1.本发明涉及医药食品技术领域，具体涉及一种黑果腺肋花楸果总酚酸的制备方法。
背景技术：
2.黑果腺肋花楸，又名野樱莓，不老莓，是集食用、药用、园林和生态价值于一身的蔷薇科落叶灌木，其果实甜酸略有微涩味，球形，果皮紫黑色，果肉暗红色。黑果腺肋花楸果实富含大量营养物质，如膳食纤维、糖类、蛋白质、多酚类化合物等，多酚类化合物是已知植物中含量最高的，多酚类化合物如酚酸、原花青素、花青素、黄酮醇等含量丰富，且与黑果腺肋花楸果的生物活性密切相关。
技术实现要素：
3.本发明的目的在于一种黑果腺肋花楸果总酚酸的制备方法。
4.黑果腺肋花楸果总酚酸的制备方法，其特征在于以黑果腺肋花楸果为原料，经过脱脂、浸泡提取、联合除杂、萃取、纯化、浓缩干燥等步骤制备含量大于60%的黑果腺肋花楸果总酚酸粉末。
5.一种黑果腺肋花楸果总酚酸的制备方法，包括以下步骤：（1）脱脂：将干燥的黑果腺肋花楸果粉碎至8～12目，按照固液比（g：ml）1:3加入沸程为60℃～90℃的石油醚，室温浸泡24小时，过滤，滤渣于60℃～65℃干燥12小时，得脱脂果粉；（2）浸泡提取：将苹果酸、蔗糖按质量比1:1混合，制备低共熔溶剂，然后加入适量脱脂果粉，再加入低共熔溶剂质量30%的蒸馏水和脱脂果粉质量0.5%的果胶酶，搅拌均匀，室温浸泡12小时，离心，得到浸泡液与残渣，浸泡液反复过d101大孔树脂柱充分吸附，直至流出液中检测不到总酚酸，流出的低共熔溶剂回收重复利用，先用1倍柱体积的蒸馏水洗脱树脂柱，将低共熔溶剂洗脱干净，然后再用3倍柱体积的60%乙醇水溶液洗脱树脂柱，收集60%乙醇洗脱液，备用；将残渣加到圆底烧瓶中，按固液比（g:ml）1:5～1:7加入60%乙醇水溶液，搅拌均匀，在超声功率450w、温度70℃条件下处理25分钟，水浴升温至90℃灭酶30秒，过滤，得到滤液，将滤液与浸泡液合并得到黑果腺肋花楸果提取液；（3）联合除杂：将黑果腺肋花楸果提取液采用减压浓缩方式浓缩至每1ml相当于脱脂果粉0.3g的浓缩液，在浓缩液中按照质量体积比（g: l）10:1～30:1加入壳聚糖与明胶（质量比为2:1）组成的复合絮凝剂，80℃加热处理1小时，离心，离心液中加入3倍量无水乙醇，搅拌均匀，放置12小时，离心，得到黑果腺肋花楸果总酚酸离心液；（4）萃取：离心液采用减压浓缩方式浓缩至每1ml相当于脱脂果粉0.5g的流浸膏，加入流浸膏等质量的纤维素粉末，搅拌均匀，于真空干燥箱中60℃干燥2小时，粉碎，然后加入3倍量60%乙醇萃取2次，合并萃取液，得到黑果腺肋花楸果总酚酸萃取液；（5）纯化：将黑果腺肋花楸果总酚酸萃取液用旋转蒸发仪浓缩至原体积的40%，得
到上柱液，将上柱液加入到d101树脂柱中吸附，先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，然后用3倍柱体积60%乙醇水溶液洗脱，收集60%乙醇水溶液洗脱液，洗脱液用旋转蒸发仪浓缩至相对密度为1.12～1.20g/ml(60℃)的流浸膏，经60℃真空减压干燥，得黑果腺肋花楸果总酚酸粉末，经福林酚
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碳酸钠显色法测定其总酚酸含量，其总酚酸含量大于50%。
