min；4℃30min。将得到的pcr产物进行琼脂糖凝胶检测，检测后使用dpn1消化(去除原始模板质粒)，体系为：dpn1 1μl、产物45μl，轻轻吸打混匀后，短暂离心收集至管底，置于37℃恒温反应1h。随后进行重组反应，体系如表4所示。连接条件如下：37℃连接30min。然后将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，具体如下：取连接产物20μl与 50μl大肠杆菌dh5α感受态细胞(od值为0.5)轻轻混合，冰上静置30min；42℃水浴90s，冰上静置2min；加入400μl lb培养基，37℃、180rpm摇瓶培养 60min。最后取200μl菌液涂在lb固体培养基平板上，挑选6个单克隆，接种于加有氨苄青霉素(100ug/ml)的lb培养基的12孔板中，37℃摇菌4～5h；然后进行菌液pcr筛选阳性单克隆：
以菌液为模板，以上述引物c20orf112 up 和c20orf112 dw为菌落pcr引物，进行pcr扩增；接着进行凝胶电泳，筛选阳性单克隆；最后将阳性单克隆扩大培养，一部分提取质粒，送公司测序，另一部分保种：
‑
80℃液氮罐中保存。将构建得到的突变质粒分别命名为： plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s130a、plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s130d、 plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s295a、plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s295d。
[0052]
表3各位点突变引物
[0053]
名称序列(5
′‑3′
)c20orf112(s130a)fcacccccgaggcccccccctacagctctgggagctacgattcc20orf112(s130a)rtgtaggggggggcctcgggggtggtcttcaccccgtatttgac20orf112(s130d)fcacccccgaggaccccccctacagctctgggagctacgattcc20orf112(s130d)rtgtagggggggtcctcgggggtggtcttcaccccgtatttgac20orf112(s295a)fctaccagtccgcacaggatgagcccatagccctggacaagcac20orf112(s295a)rgctcatcctgtgcggactggtagatctctagacgcatccgctc20orf112(s295d)fctaccagtccgaccaggatgagcccatagccctggacaagcac20orf112(s295d)rgctcatcctggtcggactggtagatctctagacgcatccgct
[0054]
表4
[0055]
dpn i消化产物200ng5
×
ce ii buffer4μl重组酶exnase ii2μlddh2oup to 20μl
[0056]
7)慢病毒载体构建稳转细胞系，实验如下：
[0057]
①
复苏hek 293t细胞(购于中国科学院上海生科院细胞资源中心)，以常规传代培养方法进行传代3次后准备用于共转染病毒包装实验；共转染前一天 (约24小时)在六孔板中铺hek
‑
293t细胞进行传代，每个孔中大约有60％左右的细胞量；转染当天hek
‑
293t细胞汇合度接近90％；
[0058]
②
将质粒plvx
‑
puro(过表达c20orf112的对照组)、plvx
‑
puro
‑
c20orf112、 plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s130a、plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s130d、 plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s295a、plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s295d分别与包装质粒 (pmd2.g和pspax2，均购自权阳生物科技有限公司)各2μg，加入适量的无血清dmem培养基(thermo fisher scientific)中，轻轻混匀，随后加入lip3000 4μl，轻轻混匀，室温静置15min，得到混合液，然后将混合液分别加入待转染的hek 293t细胞中，37℃、5％co2培养箱中孵育，得到病毒液1(plvx
‑
puro、 pmd2.g及pspax2转染hek 293t)、病毒液2(plvx
‑
puro
‑
