一种用于抑制多药耐药细菌的克拉维酸和氨曲南的组合物及其应用

1.本发明涉及抑制多药耐药细菌感染技术领域，特别涉及一种用于抑制多药耐药细菌的克拉维酸和氨曲南的组合物及其应用的技术领域。


背景技术：

2.目前，多药耐药(multidrug resistance，mdr)的细菌感染，尤其是mdr革兰阴性细菌感染，已经成为全球公共健康最大的威胁之一。由于对抗生素的不合理使用,使得大多数细菌对现有的抗生素产生了严重的抗药性。
3.在所有多药耐药菌中又以带有金属β
‑
内酰胺酶(metalβ
‑
lactamase，mbl)的耐碳青霉烯肠杆菌(carbapenem
‑
resistant enterobacter，cre)威胁最大，其对大多数可用抗生素也表现出抗药性，严重威胁公众健康。
4.这种金属β
‑
内酰胺酶又名新德里金属β
‑
内酰胺酶(new delhi metallo
‑
β
‑
lactamase，ndmβ
‑
lactamase)，其对大多数抗菌药物，包括β
‑
内酰胺类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、大环内酯类和喹诺酮类等抗菌药物具有广泛耐药性，是一种超级细菌，目前临床上难以找到有效的治疗措施，因而病死率很高。
5.因此，研发新型有效的广谱抗生素，或从现有抗生素中筛选出具有协同作用的组合物用于抑制多药耐药细菌感染，是目前抑制多药耐药细菌感染技术领域需要解决的技术问题。


技术实现要素：

6.本发明针对上述技术问题，提出一种用于抑制多药耐药细菌的克拉维酸和氨曲南的组合物及其应用。
7.本发明采用技术方案为：一种用于抑制多药耐药细菌的克拉维酸和氨曲南的组合物，包括：克拉维酸或其药学上可接受的盐和氨曲南。
8.在上述方案的基础上，所述克拉维酸与氨曲南的质量比为1:1
‑
4或2
‑
4:1。
9.一种用于抑制多药耐药细菌的杀菌剂，其有效成分包括上述所述的用于抑制多药耐药细菌的克拉维酸和氨曲南的组合物。
10.在上述方案的基础上，所述用于抑制多药耐药细菌的杀菌剂为水分散粒剂、可湿性粉剂、水乳剂、微乳剂、悬浮剂或复方注射剂。
11.一种用于抑制多药耐药细菌的克拉维酸和氨曲南的组合物的应用，所述用于抑制多药耐药细菌的克拉维酸和氨曲南的组合物用于抑制多药耐药的细菌感染。
12.在上述方案的基础上，所述用于抑制多药耐药细菌的克拉维酸和氨曲南的组合物用于抑制多药耐药的革兰阴性细菌感染。
13.在上述方案的基础上，所述用于抑制多药耐药细菌的克拉维酸和氨曲南的组合物用于抑制肺炎克雷伯菌和大肠杆菌菌感染。
14.本发明实施例提供的一种用于抑制多药耐药细菌的克拉维酸和氨曲南的组合物及其应用，具有以下有益效果：本发明设计的克拉维酸和氨曲南的组合物，两者联合使用对肺炎克雷伯菌和大肠杆菌等耐药菌具有显著的协同作用，并且能够将体外mic降低到临床折点以下，可以充分证明合用克拉维酸和氨曲南对感染此类多药耐药菌的病人具有较高的临床治疗可能性。
附图说明
15.图1为棋盘法测定氨曲南和克拉维酸单独和联合使用的mic。
具体实施方式
16.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
17.为了解决上述背景技术中存在的技术问题，针对目前市面上缺乏有效的方式针对多药耐药的革兰阴性细菌感染，发明人筛选了多种抗生素组合物的联合使用测定其对已知基因型的多药耐药细菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，mic)，发现克拉维酸和氨曲南联合使用对这些耐药菌具有显著的协同作用，并且能够将体外mic降低到临床折点以下，可以充分证明合用克拉维酸和氨曲南对感染此类多药耐药菌的病人具有较高的临床治疗可能性。
18.下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
19.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
20.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
21.实施例1、筛选具有耐药基因型的试验菌株。
22.从青岛大学附属医院收集肺炎克雷伯菌和大肠杆菌菌株，通过二代测序确定各菌株的β
‑
内酰胺酶基因类型，从测得的菌株中挑选了β
‑