6.在本发明的一个优选实施例中，所述浸泡提取步骤中，所用的浸泡溶剂为含水量30%的由苹果酸、蔗糖组成的低共熔溶剂，而且浸泡时加入了果胶酶，低共熔溶剂采用d101大孔树脂吸附回收重复利用；提取时提取方式为超声提取，提取溶剂为60%乙醇水溶液，并且明确了超声提取的条件为超声功率450w、超声温度70℃、超声时间25分钟；所述联合除杂步骤中，采用了复合絮凝剂与醇沉相联合的方式，复合絮凝剂由壳聚糖与明胶按质量比为2:1所组成，复合絮凝剂的使用条件为80℃加热处理1小时；所述萃取步骤中，采用了先将黑果腺肋花楸果总酚酸流浸膏与纤维素粉末混合并干燥，得到含有黑果腺肋花楸果总酚酸的纤维素粉末，然后再用3倍量60%乙醇萃取2次，得到黑果腺肋花楸果总酚酸萃取液；所述纯化步骤中，采用了d101大孔树脂动态吸附与洗脱的方式，所用的洗脱液为60%乙醇水溶液，干燥方式为真空干燥，所得黑果腺肋花楸果总酚酸粉末的总酚酸含量大于50%。
7.下面结合实例进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
8.实施例1：一种黑果腺肋花楸果总酚酸的制备方法，包括以下步骤：（1）脱脂：将干燥的黑果腺肋花楸果粉碎至8～12目，按照固液比（g：ml）1:3加入沸程为60℃～90℃的石油醚，室温浸泡24小时，过滤，滤渣于60℃干燥12小时，得脱脂果粉；（2）浸泡提取：将苹果酸、蔗糖按质量比1:1混合，制备低共熔溶剂500g，然后加入50g脱脂果粉，再加入150ml蒸馏水和脱脂果粉质量0.25g的果胶酶，搅拌均匀，室温浸泡12小时，离心，得到浸泡液与残渣，浸泡液反复过250gd101大孔树脂柱充分吸附，直至流出液中检测不到总酚酸，流出的低共熔溶剂回收重复利用，先用1倍柱体积的蒸馏水洗脱树脂柱，将低共熔溶剂洗脱干净，然后用800ml60%乙醇水溶液洗脱树脂柱，收集60%乙醇洗脱液，备用；将残渣加到圆底烧瓶中，按固液比（g:ml）1:6加入300ml60%乙醇水溶液，搅拌均匀，在超声功率450w、温度70℃条件下处理25分钟，水浴升温至90℃灭酶30秒，过滤，得到滤液，将滤液与浸泡液合并得到黑果腺肋花楸果提取液；（3）联合除杂：将黑果腺肋花楸果提取液采用减压浓缩方式浓缩至每1ml相当于脱脂果粉0.3g的浓缩液169ml，在浓缩液中加入壳聚糖与明胶（质量比为2:1）组成的复合絮凝剂3.38g，搅拌均匀，80℃加热处理1小时，离心，离心液中加入3倍量无水乙醇，搅拌均匀，放置12小时，离心，得到黑果腺肋花楸果总酚酸离心液；（4）萃取：离心液采用减压浓缩方式浓缩至每1ml相当于脱脂果粉0.5g的流浸膏，加入流浸膏等质量的纤维素粉末，搅拌均匀，于真空干燥箱中60℃干燥2小时，粉碎，然后加入3倍量60%乙醇萃取2次，合并萃取液，得到黑果腺肋花楸果总酚酸萃取液；（5）纯化：将黑果腺肋花楸果总酚酸萃取液用旋转蒸发仪浓缩至原体积的40%，得到上柱液270ml，将上柱液加入到d101树脂柱中吸附，先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，然后用3倍柱体积60%乙醇水溶液洗脱，收集60%乙醇水溶液洗脱液，洗脱液用旋转蒸发仪浓缩至相对密度为1.12～1.20g/ml(60℃)的流浸膏，经60℃真空减压干燥，得黑果腺肋花楸果总酚酸粉末，经福林酚
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碳酸钠显色法测定其总酚酸含量，其总酚酸含量63.63%。
