铁死亡抑制Ferrostatin-1在糖尿病性骨质疏松症治疗药物中的应用

铁死亡抑制ferrostatin-1在糖尿病性骨质疏松症治疗药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药用途的技术领域，尤其涉及铁死亡抑制ferrostatin-1在糖尿病性骨质疏松症治疗药物中的应用


背景技术：

2.糖尿病性骨质疏松症(diabetic osteoporosis,dop)是糖尿病的骨骼系统慢性并发症之一，其特征是骨量下降、骨微结构破坏和骨脆性增加，由dop引发的脆性骨折严重危害着糖尿病病人的生命健康，是世界重要的公共卫生问题。目前基础实验领域针对dop的发病机制尚待进一步研究，在临床治疗中也缺乏对dop有明确治疗效果的药物。因此十分有必要针对糖尿病性骨质疏松症这类疾病进行进一步研究，并寻找特异性的治疗药物。
3.铁死亡(ferroptosis)是一类铁离子依赖性的新型细胞程序性死亡方式，其特征在于死亡过程中伴随有大量细胞内脂质过氧化物的蓄积。铁死亡在细胞器形态学变化上与经典的凋亡形式不同，主要体现为线粒体嵴的消失与膜密度增加，但同时细胞膜保持完整且细胞核不发生明显固缩。铁死亡在生化反应过程中，细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(gpx4)表达量及活性会降低，细胞内谷胱甘肽含量耗竭，脂质在铁离子参与的fenton反应下被持续性氧化为脂质过氧化物，进一步促进了细胞的铁死亡过程。既往研究发现，糖尿病微环境中异常升高的糖脂代谢产物会对组织细胞产生毒性，骨骼细胞内失衡的能量代谢过程会产生线粒体损伤和过量的自由基，引起氧化还原平衡体系的紊乱，最终导致大量脂质的过氧化和细胞结构的破坏。发生了铁死亡的骨骼细胞将失去矿化与维持骨代谢平衡的能力，由此引起糖尿病病人骨骼质量下降。因此抑制骨骼细胞的铁死亡是治疗糖尿病性骨质疏松症的一个潜在的重要靶点。
4.ferrostatin-1(fer-1)是一类n-环己基化合物，可作为铁死亡抑制剂发挥作用。fer-1脂溶性极好，能自由扩散穿过骨骼细胞膜磷脂双分子层进入细胞，有效清除细胞内氧化状态的长链多不饱和脂肪酸。本发明首次发现，ferrostatin-1可显著挽救糖尿病微环境中骨细胞的铁死亡，缓解dop所致的骨量下降与骨微结构破坏，保护骨组织，在治疗糖尿病性骨质疏松症中发挥作用。