内酰胺酶编码基因中含有ndm耐药基因的9株肺炎克雷伯菌和8株大肠杆菌菌株，将所筛选菌株作为后续用于进行药物活性筛选的试验菌株，具体的编码β
‑
内酰胺酶的基因型如表1。
23.需要说明的是，本次筛选的试验菌株为利用常规筛选方法筛选的常规菌株，其目的主要用于后续的药物活性筛选对比试验，根据本实施例中的筛选方法从菌株来源地青岛大学附属医院可实现菌株筛选结果的重复性。
24.具体的，所述菌株挑选方式为通过dna纯化试剂盒(promega)进行常规筛选，具体方式如下：
25.使用dna纯化试剂盒(promega)提取不同菌株分离株的dna，将提取的dna用illumina miseq测序仪进行测序，采用soapdenovo2对合格的测序结果进行组装，并进一步用basic local alignment search tool(balst)与所有已知的β
‑
内酰胺酶基因进行比较，以确定每个研究菌株的β
‑
内酰胺酶编码基因的类型。从测得的菌株中挑选了β
‑
内酰胺酶编码基因中含有ndm耐药基因的9株肺炎克雷伯菌和8株大肠杆菌菌株，用于进行下述抑菌活性筛选实验。
26.表1：肺炎克雷伯菌和大肠杆菌菌株中编码β
‑
内酰胺酶的基因型
[0027][0028]
实施例2、测定目前市面上常用的抗生素组合物对上述cre的杀菌活性
[0029]
首先根据美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute)指南使用棋盘法通过微量肉汤稀释法，测定目前市面上常用的抗生素组合物对上述挑选后的9株肺炎克雷伯菌和8株大肠杆菌菌株的抑菌活性。
[0030]
试验方法如下：选取阿莫西林/克拉维酸(质量比为2：1)、氨苄西林/舒巴坦(质量比为2:1)、头孢哌酮/舒巴坦(质量比为1:1)、哌拉西林/他唑巴坦(质量比为8:1)常规使用的抗生素组合物，分别倍比稀释后，将倍比稀释后不同浓度的抗生素组合物以浓度由低到高从左向右加入96孔板，每孔加入药物100μl，第一列至第十列的抗生素组合物最终浓度分
别是0,0.25,0.5，1,2,4，8,16，32，64μg/ml。第十一列加入200μl肉汤作为阴性对照，无菌条件下保存备用。
[0031]
通过浊度计测定上述cre的菌浓度，将菌液稀释后向每一行96孔板中加入一种上述菌株，每孔加入的菌液量为100μl，使最终的菌浓度为5
×
105cfu/ml，第十二列加入200μl菌液作为阳性对照，将该板在37℃下孵育20小时。最终结果判断在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为mic。当阳性对照孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。
[0032]
最终结果证实，本试验选择的用于药物活性筛选的9株肺炎克雷伯菌和8株大肠杆菌菌株，其均具有很强的耐药性；同时，也反应了，目前市面上广泛使用的抗生素组合物对这些cre均产生了耐药性(体外mic均≥32μg/ml)。
[0033]
需要解释的是，抗碳青霉烯类肠杆菌属(cre)实际上是一组肠道杆菌，其中包含70多种细菌。此类细菌之所以被称为“超级细菌”，是因为它对于很多新的抗生素都有耐药性，感染者死亡率非常高。肺炎克雷伯菌和大肠杆菌均属于cre，是临床比较常见的致病菌。
[0034]
实施例3、测定克拉维酸和氨曲南单独和联合使用的体外杀菌活性。
[0035]
根据美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute)指南使用棋盘法通过微量肉汤稀释法，测定克拉维酸和氨曲南单独和联合使用的体外最小抑菌浓度。
[0036]
试验方法如下：将倍比稀释后不同浓度的氨曲南浓度由低到高从左向右加入96孔板，每孔加入药物50μl，第一列至第十列的氨曲南最终浓度分别是0,0.25,0.5，1,2,4，8,16，32，64μg/ml。将倍比稀释后不同浓度的克拉维酸浓度由低到高从左向右加入96孔板，每孔加入药物50μl，第一行至第八行的克拉维酸最终浓度分别是0,0.25,0.5，1,2,4，8,16，32μg/ml。第十一列加入200μl肉汤作为阴性对照，无菌条件下保存备用。
[0037]
通过浊度计测定上述cre的菌浓度，将菌液(9株肺炎克雷伯菌和8株大肠杆菌)稀释后向每一个96孔板中分别加入一种cre，每孔加入的菌液量为50μl，使最终的菌浓度为5
