一种滋阴清热中药组合物及其用途

1.本发明属于中药领域，具体地涉及一种滋阴清热中药组合物。


背景技术：

2.糖尿病患者易于发生胆结石,发生率是14％～30％,女性发病率高于男性。在我国约有31.5％的糖尿病患者合并有胆结石,发病率明显高于非糖尿病者,并且糖尿病控制不佳是胆结石发病的重要危险因素之一。结石成分与非糖尿病人群的相同,为胆固醇和胆红素。
3.糖尿病时cck、生长抑素、胃泌素等胃肠激素分泌减少或释放延迟,导致胆囊收缩功能减弱。内脏自主神经功能紊乱和微血管病变可使胆囊收缩功能低下以及充盈功能异常,胆囊排空延迟,胆汁流出不畅,从而容易发生胆汁郁积,造成胆结石。糖尿病患者vp神经分布受损,导致oddi括约肌失弛缓,引起胆汁排空延迟,促进胆结石发生。ir可以导致hdl降低,甘油三酯和ldl升高,过多的胆固醇出现在胆囊内,与胆汁酸、磷脂的比例失调,胆固醇处于过饱和状态,胆红素钙形成增多,加之胆囊运动功能障碍,从而促进胆固醇结晶形成。
4.一般胆结石发作时，可出现胆绞痛，表现为上腹部或右上腹部剧痛并放射至右肩背部，同时有恶心、呕吐，若伴发胆囊炎或胰腺炎，则有畏寒、发热等表现。但糖尿病患者并发胆结石，绝大多数人(约81.25％)无症状。有些较严重的患者因结石堵塞胆囊管和胆管，可出现右上腹剧烈疼痛、恶心、呕吐、发热等胆绞痛和急性胆囊炎的表现，甚至引起胆囊坏死、穿孔。因此，对于糖尿病性胆结石患者提早预防和治疗具有积极的临床意义。
5.目前中医药可改善胆道功能、控制感染、利胆排石等多种疗效，根据中医药辨证治疗，通常采用疏肝理气、清热利胆、通里排石等，方剂组成也通常以清热利湿利肝胆药金钱草、茵陈、木香、枳壳、大黄为主。但糖尿病性胆结石的发病机制存在一定特殊性，目前对糖尿病性胆结石研究甚少，相关的中药治疗方案报道也较少，如cn101095916 a公开了一种糖尿病性胆结石的中药制剂，以王不留行、地龙、浙贝母和枳实等10多味中草药为原料，具有活血散结，理气排石的功效。cn101095919 a公开了一种治疗糖尿病性胆结石的中成药，它是以柴胡、香附、炒栀子和延胡索等10多味中草药为原料。具有疏肝理气，散结止痛的功效。cn101543615a公开了一种治疗胆结石的中药组合物，含有茵陈、柴胡、金钱草、龙胆、赤芍、郁金、蒲黄、大黄、五灵脂、芒硝、甜菊素。因此，目前对于糖尿病性胆结石治疗更多的关注胆结石的治疗，忽视了糖尿病性胆结石自身特殊性。
6.另外在处方中加入大量苦寒之品，给长期用药带来副作用。其中黄柏、知母为常用的药对。黄柏，味苦、性寒，入肾、膀胱经，其功效有清热燥湿，泻火解毒，消肿祛腐。知母，味苦性甘而寒，入肺、胃、肾经，亦具泻火清热之功。两味合用，用量俱重。黄柏、知母皆属于中药苦寒药的范畴，然而在苦寒药的大量使用过程中，我国历代医药学家向来都很重视的“苦寒伤胃”这一不良反应往往不为现代人所重视，事实上临床上因过量或久用苦寒药引起患者纳呆、呕吐、脘痞、乏力等的报道屡见不鲜。《中药学》教材中：“黄柏苦寒，容易损伤胃气，故脾胃虚寒者忌用”。中医学中“苦寒伤胃”的“胃”通常包括肠胃。


技术实现要素：

7.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种滋阴清热中药组合物，其能够有效预防或治疗糖尿病性胆结石，并有效减少苦寒中药的副作用。
8.本发明的技术方案概述如下：
9.一种滋阴清热的中药组合物，按重量份数由下述原料制成：知母1
‑
50份，黄柏1
‑
50份、肉苁蓉1
‑
50份。
10.进一步优选，知母5
‑
45份，黄柏5
‑
45份、肉苁蓉5
‑
45份；
11.进一步优选，知母10
‑
40份，黄柏10
‑
40份、肉苁蓉10
‑
40份；
12.进一步优选，知母10
‑
30份，黄柏10
‑
30份、肉苁蓉10
‑
30份；
13.进一步优选，知母20份，黄柏20份、肉苁蓉20份；
14.或者其中知母的重量份优选3、5、7、9、10、15、20、25、30、35、40、45份。
15.或者其中黄柏的重量份优选3、5、7、9、10、15、20、25、30、35、40、45份。