c20orf112、pmd2.g 及pspax2转染hek 293t)、病毒液3(plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s130a、pmd2.g 及pspax2转染hek 293t)、病毒液4(plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s130d、pmd2.g 及pspax2转染hek 293t)、病毒液5(plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s295a、pmd2.g 及pspax2转染hek 293t)及病毒液6(plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s295d、pmd2.g 及pspax2转染hek 293t)。
[0059]
③
转染48h后，移除上清液，在216g速度下离心3min，去除细胞碎片；
[0060]
④
感染目的细胞rko(购于中国科学院上海生科院细胞资源中心)，病毒感染前一天，对待感染目的细胞rko贴壁细胞进行传代，感染当天，rko细胞汇合度达到90％，所用的
培养基为dmem完全培养基；吸取目的细胞培养上清液，用0.45μm的滤器将病毒过滤以除去细胞碎片，然后分别将2ml病毒液1、病毒液2、病毒液3、病毒液4、病毒液5、病毒液6别加入目的细胞rko中；
[0061]
⑤
抗性筛选：感染两天后换液(2ml dmem完全培养基)，然后加嘌呤霉素至终浓度为1μg/ml，用于结直肠癌rko细胞系的筛选，直至细胞数量无明显变化后撤药(更换为不含嘌呤霉素的培养基)，得到细胞株1(plvx
‑
puro感染rko，rko
‑
nc)、细胞株2(plvx
‑
puro
‑
c20orf112感染rko，c20orf112)、细胞株3(plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s130a感染rko，c20orf112
‑
s130a)、细胞株 4(plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s130d感染rko，c20orf112
‑
s130d)、细胞株5 (plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s295a感染rko，c20orf112
‑
s295a)、细胞株6 (plvx
‑
puro
‑
c20orf112
‑
s295d感染rko，c20orf112
‑
s295d)。
[0062]
⑥
蛋白印迹实验检测干扰效果：撤药3天后，收细胞，做蛋白质印迹实验，以确定目的蛋白的表达效率；具体如下：
[0063]
(a)本次所检测蛋白裂解液来自细胞株1、细胞株2、细胞株3、细胞株4、细胞株5、细胞株6，每种细胞株取约100万个细胞；
[0064]
(b)裂解细胞：分别用预冷的pbs缓冲液(0.01m、ph＝7.4)洗三遍，加入100μl的ripa细胞裂解液(碧云天，p0013b)，冰上裂解30min，每隔10min 轻轻颠倒混匀一次；4℃、13200rpm离心30min，取上清进行蛋白浓度测定，细胞株1
‑
6的浓度分别为1.6、1.7、1.6、2.0、1.8、2.2ng/μl；
[0065]
(c)制样：分别取30μg的蛋白加入20ul 1
×
蛋白上样缓冲液(碧云天， p0015)，混匀，在沸水浴中煮10min，得到样品；
[0066]
(d)制胶：配制12％的分离胶(5ml)：1.5mm tris
‑
hcl(ph8.8)1.9ml，ddh2o 1ml，30％丙烯酰胺2ml，10％sds(十二烷基硫酸钠)50μl，10％过硫酸胺 50μl，temed(四甲基乙二胺)2μl(加入后混匀，快速制胶)；配制5％浓缩胶(3ml)：1.5mm tris
‑
hcl(ph8.8)0.38ml，ddh2o 2.1ml，30％丙烯酰胺0.5ml，10％sds(十二烷基硫酸钠)30μl，10％过硫酸胺30μl，temed (四甲基乙二胺)6μl(加入后混匀，快速制胶)；
[0067]
(e)将上述的样品沸水中煮5min后，冰上放置2min，离心10s使侧壁上的液体回到ep管底部，准备上样；
[0068]
(f)装好电泳仪(美国bio
‑
rad公司)，加入电泳缓冲液并且上样；
[0069]
(g)上样完后，先使用80v电压跑30min，再使用120v电压，直至溴酚蓝条带接近末端，结束电泳，裁剪相应大小的pvdf膜(美国bio
‑
rad公司)；
[0070]
(h)将pvdf膜用甲醇浸润活化至变色，按照滤纸
‑
凝胶
‑
pvdf膜
‑
滤纸的顺序摆好，接入转膜电源，235ma恒电流冰上转膜90min；
[0071]
(i)转膜完后，取出pvdf膜，用tbst缓冲液润洗去除残留的转膜缓冲液，然后用5％(v/v)的脱脂牛奶室温封闭1h；
[0072]
(j)封闭完后用tbst润洗去除残留的牛奶，根据蛋白指示带剪膜，加入anti
‑