×
105cfu/ml，第十二列加入200μl菌液作为阳性对照，将该板在37℃下孵育20小时。最终结果判断在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为mic。当阳性对照孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。
[0038]
根据棋盘法(图1)的结果确定每种分离物单独或组合使用的抗菌药物的mic，如图1所示深色代表浑浊的肉汤，白色代表澄清的肉汤，第一行澄清肉汤中氨曲南的浓度记为单独使用氨曲南的mic，第一列澄清肉汤中克拉维酸的浓度记为单独使用克拉维酸的mic，全部浑浊则标记mic>所用抗生素最大浓度。交界处澄清肉汤中抗生素的浓度记为联合使用两种抗生素的mic，尽可能的使两种抗生素mic都低于其折点为最优配比浓度(无细菌生长的最低药物浓度为mic)。
[0039]
计算每种菌株的分级抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，fici)用于对组合的抗菌协同作用进行分类。分级抑菌浓度指数的计算方式为：fici＝mic(氨曲南联合使用)/mic(氨曲南单独使用)+mic(克拉维酸联合使用)/mic(克拉维酸单独使用)。表2和表3是氨曲南和克拉维酸单独和联合使用时候对多药耐药的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌的最优配比的mic结果。
[0040]
表2:氨曲南和克拉维酸对于肺炎克雷伯菌单独或者联合使用的最低抑菌浓度和
分级抑制浓度指数
[0041][0042]
表3:氨曲南和克拉维酸(ca)对于大肠杆菌单独或者联合使用的最低抑菌浓度和分级抑制浓度指数
[0043][0044]
由上述实施例2的实验结果可知，对于含有ndm耐药基因的多药耐药的肺炎克雷伯杆菌和大肠杆菌，对现在市面上已经在售的绝大多数抗生素和抗生素组合物已经产生严重耐药性，当病人感染上这类“超级细菌”的时候将会导致病人出现无药可用的窘境，严重危害病人的身体健康。
[0045]
通过上述实施例3的实验证实，克拉维酸和氨曲南单独使用时对此类耐药菌也均无杀菌活性，但是将克拉维酸和氨曲南联合使用对大多数的肺炎克雷伯菌(77.8％，即：9株肺炎克雷伯杆菌中有7株fici小于0.05)和大肠杆菌(87.5％，即：8株大肠杆菌中有7株fici小于0.05)有显著协同作用，并且能够将克拉维酸和氨曲南的体外mic降低到临床折点的敏感浓度以下。
[0046]
需要强调的是，体外试验敏感和耐药的标准，是由所谓的折点(breakpoints)来界定的，折点是指具体的mic值，是根据mic的频度、细菌耐药的机制、抗菌药物的药动学和药效学、临床的相关性作出的，clsi不断根据临床的资料更新折点的界定，简而言之，体外试验的敏感表明推荐的抗菌药物可以使用，可能达到临床效果；中介，意味着这个范围的抗菌药物在常规剂量下疗效不理想，高浓度下可能有效；耐药，意味着此种情况下抗菌药物不能用于此菌株的治疗。
[0047]
在我们的实验中我们证明了上述cre对单独的克拉维酸和氨曲南都是耐药的，临
床上已经不推荐尝试使用，但是联合使用的克拉维酸和氨曲南会使极大比例的cre的体外mic降低到临床折点以下，这充分证明氨曲南和克拉维酸联合可以消除上述cre的对这两种抗生素合剂的耐药性，有极大概率达到临床治疗效果。
[0048]
目前，肺炎克雷伯杆菌和大肠杆菌是造成医院内病人感染比例最高的两种革兰氏阴性菌，含有dnm耐药基因的更是因为对多种抗生素产生了耐药性而被称为超级耐药菌，目前市面上急需能够解决此类问题的治疗方法。克拉维酸和氨曲南合用组合物将有着广泛的应用前景。
[0049]
对比例1：将克拉维酸替换为舒巴坦，测定舒巴坦和氨曲南单独和联合使用的体外杀菌活性。
[0050]
根据美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute)指南使用棋盘法通过微量肉汤稀释法，测定舒巴坦和氨曲南单独和联合使用的体外最小抑菌浓度。
[0051]
试验方法如下：将倍比稀释后不同浓度的氨曲南浓度由低到高从左向右加入96孔板，每孔加入药物50μl，第一列至第十列的氨曲南最终浓度分别是0,0.25,0.5，1,2,4，8,16，32，64μg/ml。将倍比稀释后不同浓度的舒巴坦浓度由低到高从左向右加入96孔板，每孔加入药物50μl，第一行至第八行的舒巴坦最终浓度分别是0,0.25,0.5，1,2,4，8,16，32μg/ml。第十一列加入200μl肉汤作为阴性对照，无菌条件下保存备用。