9.实施例2：一种黑果腺肋花楸果总酚酸的制备方法，包括以下步骤：（1）脱脂：将干燥的黑果腺肋花楸果粉碎至8～12目，按照固液比（g：ml）1:3加入沸程为60℃～90℃的石油醚，室温浸泡24小时，过滤，滤渣于65℃干燥12小时，得脱脂果粉；（2）浸泡提取：将苹果酸、蔗糖按质量比1:1混合，制备低共熔溶剂500g，然后加入50g脱脂果粉，再加入150ml蒸馏水和脱脂果粉质量0.25g的果胶酶，搅拌均匀，室温浸泡24小时，离心，得到浸泡液与残渣，浸泡液反复过250gd101大孔树脂柱充分吸附，直至流出液中检测不到总酚酸，流出的低共熔溶剂回收重复利用，先用1倍柱体积的蒸馏水洗脱树脂柱，将低共熔溶剂洗脱干净，然后用800ml60%乙醇水溶液洗脱树脂柱，收集60%乙醇洗脱液，备用；将残渣加到圆底烧瓶中，按固液比（g:ml）1:7加入350ml60%乙醇水溶液，搅拌均匀，在超声功率450w、温度70℃条件下处理25分钟，水浴升温至90℃灭酶30秒，过滤，得到滤液，将滤液与浸泡液合并得到黑果腺肋花楸果提取液；（3）联合除杂：将黑果腺肋花楸果提取液采用减压浓缩方式浓缩至每1ml相当于脱脂果粉0.3g的浓缩液169ml，在浓缩液中加入壳聚糖与明胶（质量比为2:1）组成的复合絮凝剂3.38g，搅拌均匀，80℃加热处理1小时，离心，离心液中加入3倍量无水乙醇，搅拌均匀，放置12小时，离心，得到黑果腺肋花楸果总酚酸离心液；（4）萃取：离心液采用减压浓缩方式浓缩至每1ml相当于脱脂果粉0.5g的流浸膏，加入流浸膏等质量的纤维素粉末，搅拌均匀，于真空干燥箱中60℃干燥2小时，粉碎，然后加入3倍量60%乙醇萃取2次，合并萃取液，得到黑果腺肋花楸果总酚酸萃取液；（5）纯化：将黑果腺肋花楸果总酚酸萃取液用旋转蒸发仪浓缩至原体积的40%，得到上柱液270ml，将上柱液加入到d101树脂柱中吸附，先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，然后用2倍柱体积60%乙醇水溶液洗脱，收集60%乙醇水溶液洗脱液，洗脱液用旋转蒸发仪浓缩至相对密度为1.12～1.20g/ml(60℃)的流浸膏，经60℃真空减压干燥，得黑果腺肋花楸果总酚酸粉末，经福林酚
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碳酸钠显色法测定其总酚酸含量，其总酚酸含量62.48%。
10.通过单因素试验，以黑果腺肋花楸果总酚酸提取率为指标，分别考察低共熔溶剂含水量、低共熔溶剂用量、浸泡时间对浸泡提取效果的影响，以黑果腺肋花楸果总酚酸粉末中的总酚酸含量为指标，分别考察树脂纯化时洗脱液乙醇体积分数、树脂纯化时洗脱液的用量对黑果腺肋花楸果总酚酸粉末中的总酚酸含量的影响。
11.低共熔溶剂含水量对黑果腺肋花楸果总酚酸提取率的影响取黑果腺肋花楸果脱脂果粉10g，共5份，加入到圆底烧瓶中，分别加入10倍量含水量分别为0%、10%、30%、50%、70%、90%的低共熔溶剂（由苹果酸、蔗糖按照质量比1:1组成），混合均匀，室温浸泡12小时，离心，得到浸泡液并定容，吸取上述浸泡液适量，按照含量测定方法测定吸光度值，通过标准曲线计算出提取液中总酚酸的浓度，计算提取率，由实验结果可知总酚酸的提取率分别为27.55mg/g、48.14mg/g、63.75mg/g、54.18mg/g、50.14mg/g、42.68mg/g，低共熔溶剂的含水量为30%时总酚酸的提取率最好，所以选择含水量为30%进行后续试验。