c20orf112(购于abcam公司，cat#ab237758)(稀释比例1:3000)，4℃孵育过夜(16h)；回收一抗，用tbst洗膜30min，每隔十分钟换一次液，加入稀释1:4000的相应二抗(hs101
‑
01、hs201
‑
01，全式金公司)，室温孵育2h；回收二抗，用tbst洗膜30min，每隔十分钟换一次液；合理控制曝光时间显影，并用photoshop裁剪图片，并用imagej计算灰度值。
[0073]
结果如图1所示：结果表明c20orf112在rko细胞系中的重组过表达质粒和突变质粒构建成功，且检测结果显示了稳转细胞中c20orf112蛋白质的表达量且干性marker的表达情况。
[0074]
8)将构建成功的细胞株冻存于
‑
80℃。
[0075]
(2)细胞生长速度检测
[0076]
1)分别将上述构建成功的细胞株1～6铺入96孔板内，每孔3000个细胞；
[0077]
2)每隔24小时用cck
‑
8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(购自陶素生物科技有限公司)检测细胞活性，连续检测6天(图2)。以上实验步骤进行3次生物学重复。图2说明c20orf112过表达可以促进结直肠癌细胞rko的增殖，c20orf112的295位ser磷酸化后可抑制结直肠癌细胞rko的增殖。
[0078]
(3)克隆形成能力检测实验步骤如下：
[0079]
1)用细胞消化液(0.25％胰酶，gibco，每100万细胞用1ml)分别将生长良好的细胞株1～6消化成单细胞，重悬混匀，并用血球计数板计数；
[0080]
2)在6孔板中铺板，每个孔铺500个细胞，每个样品铺3个复孔，加入2mldmem完全培养基混匀，隔3天更换一次新鲜的dmem完全培养基；
[0081]
3)10～14天后，去除6孔板中的培养基，用pbs溶液(0.01m、ph＝7.4)洗一次；
[0082]
4)去除pbs溶液，加入1ml的无水甲醇，将细胞固定10min；
[0083]
5)去除无水甲醇，加入1ml结晶紫溶液(0.1％)，染色10min；
[0084]
6)去除结晶紫溶液，用pbs(0.01m、ph＝7.4)清洗3次，使背景降低；
[0085]
7)晾干后，于扫描仪中扫描成高分辨率图片并保存，结果如图3a和3c所示；其中，克隆形成能力检测结果如图3a所示，统计结果如图3c所示。结果显示c20orf112的高表达能够促进结直肠癌细胞增殖。过表达c20orf112的rko稳转细胞株克隆数显著增加，c20orf112的295位ser磷酸化的rko稳转细胞株克隆数显著减少，结果进一步说明c20orf112的295位ser磷酸化可以调控人肠癌细胞的增殖。
[0086]
(4)肿瘤球形成能力检测实验步骤如下：
[0087]
1)用细胞消化液(0.25％胰酶，gibco，每100万细胞用1ml)将生长良好的细胞株1
‑
6消化成单细胞，重悬混匀，并用血球计数板计数；
[0088]
2)使用低贴6孔板铺板(corning，cat#3471)，每个孔铺500个细胞，每个样品铺3个复孔，加入2mlf12培养基混匀(f12培养基配方见表5)；
[0089]
表5f12培养基配方(50ml)
[0090]
[0091]
3)7天后，显微镜下观察并拍照。结果如图3b和3d所示；其中，肿瘤球形成能力检测结果如图3b所示，统计结果如图3d所示。结果显示c20orf112 的高表达能够促进结直肠癌肿瘤球的形成。过表达c20orf112的rko稳转细胞株肿瘤球形成数显著增加，c20orf112的295位ser磷酸化的rko稳转细胞株肿瘤球形成数显著减少，结果进一步说明c20orf112的295位ser磷酸化可以调控人肠癌细胞的增殖。
[0092]
(5)细胞内共定位实验
[0093]
1)用细胞消化液(0.25％胰酶，gibco，每100万细胞用1ml)将生长良好的细胞株2～6消化成单细胞，重悬混匀，并用血球计数板计数；
[0094]
2)使用共聚焦皿铺板，每个皿铺500个细胞，加入2ml dmem完全培养基混匀，隔天待细胞贴壁后进行下面的操作；
[0095]
3)从培养箱中拿出细胞，用预热到室温的pbs缓冲液(0.01m、ph＝7.4) 清洗细胞两次。
[0096]
4)4％的多聚甲醛在室温条件下固定30min；
[0097]
5)用含有2mg/ml甘氨酸的pbs缓冲液清洗5min，以去除多聚甲醛对后续步骤的影响；
[0098]
6)细胞透化：用含有0.2％(w/v)trition x
‑
100的pbs缓冲液室温条件下透化10min。
[0099]
7)pbs缓冲液清洗两次，每次5min。
[0100]
8)封闭：10％的羊血清封闭液室温条件下封闭1h。
[0101]
9)孵育一抗：4℃层析冷柜摇床过夜孵育一抗(1:200)；其中，一抗稀释液为2％(v/v)的羊血清。
[0102]
10)细胞免疫荧光冲洗液(0.05％(v/v)的吐温20+1％(v/v)的bsa)冲洗3～4次，每次5min。
[0103]