16.或者其中肉苁蓉的重量份优选3、5、7、9、10、15、20、25、30、35、40、45份。
17.本发明的中药组合物的制备方法包括以下步骤：将各原料药粉碎后，加水或低级醇或低级醇和水的混合溶剂提取。
18.所述低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇中的一种或多种，更优选乙醇。
19.其进一步包括过滤、浓缩步骤，或进一步包括干燥的步骤。
20.本发明的中药组合物剂型选自散剂、汤剂、合剂、颗粒剂、胶囊、片剂、配方颗粒。
21.本发明还提供一种其制药用途，上述中药组合物在制备预防或者治疗糖尿病性胆结石药物中的应用，所述糖尿病为2型糖尿病。进一步优选，在提高糖尿病患者糖耐量的应用。
22.本发明进一步提供上述中药组合物在制备降低胆汁中总胆汁酸水平药物中的应用，如在糖尿病性胆结石患者中，优选在制备促进新的胆汁酸合成，减少肠道结合型胆汁酸及次级胆汁酸的重吸收药物中的应用。进一步优选在制备降低胆汁中结合型胆汁酸t
‑
β
‑
mca、thca、tcdca、thdca、tdca、tudca、tca和次级胆汁酸lca中一种或多种的药物中的应用。或者在制备提高初级胆汁酸α
‑
mca、β
‑
mca、ca、cdca中一种或多种药物中的应用。
23.本发明进一步提供上述中药组合物在制备提高肝脏中cyp7a1mrna、cyp7b1 mrna表达药物中应用，优选cyp7a1mrna。进一步优选在制备预防或者治疗肝脏中cyp7a1mrna、cyp7b1 mrna表达减少型的糖尿病性胆结石药物中的应用。进一步优选小肠fxr
‑
fgf15通路和肝脏fxr/shp/lrh
‑
1通路激活相关的糖尿病性胆结石药物中的应用。本发明中药组合物可通过调节机体胆汁酸水平抑制小肠fxr
‑
fgf15通路和肝脏fxr/shp/lrh
‑
1通路，减少对cyp7a1的负反馈调节。
24.本发明进一步提供上述中药组合物在制备减少肠黏膜损伤药物中的应用，进一步优选在制备减少肠末端黏膜肌层变薄，小肠绒毛萎缩、变短、脱落，纹状缘受损药物中的应用。
25.说明书附图：
26.图1本发明中药对糖尿病小鼠肝脏中胆汁酸合成酶mrna表达的影响
27.图2本发明中药对糖尿病小鼠小肠fxr
‑
fgf15通路的影响
28.图3本发明中药对糖尿病小鼠肝脏fxr/shp/lrh
‑
1通路的影响
29.图4本发明中药对糖尿病小鼠回肠组织病理形态学的影响
30.有益效果：
31.(1)本发明的中药组合物能够有效预防或治疗糖尿病性胆结石，能够降低糖尿病患者胆汁中总胆汁酸水平，能够有效促进新的胆汁酸合成，减少肠道结合型胆汁酸及次级胆汁酸的重吸收。
32.(2)本发明的中药组合物能够明显降低苦寒中药包括知母、黄柏对胃肠的损伤副作用，有效抑制肠末端黏膜肌层变薄，小肠绒毛萎缩、变短、脱落，纹状缘受损，杯状细胞减少，并促进杯状细胞增多，小肠绒毛变长、排列整齐。
33.(3)本发明的中药组合物组方简单有效，易于临床应用，大幅降低副作用，利于慢性疾病的长期服药，提高患者用药的依从性。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
35.实施例1
36.一种滋阴清热药物组合物，由下述原料制成：知母20份，黄柏20份、肉苁蓉20份。
37.制备方法为：
38.称取上述原料，按照1g：10ml的比例，向原料中加入体积浓度为80％的乙醇水溶液，加热回流，过滤，提取两次，每次2h，滤液合并，浓缩至1.5g/ml。
39.实施例2
40.一种滋阴清热药物组合物，由下述原料制成：知母10份，黄柏30份、肉苁蓉20份。
41.将上述原料粉碎，过80目筛，制成散剂。
42.实施例3
43.一种滋阴清热药物组合物，由下述原料制成：知母30份，黄柏15份，肉苁蓉5份。
44.称取上述原料，向原料中加入10倍量的水，加热回流，过滤，提取两次，每次1.5h，滤液合并，浓缩干燥，加入糊精制成颗粒剂。
45.实施例4
46.一种滋阴清热药物组合物，由下述原料制成：知母2份，黄柏10份、肉苁蓉20份。