技术实现要素：

5.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供ferrostatin-1在制备治疗糖尿病性骨质疏松症药物中的应用，用于解决现有技术中的问题。
6.本发明一方面提供ferrostatin-1在制备治疗糖尿病性骨质疏松症药物中的应用。
7.优选的，ferrostatin-1用于提高糖尿病微环境中骨细胞细胞活力。
8.进一步优选的，ferrostatin-1用于降低糖尿病微环境中细胞内异常增高的脂质过氧化物和铁离子水平。
9.进一步优选的，ferrostatin-1用于恢复糖尿病微环境中细胞内线粒体形态。
10.进一步优选的，ferrostatin-1用于提高糖尿病小鼠骨体积分数(bv/tv)、骨小梁数目(tb.n.)和骨小梁厚度(tb.th.)，降低骨小梁间距(tb.sp.)。
11.进一步优选的，ferrostatin-1用于恢复糖尿病微环境中细胞内线粒体形态。
12.进一步优选的，ferrostatin-1用于挽救糖尿病小鼠骨细胞死亡，降低空骨陷窝数目及tunel阳性骨细胞数目。
13.本发明另一方面提供一种用于治疗糖尿病性骨质疏松症的药物组合物，其特征在于，所述组合为包含作为活性成分的ferrostatin-1及其药学上可接受的盐或衍生化合物。
14.优选的，所述组合物为片剂、粉剂、注射剂、胶囊、混悬剂、糊剂、凝胶、涂布剂、药膜剂、缓释剂或微球。
15.本发明的有益效果，本发明公开了ferrostatin-1在治疗糖尿病性骨质疏松症药物中的应用，并公开了其治疗糖尿病性骨质疏松症的药物制剂。体内实验结果显示，ferrostatin-1可以显著挽救糖尿病微环境中骨细胞的细胞活力，下调细胞内异常增高的脂质过氧化物及铁离子水平，恢复细胞线粒体正常形态。体外实验结果显示，ferrostatin-1可以显著挽救糖尿病性骨质疏松症小鼠的骨量下降和骨小梁退变，提高骨体积分数(bv/tv)、骨小梁数目(tb.n.)和骨小梁厚度(tb.th.)，降低骨小梁间距(tb.sp.)，显著挽救糖尿病性骨质疏松症小鼠骨细胞死亡，降低空骨陷窝数目及tunel阳性骨细胞数目。因此，ferrostatin-1为糖尿病性骨质疏松症的治疗提供了一种新途径。
附图说明：
16.图1是实施例1中cck-8实验的结果柱状图
17.图2 ferrostatin-1挽救糖尿病微环境中细胞内异常增高的脂质过氧化物及铁离子含量的效果验证。
18.图3是实施例3中扫描电镜的结果图片，显示了ferrostatin-1对糖尿病微环境中细胞内线粒体形态的影响。
19.图4 ferrostatin-1对糖尿病性骨质疏松症小鼠骨量及骨小梁退变的影响。
20.图5 ferrostatin-1对糖尿病骨质疏松症小鼠骨组织空骨陷窝数目及tunel阳性骨细胞数目的影响。
具体实施方式
21.下面结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。
22.实验材料：以下实施例中ferrostatin-1为商业购买获得，货号(s7243，selleck，上海，中国)，应用时ferrostatin-1用dmso进行溶解，dmso组为溶剂对照组。
23.实施例1 ferrostatin-1体外挽救糖尿病微环境中骨细胞死亡的效果验证
24.将idg-sw3骨细胞系，接种于96孔板内，每孔8000个细胞，添加棕榈酸(300μm)和葡萄糖(25.5mm)模拟糖尿病微环境(high glucose and high lipid,hghf)，对照组添加等量牛血清白蛋白(bsa)作为溶剂对照。0nm～10nm ferrostatin-1处理骨细胞系24小时后进行cck-8实验，记录450nm的吸光度值，基于吸光度计算每组细胞相对细胞活力。
25.图1是实施例1中cck-8实验的结果柱状图，图1中显示了不同浓度ferrostatin-1
处理骨细胞系24小时后对糖尿病微环境中骨细胞细胞活性的挽救效果。以对照组的吸光度进行标准化后结果显示，hghf处理显著降低骨细胞系细胞活力，1nm～10nm ferrostatin-1剂量依赖性减轻hghf引起的骨细胞系细胞损伤。
26.实施例2 ferrostatin-1对糖尿病微环境中细胞内异常升高的脂质过氧化物与铁离子水平的影响
27.使用hghf(300μm棕榈酸及25.5mm葡萄糖)和10nm ferrostatin-1处理idg-sw3骨细胞系24小时，次日用脂质过氧化物探针c11-bodipy及丙二醛(malondialdehyde，mda)试剂盒对各组细胞内脂质过氧化物含量进行测定，同时用亚铁离子探针ferroorange及铁离子含量试剂盒对各组细胞内铁离子含量含量进行测定。