[0052]
通过浊度计测定上述cre的菌浓度，将菌液(9株肺炎克雷伯菌和8株大肠杆菌)稀释后向每一个96孔板中分别加入一种cre，每孔加入的菌液量为50μl，使最终的菌浓度为5
×
105cfu/ml，第十二列加入200μl菌液作为阳性对照，将该板在37℃下孵育20小时。最终结果判断在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为mic。当阳性对照孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。
[0053]
根据棋盘法的结果确定每种分离物单独或组合使用的抗菌药物的mic，并计算每种菌株的分级抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，fici)用于对组合的抗菌协同作用进行分类。分级抑菌浓度指数的计算方式为：fici＝mic(氨曲南联合使用)/mic(氨曲南单独使用)+mic(舒巴坦联合使用)/mic(舒巴坦单独使用)。表4和表5是氨曲南和舒巴坦单独和联合使用时候对多药耐药的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌的最优配比的mic结果。
[0054]
表4:氨曲南和舒巴坦对于肺炎克雷伯菌单独或者联合使用的最低抑菌浓度和分级抑制浓度指数
[0055][0056]
表5:氨曲南和舒巴坦对于大肠杆菌单独或者联合使用的最低抑菌浓度和分级抑制浓度指数
[0057][0058]
对比例2：将克拉维酸替换为他唑巴坦，测定他唑巴坦和氨曲南单独和联合使用的体外杀菌活性。
[0059]
根据美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute)指南使用棋盘法通过微量肉汤稀释法，测定他唑巴坦和氨曲南单独和联合使用的体外最小抑菌浓度。
[0060]
试验方法如下：将倍比稀释后不同浓度的氨曲南浓度由低到高从左向右加入96孔板，每孔加入药物50μl，第一列至第十列的氨曲南最终浓度分别是0,0.25,0.5，1,2,4，8,16，32，64μg/ml。将倍比稀释后不同浓度的他唑巴坦浓度由低到高从左向右加入96孔板，每孔加入药物50μl，第一行至第八行的他唑巴坦最终浓度分别是0,0.25,0.5，1,2,4，8,16，32μg/ml。第十一列加入200μl肉汤作为阴性对照，无菌条件下保存备用。
[0061]
通过浊度计测定上述cre的菌浓度，将菌液(9株肺炎克雷伯菌和8株大肠杆菌)稀释后向每一个96孔板中分别加入一种cre，每孔加入的菌液量为50μl，使最终的菌浓度为5
×
105cfu/ml，第十二列加入200μl菌液作为阳性对照，将该板在37℃下孵育20小时。最终结果判断在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为mic。当阳性对照孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。
[0062]
根据棋盘法的结果确定每种分离物单独或组合使用的抗菌药物的mic，并计算每种菌株的分级抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，fici)用于
对组合的抗菌协同作用进行分类。分级抑菌浓度指数的计算方式为：fici＝mic(氨曲南联合使用)/mic(氨曲南单独使用)+mic(他唑巴坦联合使用)/mic(他唑巴坦单独使用)。表6和表7是氨曲南和他唑巴坦单独和联合使用时候对多药耐药的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌的最优配比的mic结果。
[0063]
表6:氨曲南和他唑巴坦对于肺炎克雷伯菌单独或者联合使用的最低抑菌浓度和分级抑制浓度指数
[0064][0065][0066]
表7:氨曲南和他唑巴坦对于大肠杆菌单独或者联合使用的最低抑菌浓度和分级抑制浓度指数
[0067][0068][0069]
对比例3：将氨曲南替换为头孢他啶，测定克拉维酸和头孢他啶单独和联合使用的体外杀菌活性。