47.称取上述原料，向原料中加入15倍量的水，加热回流，过滤，提取两次，每次2h，滤液合并，浓缩干燥，加入糊精制成颗粒，再加入润滑剂制成片剂。
48.实施例5
49.一种滋阴清热药物组合物，由下述原料制成：知母20份，黄柏3份、肉苁蓉30份。
50.称取上述原料，向原料中加入15倍量的水，加热回流，过滤，提取两次，每次2h，滤液合并，浓缩后，加入甜味剂制成合剂。
51.对比例1
52.组方：知母20份，黄柏20份。
53.制备方法为：
54.称取上述原料，按照1g：10ml的比例，向原料中加入体积浓度为80％的乙醇水溶液，加热回流，过滤，提取两次，每次2h，滤液合并，浓缩至1.5g/ml。
55.实验例1
56.小鼠口服糖耐量实验
57.正常组用普通饲料喂养，模型组用高脂饲料喂养，三周后腹腔注射链脲霉素(stz)建立糖尿病模型。stz需避光称取，并低温保存，小鼠注射前禁食12h，模型组按120mg/kg的剂量一次性腹腔注射stz。使用时将stz溶解于0.1mol/l、ph 4.5的柠檬酸
‑
柠檬酸钠缓冲液中配制成溶液。正常组在相同条件下仅注射等体积柠檬酸
‑
柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/l，ph 4.5)。一周后小鼠尾末取血检测空腹血糖值(fasting blood glucose,fbg)，fbg>11.1mmol/l者视为2型糖尿病模型小鼠，用于后续实验。本实验共分为3组：正常组、模型组、实施例1组，每组15只。正常组、模型组灌胃给予等量蒸馏水，实施例1组，给药剂量0.1ml/10g，每日一次，连续灌胃给药10周。
58.给药后期，所有小鼠禁食16h，每组小鼠测基础血糖(0min)，并灌胃给予葡萄糖(1g/kg)，分别在服糖后15、30、60、90、120min时尾末取血检测血糖，记录并计算血糖曲线下面积(auc)，以检测各组小鼠的葡萄糖耐量状况，结果如表1，2。
59.表1小鼠不同时间点血糖的影响
[0060][0061]
**与正常组比较：p<0.01
[0062]
表2对糖尿病小鼠ogtt auc的影响
[0063][0064]
**与正常组比较：p<0.01
[0065]
各组ogtt各时间点血糖结果显示：正常组、模型组小鼠在灌胃给予葡萄糖后血糖明显升高，15min后达到最高值，之后呈下降趋势，实施例1组小鼠血糖在30min达到最高，随后下降。与正常组相比，模型组小鼠在各个时间点的血糖显著升高(p<0.01)；与模型组相比，实施例1组在各个时间点的血糖值均有降低趋势。ogtt auc结果显示：与正常组相比，模型组小鼠ogtt auc显著升高(p<0.01)，与模型组相比，实施例1组小鼠ogtt auc有降低趋势。结果表明本发明中药组合物有提高糖尿病小鼠糖耐量的作用。
[0066]
实验例2
[0067]
小鼠胆汁酸代谢实验
[0068]
样本均来自实验例1中各组小鼠，采用液质联用技术(lc/ms)检测本发明对糖尿病小鼠胆汁中胆汁酸(bas)水平的影响。小鼠麻醉处死后取胆囊内胆汁，储存于
‑
80℃条件下备用。检测前取各胆汁样本10μl，加内标10μl及60μl乙腈涡旋15min后，14000g，10min低温
离心取上清，氮气吹干。100μl50％甲醇复溶，涡旋10min后，14000g，10min低温离心取上清进样。
[0069]
检测方法
[0070]
供试品溶液的制备
[0071]
内标溶液的配制：精密称取1mg d4
‑
ca，用50％甲醇配成浓度为50mg/ml的储备液，将储备液用水稀释成浓度为50μg/ml的溶液，用于测定生物样品中ba的含量。
[0072]
标准曲线的建立：将胆汁酸(bas)标准品配制成0.001、0.003、0.005、0.01、0.04、0.08、0.1、0.3、0.6、1、2.5、5μg/ml不同浓度的混标溶液，并各加内标10μl，按1.2.1.2项下质谱色谱条件测定，以bas色谱峰面积(y)对相应浓度(x)进行线性回归，求得胆汁酸回归方程：y＝ax+b，线性范围：0.001