28.图2显示了ferrostatin-1挽救糖尿病微环境中细胞内异常增高的脂质过氧化物及铁离子含量的效果验证。其中a为c11-bodipy探针染色结果图片，图片中未氧化的脂质显示为红色，氧化状态的脂质显示为绿色，黄色荧光信号是绿色与红色荧光的重叠，通过观察绿色与黄色荧光信号的强弱，可判断该组骨细胞细胞内脂质过氧化物水平。b是针对a中绿色荧光强度(氧化脂质)与红色荧光强度(未氧化脂质)比值进行统计的结果示意图，结果显示ferrostatin-1可显著减少hghf诱导的骨细胞内脂质过氧化物水平升高。c为ferroorange探针染色结果图片，图片中铁离子显示为橙色，通过观察橙色荧光信号的强弱，可判断该组骨细胞细胞内铁离子水平。d是针对c中橙色荧光强度(亚铁离子)进行统计的结果示意图，结果显示ferrostatin-1可显著减少hghf诱导的骨细胞内铁离子水平升高。e为利用铁离子检测试剂盒测定骨细胞内不同状态铁离子含量的统计结果示意图，结果再次显示ferrostatin-1可显著减少hghf诱导的骨细胞内铁离子水平升高。f为利用mda检测试剂盒测定骨细胞内mda含量的统计结果示意图，mda为细胞内脂质过氧化物最常见的形式，其含量可表征细胞内脂质过氧化物含量水平，结果显示ferrostatin-1可显著减少hghf诱导的骨细胞丙二醛含量水平升高
29.实施例3 ferrostatin-1对糖尿病微环境中细胞内线粒体形态的影响
30.使用hghf(300μm棕榈酸及25.5mm葡萄糖)和10nm ferrostatin-1处理idg-sw3骨细胞系24小时，次日用透射电镜进行扫描拍照，重点观察各组骨细胞内部线粒体的形体变化。
31.图3是实施例3中扫描电镜的结果图片，显示了ferrostatin-1对糖尿病微环境中细胞内线粒体形态的影响。与对照组相比，hghf处理会显著损伤线粒体，导致其细胞线粒体脊消失同时伴有显著的密度增加和膜的破裂，而给药ferrostatin-1可有效挽救hghf所导致的线粒体形态的变化。
32.实施例4 ferrostatin-1挽救小鼠糖尿病性骨质疏松症的体内效果验证
33.18只5周龄的雄性c57bl/6小随机分为3组(6只/笼)。组1全程进行正常饲料喂养，9周龄时连续4日腹腔注射柠檬酸钠缓冲液作为对照组(ctl)；组2全程进行高脂饲料喂养，9周龄时连续4日腹腔注射柠檬酸钠缓冲液溶解的链脲佐菌素溶液(注射量：25mg/kg)，11周龄开始连续注射dmso溶液(每周两次)持续6周作为糖尿病性骨质疏松症模型组(stz&hfd+dmso)；组3全程进行高脂饲料喂养，9周龄时连续4日腹腔注射柠檬酸钠缓冲液溶解的链脲佐菌素溶液(注射量：25mg/kg)，11周龄开始连续注射dmso溶液溶解的ferrostatin-1(1mg/kg，每周两次)持续6周作为治疗组(stz&hfd+fer-1)。药物治疗结束后处死各组小鼠，并取
出小鼠的下肢骨进行x-ray和micro-ct检查，随后取材经石蜡包埋后行h&e染色观察。
34.图4显示了ferrostatin-1对糖尿病性骨质疏松症小鼠骨量及骨小梁退变的影响。其中a为各组小鼠股骨远端松质骨的micro-ct图片，b为各组小鼠股骨的x-ray图片，c～f为基于micro-ct数据对各组小鼠股骨远端松质骨骨体积分数(bv/tv)、骨小梁数目(tb.n.)、骨小梁厚度(tb.th.)和骨小梁间距(tb.sp.)进行统计分析的结果示意图。结果显示，ferrostatin-1可以显著挽救糖尿病性骨质疏松症小鼠的骨量下降和骨小梁退变，提高骨体积分数(bv/tv)、骨小梁数目(tb.n.)和骨小梁厚度(tb.th.)，降低骨小梁间距(tb.sp.)。
35.图5显示了ferrostatin-1对糖尿病骨质疏松症小鼠骨组织空骨陷窝数目及tunel阳性骨细胞数目的影响。其中a为各组小鼠胫骨h&e染色切片的图片，可观察空骨陷窝数目。b为小鼠胫骨tuenl染色切片的图片，可观察tunel阳性的死亡骨细胞数目。c～e为针对a中空骨陷窝数目及b中tunel阳性骨细胞数目进行统计分析的结果示意图。结果显示，ferrostatin-1可以显著挽救糖尿病性骨质疏松症小鼠骨细胞死亡，降低空骨陷窝数目及tunel阳性骨细胞数目。
36.综上所述，从以上结果得出以下结论：
37.(1)通过体外实验得出：ferrostatin-1可以显著挽救糖尿病微环境中骨细胞的细胞活力，下调细胞内异常增高的脂质过氧化物及铁离子水平，恢复细胞线粒体正常形态。
38.(2)通过体内实验得出：ferrostatin-1可以显著挽救糖尿病性骨质疏松症小鼠的骨量下降和骨小梁退变，提高骨体积分数(bv/tv)、骨小梁数目(tb.n.)和骨小梁厚度(tb.th.)，降低骨小梁间距(tb.sp.)，显著挽救糖尿病性骨质疏松症小鼠骨细胞死亡，降低空骨陷窝数目及tunel阳性骨细胞数目。
39.综合体外和体内的实验结果，ferrostatin-1可以作为一种药物为糖尿病性骨质疏松症的治疗提供一种新的策略。
40.以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。