[0070]
根据美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute)指南使用棋盘法通过微量肉汤稀释法，测定克拉维酸和头孢他啶单独和联合使用的体外最小抑菌浓度。
[0071]
试验方法如下：将倍比稀释后不同浓度的头孢他啶浓度由低到高从左向右加入96孔板，每孔加入药物50μl，第一列至第十列的头孢他啶最终浓度分别是0,0.25,0.5，1,2,4，8,16，32，64μg/ml。将倍比稀释后不同浓度的克拉维酸浓度由低到高从左向右加入96孔板，每孔加入药物50μl，第一行至第八行的克拉维酸最终浓度分别是0,0.25,0.5，1,2,4，8,16，32μg/ml。第十一列加入200μl肉汤作为阴性对照，无菌条件下保存备用。
[0072]
通过浊度计测定上述cre的菌浓度，将菌液(9株肺炎克雷伯菌和8株大肠杆菌)稀释后向每一个96孔板中分别加入一种cre，每孔加入的菌液量为50μl，使最终的菌浓度为5
×
105cfu/ml，第十二列加入200μl菌液作为阳性对照，将该板在37℃下孵育20小时。最终结果判断在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为mic。当阳性对照孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。
[0073]
根据棋盘法的结果确定每种分离物单独或组合使用的抗菌药物的mic，并计算每种菌株的分级抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，fici)用于
对组合的抗菌协同作用进行分类。分级抑菌浓度指数的计算方式为：fici＝mic(头孢他啶联合使用)/mic(头孢他啶单独使用)+mic(克拉维酸联合使用)/mic(克拉维酸单独使用)。表8和表9是头孢他啶和克拉维酸单独和联合使用时候对多药耐药的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌的最优配比的mic结果。
[0074]
表8:头孢他啶和克拉维酸对于肺炎克雷伯菌单独或者联合使用的最低抑菌浓度和分级抑制浓度指数
[0075][0076]
表9:头孢他啶和克拉维酸对于大肠杆菌单独或者联合使用的最低抑菌浓度和分级抑制浓度指数
[0077][0078]
需要说明的是，对比实验中，还依次将氨曲南替换为哌拉西林，氨苄西林，头孢哌酮和克拉维酸联合使用，结果皆与对比例3类似，全无协同作用。
[0079]
本发明实施例提供的一种用于抑制多药耐药细菌的克拉维酸和氨曲南的组合物及其应用，其作用机制如下：氨曲南为一种单酰胺环类的新型β
‑
内酰胺抗生素。氨曲南相对于传统的β
‑
内酰胺类抗生素对细菌产生的质粒介导和大部分染色体介导的β
‑
内酰胺酶高度稳定，因而许多耐药菌对本品仍呈敏感。但是，在实际临床应用中我们发现越来越多的超级细菌对氨曲南也产生了耐药性，如上述实验中的ndm超级细菌。
[0080]
克拉维酸为广谱β
‑
内酰胺酶抑制剂，本身仅有微弱的抗菌活性，但对各种β
‑
内酰胺酶有强抑制作用，可与大多数的β
‑
内酰胺酶牢固结合，生成不可逆的结合物，从而使β
‑
内酰胺类抗生素免遭酶的破坏，增强抗菌活性并扩展抗菌谱。与青霉素类及头孢菌素类药物合用，可大大减少这些药物的剂量。
[0081]
将β
‑
内酰胺酶抑制剂和β
‑
内酰胺抗生素合用是对抗一些产生β
‑
内酰胺酶的病原菌的重要方式。β
‑
内酰胺酶抑制剂通过和β
‑
内酰胺酶结合或者竞争性抑制使细菌产生的β
‑
内酰胺酶失去活性，进而使其失去对β
‑
内酰胺抗生素的耐药性。
[0082]
但是，为了针对此类ndm超级细菌，我们尝试筛选了其他大量的抗生素组合，最终发现其他组合全部无效。如：我们也尝试试用了对β
‑
内酰胺酶高度稳定的氨曲南和其他类似舒巴坦，他唑巴坦合用，以及将氨曲南替换为头孢他啶，发现并没有产生氨曲南和克拉维
酸合用的显著效果，而克拉维酸和阿莫西林等传统的β
‑
内酰胺类抗生素合用也无法对其产生作用。因此，将氨曲南和克拉维酸联合使用，用于对抗此类细菌的显著作用也是发明人通过大量试验，且在付出创造性劳动的基础上得到的试验结果。
[0083]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。