‑
5μg/ml。
[0073]
质谱与色谱条件
[0074]
色谱条件：agilent hss t3 c18色谱柱，流动相为乙腈(a)—0.1％甲酸水溶液(d)，流速：0.4ml/min；柱温：55℃，进样量：2μl。梯度洗脱，0.～5min，5％～5％b；5～5.5min，5％～20％b；5.5～14min，20％～20％b；14～19min，20％～30％b；19～24min，30％～30％b；24～24.5min，30％～40％b；24.5～27.5min，40％～40％b；27.5～30.5min，40％～80％b。
[0075]
质谱条件：离子源参数esi；辅助气体流速：12l/min；鞘气体流速：55l/min；尾气流速：2l/min；喷雾电压：2.8kv；毛细管温度：320℃；辅助气体加热器温度：250℃；质量范围：100
‑
1500；负离子模式。
[0076]
表3对糖尿病小鼠胆汁中胆汁酸水平的影响
[0077]
[0078][0079]
*与正常组组比较：p<0.05，**与正常组组比较：p<0.01；
[0080]
#
与模型组组比较：p<0.05，
##
与模型组组比较：p<0.01
[0081]
各组小鼠胆汁中各类胆汁酸含量检测结果如表3所示：与正常组相比，模型组小鼠胆汁中总胆汁酸水平有升高趋势，其中初级胆汁酸和结合型胆汁酸含量均有升高趋势，次级胆汁酸和非结合型胆汁酸均显著降低(p<0.05或p<0.01)，各类胆汁酸分析结果显示模型组小鼠胆汁中t
‑
β
‑
mca、thdca、thca、lca、tca、tcdca含量均有升高趋势，其中lca、tca含量显著升高(p<0.05或p<0.01)，α
‑
mca、tdca、β
‑
mca、ca、cdca、tudca含量有降低趋势，其中α
‑
mca、β
‑
mca、ca、cdca、tudca含量显著降低(p<0.05或p<0.01)；与模型组相比，实施例1组小鼠胆汁中总胆汁酸含量显著降低(p<0.05)，其中初级胆汁酸和结合型胆汁酸显著降低(p<0.05)，次级胆汁酸有升高趋势，非结合型胆汁酸显著升高(p<0.05)，各类胆汁酸分析结果实施例1组小鼠胆汁中α
‑
mca、β
‑
mca、ca、cdca含量有升高趋势，其中β
‑
mca含量显著升高(p<0.01)，t
‑
β
‑
mca、thca、lca、tcdca、thdca、tdca、tudca、tca含量有降低趋势，其中t
‑
β
‑
mca、thca、lca、thdca含量显著降低(p<0.05)。
[0082]
结果表明：给予本发明中药组合物后，胆汁中总胆汁酸水平降低，初级胆汁酸α
‑
mca、β
‑
mca、ca、cdca含量升高，结合型胆汁酸t
‑
β
‑
mca、thca、tcdca、thdca、tdca、tudca、tca和次级胆汁酸lca含量降低，说明本发明中药组合物可通过促进新的胆汁酸合成，减少肠道结合型胆汁酸及次级胆汁酸的重吸收，来降低胆汁中总胆汁酸水平。
[0083]
实验例3
[0084]
回肠和肝脏中胆汁酸相关受体、酶及调控靶点mrna表达的影响
[0085]
本实验样本均来自实验例1中各组小鼠回肠和肝脏，rnastore保存液保存，储存于
‑
80℃条件下备用。采用rt
‑
pcr的方法检测本发明中药组合物对肝脏胆汁酸相关酶、调控靶点及受体mrna表达的影响
[0086]
本发明采用荧光定量pcr的方法检测了各组实验小鼠肝脏中胆汁酸合成酶mrna表
达水平，其中cyp7a1是经典途径的限速酶，cyp27a1、cyp7b1是替代途径的限速酶。实验结果如附图1所示，与正常组相比，模型组小鼠肝脏中cyp7a1 mrna表达有降低趋势、cyp27a1 mrna表达显著降低(p<0.01)，cyp7b1 mrna表达有增加趋势，表明模型小鼠新的胆汁酸合成减少；与模型相比，实施例1组小鼠肝脏中cyp7a1、cyp7b1 mrna表达有增加趋势，cyp27a1 mrna表达显著增加(p<0.05)，表明本发明中药组合物可通过促进胆汁酸合成酶的表达促进新的胆汁酸合成。