12.低共熔溶剂用量对黑果腺肋花楸果总酚酸提取率的影响取黑果腺肋花楸果脱脂果粉10g，共5份，加入到圆底烧瓶中，分别按料液比（g:ml）1:5、1:10、1:20、1:30、1:40加入含水量为30%的低共熔溶剂（由苹果酸、蔗糖按照质量比1:1组成），混合均匀，室温浸泡12小时，离心，得到浸泡液并定容，吸取上述浸泡液适量，按照含量测定方法测定吸光度值，通过标准曲线计算出提取液中总酚酸的浓度，计算提取率，由实验结果可知总酚酸的提取率分
别为31.66mg/g、64.07mg/g、64.04mg/g、63.59mg/g、64.62mg/g，黑果腺肋花楸果脱脂果粉与低共熔溶剂的质量体积比1:10时总酚酸的提取率达到了较高水平，继续增加质量体积比总酚酸的提取率增加幅度很小，所以选择料液比1:10（g:ml）进行后续试验。
13.低共熔溶剂浸泡时间对黑果腺肋花楸果总酚酸提取率的影响取黑果腺肋花楸果脱脂果粉10g，共5份，加入到圆底烧瓶中，加入10倍量含水量为10%的低共熔溶剂（由苹果酸、蔗糖按照质量比1:1组成），混合均匀，室温分别浸泡4、8、12、16、24小时，离心，得到浸泡液并定容，吸取上述浸泡液适量，按照含量测定方法测定吸光度值，通过标准曲线计算出提取液中总酚酸的浓度，计算提取率，由实验结果可知总酚酸的提取率分别为42.37mg/g、58.75mg/g、64.68mg/g、65.02mg/g、65.44mg/g，低共熔溶剂浸泡时间为12小时时总酚酸的提取率较高水平，继续延长浸泡时间总酚酸的提取率增加幅度很小，所以选择浸泡时间为12小时进行后续试验。
14.纯化时洗脱液乙醇体积分数对黑果腺肋花楸果提取粉末中总酚酸含量的影响取黑果腺肋花楸果脱脂果粉50g，加入到圆底烧瓶中，加入10倍量含水量为10%的低共熔溶剂（由苹果酸、蔗糖按照质量比1:1组成），混合均匀，室温浸泡12小时，离心，得到浸泡液与残渣，浸泡液反复过d101大孔树脂柱充分吸附，直至流出液中检测不到总酚酸，流出的低共熔溶剂回收重复利用，先用1倍柱体积的蒸馏水洗脱树脂柱，将低共熔溶剂洗脱干净，然后用3倍柱体积的60%乙醇水溶液洗脱树脂柱，收集60%乙醇洗脱液，备用；将残渣加到圆底烧瓶中，按固液比（g:ml）1:6加入60%乙醇水溶液，搅拌均匀，在超声功率450w、温度70℃条件下处理25分钟，水浴升温至90℃灭酶30秒，过滤，得到滤液，将滤液与浸泡液合并得到黑果腺肋花楸果提取液；将黑果腺肋花楸果提取液采用减压浓缩方式浓缩至每1ml相当于脱脂果粉0.3g的浓缩液，在浓缩液中按照质量体积比（g:l）10:1加入壳聚糖与明胶（质量比为2:1）组成的复合絮凝剂，80℃加热处理1小时，离心，离心液中加入3倍量无水乙醇，搅拌均匀，放置12小时，离心，得到黑果腺肋花楸果总酚酸离心液；离心液采用减压浓缩方式浓缩至每1ml相当于脱脂果粉0.5g的流浸膏，加入流浸膏等质量的纤维素粉末，搅拌均匀，于真空干燥箱中60℃干燥2小时，粉碎，然后加入3倍量60%乙醇萃取2次，合并，得到黑果腺肋花楸果总酚酸萃取液；将黑果腺肋花楸果总酚酸萃取液用旋转蒸发仪浓缩至原体积的40%，得到上柱液，将上柱液平