11)孵育荧光二抗：避光条件下室温孵育1～2h；其中，二抗稀释液为2％ (v/v)的羊血清(1:200)。
[0104]
12)细胞免疫荧光冲洗液(0.05％(v/v)的吐温20+1％(v/v)的bsa)冲洗3～4次，每次5min。
[0105]
13)激光共聚焦显微镜下观察、拍照记录。结果如图4所示，c20orf112在细胞中的定位说明c20orf112定位在核内并且c20orf112的295位ser磷酸化后定位在核外，进一步证明c20orf112的295位ser磷酸化可以调控肠癌细胞的增殖。
[0106]
实施例2c20orf112促进裸鼠体内人肠癌细胞移植瘤的生长
[0107]
体内实验：选取30只6周龄、雄性裸小鼠(balb/c
‑
nu/nu)(购于江苏集粹药康生物科技有限公司)，空白对照组(rko
‑
nc)6只，过表达组(rko
‑
c20orf112) 6只，过表达c20orf112的295位ser磷酸化(rko
‑
c20orf112
‑
s295d)组6只，过表达c20orf112的295位ser非磷酸化(rko
‑
c20orf112
‑
s295a)6只。
[0108]
构建皮下成瘤模型：
[0109]
(1)肠癌细胞rko
‑
nc、rko
‑
c20orf112、rko
‑
c20orf112
‑
s295d、 rko
‑
c20orf112
‑
s295a(构建方法同实施例1中慢病毒载体构建稳转细胞系)重悬于pbs缓冲液中，并按体积比1:1与基质胶混合，每只裸鼠皮下注射2
×
106个细胞；
[0110]
(2)在实验之前对裸鼠进行麻醉，通过无痛及有痛刺激来评估麻醉程度，确定裸鼠处于麻醉状态；
[0111]
(3)用25g针头的微注射器取重悬细胞对裸鼠进行皮下注射。
[0112]
(4)2至3周后测量肿瘤大小及裸鼠体重，随后将裸鼠安乐死并将肿瘤取出。
[0113]
裸鼠体内皮下成瘤实验结果如图5所示：肿瘤的大小表明裸鼠体内皮下成瘤受到c20orf112的295位ser磷酸化的调控，即表明c20orf112的295位ser磷酸化可以抑制肠癌的肿瘤生长。图6显示c20orf112在细胞中调控细胞增殖的机理图。
[0114]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0115]
参考文献
[0116]
[1]siegel,r.l.,miller,k.d.,fedewa,s.a.,ahnen,d.j.,etal.,colorectalcancerstatistics,2017.ca:acancerjournalforclinicians2017,67,177
‑
193.
[0117]
[2]siegel,r.,desantis,c.,jemal,a.,colorectalcancerstatistics,2014.ca:acancerjournalforclinicians2014,64,104
‑
117.
[0118]
[3]zeuner,a.,todaro,m.,stassi,g.,demaria,r.,colorectalcancerstemcells:fromthecrypttotheclinic.cellstemcell2014,15,692
‑
705.
[0119]
[4]ricci
‑
vitiani,l.,lombardi,d.g.,pilozzi,e.,biffoni,m.,etal.,identificationandexpansionofhumancolon
‑
cancer
‑
initiatingcells.nature2007,445,111
‑
115.
[0120]
[5]singhv,ramm,kumarr,prasadr,roybk,singhkk.phosphorylation:implicationsincancer.proteinj.2017feb；36(1):1
‑
6.
[0121]
[6]paikyk,lanel,kawamurat,chenyj,chojy,etal.,launchingthec
‑
hppnext
‑
cp50pilotprojectforfunctionalcharacterizationofidentifiedproteinswithnoknownfunction.jproteomeres.2018dec7；17(12):4042
‑
4050.
[0122]
[7]brognard,j.,hunter,t.,proteinkinasesignalingnetworksincancer.currentopinioningenetics&development2011,21,4
‑
11.
[0123]
[8]linding,r.,jensen,l.j.,ostheimer,g.j.,vanvugt,m.a.,etal.,systematicdiscoveryofinvivophosphorylationnetworks.cell2007,129,1415
‑
1426。