[0087]
本发明还采用荧光定量pcr的方法检测了调节cyp7a1表达的两条通路小肠fxr
‑
fgf15和肝脏fxr
‑
shp上相关靶点mrna的表达水平。结果如附图2、3所示，与正常组相比，模型组小鼠小肠fxr
‑
fgf15通路被激活，表明模型组小鼠肝脏中cyp7a1表达降低是受小肠fxr
‑
fgf15通路调节的；与模型组相比，实施例1组小肠fxr
‑
fgf15通路和肝脏fxr/shp/lrh
‑
1通路均未被激活。表明本发明中药组合物可通过调节机体胆汁酸水平抑制小肠fxr
‑
fgf15通路和肝脏fxr/shp/lrh
‑
1通路，减少对cyp7a1的负反馈调节。
[0088]
实验例4
[0089]
采用实验例1方法制备2型糖尿病模型小鼠，随机分为5组：模型组，知母黄柏(对比例1)组，通关丸组(由知母、黄柏和肉桂组成)，实施例1组，小檗碱组，每组15只。模型组及正常组给予等量蒸馏水，每日一次，连续灌胃给药10周。
[0090]
对糖尿病小鼠空腹血糖(fbg)的影响
[0091]
给药期间，每两周对小鼠进行空腹血糖监测。与正常组相比，模型组小鼠血糖显著升高(p<0.01)，与模型组相比，各给药组空腹血糖无明显变化(p>0.05)，与知柏组相比，小檗碱组的空腹血糖有降低趋势，无显著性差异(p>0.05)。实验结果表明，本发明中药对糖尿病小鼠空腹血糖无显著影响，小檗碱有降低空腹血糖趋势。如表4所示。
[0092]
表4对糖尿病小鼠空腹血糖的影响
[0093][0094]
*与正常组比较：p<0.05；**与正常组比较：p<0.01；
[0095]
对糖尿病小鼠回肠组织影响
[0096]
采用he染色检测回肠组织使用颈椎脱白法处死小鼠，按下述方法进行取材：先固定小鼠的四肢，用蒸馏水和酒精清洁并消毒小鼠腹部皮肤，修剪多余毛发，沿矢状线正中切开腹部，用手术剪将皮肤及腹肌逐层剪开，将完整回肠取出，用眼科剪沿肠系膜纵行剖开，并用冰0.9％nacl溶液冲洗干净，取回肠末端2cm(盲肠前4
‑
6cm)置入10％浓度甲醛溶液中固定。石蜡包埋，切片，苏木素－伊红(hematoxylin and eosin，he)染色，光学显微镜下观
察。
[0097]
如附图4所示，光镜下可见，回肠组织病理结果显示：正常组(con)回肠末端黏膜上皮完整，腺体排列整齐，其间散在分布杯状细胞，绒毛丰富，突入肠腔；模型组(mod)回肠末端黏膜肌层变薄，小肠绒毛萎缩、变短、脱落，纹状缘受损，杯状细胞减少，与正常组比较有明显差异；知柏组(zb)和通关丸组(tgw)较模型组黏膜肌层变薄，小肠绒毛变细、排列不整齐，纹状缘受损，杯状细胞缺失；与mod组、zb组和tgw相比，实施例1组对其损伤有显著的减轻作用，以杯状细胞增多，小肠绒毛变长、排列整齐为特点。
[0098]
选取4张切片，每张切片取5根最长且走向平直伸展良好的绒毛，应用imagej图像处理软件，测量其绒毛长度(villous length，从绒毛基底部到绒毛顶端的距离)、黏膜厚度(mucosal thickness)。结果如表5所示。
[0099]
与正常组相比，模型组和知柏组小鼠回肠绒毛长度均极显著降低(p＜0.01)，通关丸组显著降低(p＜0.05)，实施例1组无显著性差异；与模型组比较，知柏组、通关丸组、实施例1、小檗碱组均极显著升高(p＜0.01)，知柏组极显著降低(p＜0.01)；与知柏组比较，通关丸组、实施例1组、小檗碱组均极显著升高(p＜0.01)；与通关丸组比较，实施例1组极显著升高(p＜0.01)。
[0100]
与正常组相比，模型组、知柏组、通关丸组、小檗碱组小鼠回肠黏膜厚度均极显著降低(p＜0.01)，实施例1组无显著性差异；与模型组比较，知柏组、通关丸组、实施例1组均极显著降低(p＜0.01)；与知柏组比较，实施例1组极显著升高(p＜0.01)；与通关丸组比较，实施例1组极显著升高(p＜0.01)。
[0101]
表5小鼠回肠的黏膜厚度、绒毛长度的变化(单位：μm)
[0102][0103]
因此，本发明中药组合物能显著减轻知母黄柏等苦寒药对胃肠损伤副作用。