均分为5等份，分解将上柱液加入到5根d101树脂柱中吸附，均先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，然后分别用3倍柱体积的20%、40%、60%、80%、95%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液用旋转蒸发仪浓缩至相对密度为1.12～1.20g/ml(60℃)的流浸膏，经60℃真空减压干燥，得黑果腺肋花楸果总酚酸粉末，经福林酚
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碳酸钠显色法测定其总酚酸含量，其总酚酸含量分别为38.75%、50.21%、61.36%、55.36%、48.71%，由实验结果可知，当洗脱液为60%乙醇水溶液时总酚酸含量最高，所以选择60%乙醇水溶液纯化时的洗脱液。
15.纯化时洗脱液用量对黑果腺肋花楸果提取粉末中总酚酸含量的影响取黑果腺肋花楸果脱脂果粉50g，加入到圆底烧瓶中，加入10倍量含水量为10%的低共熔溶剂（由苹果酸、蔗糖按照质量比1:1组成），混合均匀，室温浸泡12小时，离心，得到浸泡液与残渣，浸泡液反复过d101大孔树脂柱充分吸附，直至流出液中检测不到总酚酸，流出的低共熔溶剂回收重复利用，先用1倍柱体积的蒸馏水洗脱树脂柱，将低共熔溶剂洗脱干净，然后用3倍柱体积的60%乙醇水溶液洗脱树脂柱，收集60%乙醇洗脱液，备用；将残渣加到圆底烧瓶中，按固液比（g:ml）1:6加入60%乙醇水溶液，搅拌均匀，在超声功率450w、温度70℃条件下处理25分
钟，水浴升温至90℃灭酶30秒，过滤，得到滤液，将滤液与浸泡液合并得到黑果腺肋花楸果提取液；将黑果腺肋花楸果提取液采用减压浓缩方式浓缩至每1ml相当于脱脂果粉3g的浓缩液，在浓缩液中按照质量体积比（g: l）10:1加入壳聚糖与明胶（质量比为2:1）组成的复合絮凝剂，80℃加热处理1小时，离心，离心液中加入3倍量无水乙醇，搅拌均匀，放置12小时，离心，得到黑果腺肋花楸果总酚酸离心液；离心液采用减压浓缩方式浓缩至每1ml相当于脱脂果粉1g的流浸膏，加入流浸膏等质量的纤维素粉末，搅拌均匀，于真空干燥箱中60℃干燥2小时，粉碎，然后加入3倍量60%乙醇萃取2次，合并，得到黑果腺肋花楸果总酚酸萃取液；将黑果腺肋花楸果总酚酸萃取液用旋转蒸发仪浓缩至原体积的40%，得到上柱液，将上柱液平均分为5等份，分解将上柱液加入到5根d101树脂柱中吸附，均先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，然后分别用1、2、3、4、5倍柱体积的60%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液用旋转蒸发仪浓缩至相对密度为1.12～1.20g/ml(60℃)的流浸膏，经60℃真空减压干燥，得黑果腺肋花楸果总酚酸粉末，经福林酚
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碳酸钠显色法测定其总酚酸含量，其总酚酸含量分别为58.34%、60.21%、62.05%、58.25%、54.34%，由实验结果可知，当洗脱液用量为3倍柱体积时总酚酸含量最高，所以选择洗脱液用量为3倍柱体积。