再生用于在神经系统中治疗疾病和损伤的功能性神经元的制作方法

再生用于在神经系统中治疗疾病和损伤的功能性神经元
1.本技术为分案申请，其原申请的申请日为2013年7月19日，申请号为201380048924.2(国际申请号pct/us2013/051277)，名称为“再生用于在神经系统中治疗疾病和损伤的功能性神经元”。
2.相关专利申请的交叉引用
3.本技术要求于2012年7月19日提交的美国临时专利申请no.61/673,471以及于2013年2月8日提交的美国临时专利申请no.61/762,506的优先权，所述申请的全部内容以引用的形式纳入本文。
4.政府资助
5.本发明是在国立卫生研究院授予的基金no.mh083911的政府资助下完成的。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
6.本发明的总体方面涉及在中枢神经系统(cns)中神经胶质细胞向功能性神经元的原位转化，以及在体外和体内将神经胶质细胞转化为神经元细胞的方法。


背景技术：

7.哺乳动物的中枢神经系统在损伤之后基本不能自我再生。由于损伤或神经学病症(如疾病或其他病状)，神经元经常被杀死或受到损伤。众所周知，在中风或神经退行性疾病(如阿兹海默病)后，神经胶质细胞随着脑或脊髓损伤而变得具有反应性。这些反应性神经胶质细胞能够在损伤位点中增殖并保持较高的数量，最终形成致密的疤痕组织(称为胶质瘢痕)以阻止神经元的生长。
8.目前，还没有方法能够逆转胶质瘢痕以进行脑修复。迫切需要治疗神经学病症的方法，特别是用于在患有神经学病症的受试者中产生神经元的方法。


技术实现要素：

9.根据本发明的方面，提供了在神经胶质细胞中产生神经元表型的方法，其包括在所述神经胶质细胞中表达外源的neurod1，其中所述神经胶质细胞选自星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞、ng2细胞和反应性ng2细胞。所述神经胶质细胞可以是人的或非人哺乳动物的，在体外或体内。
10.根据本发明的方面，提供了在神经胶质细胞中产生神经元表型的方法，其包括在所述神经胶质细胞中表达外源的neurod1，其中所述神经胶质细胞选自星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞、ng2细胞和反应性ng2细胞，其中表达外源neurod1包括将包含编码neurod1的核酸的表达载体递送到所述神经胶质细胞中。
11.根据本发明的方面，提供了在神经胶质细胞中产生神经元表型的方法，其包括在所述神经胶质细胞中表达外源的neurod1，其中所述神经胶质细胞选自星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞、ng2细胞和反应性ng2细胞，其中表达外源neurod1包括将包含编码
neurod1的核酸的病毒表达载体递送到所述神经胶质细胞中。
12.根据本发明的方面，提供了在神经胶质细胞中产生神经元表型的方法，其包括在所述神经胶质细胞中表达外源的neurod1，其中所述神经胶质细胞选自星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞、ng2细胞和反应性ng2细胞，其中表达外源neurod1包括将包含编码neurod1的核酸的逆转录病毒表达载体递送到所述神经胶质细胞中。
13.在神经胶质细胞(其中neurod1是外源表达)中产生的神经元表型包括如下中的一种或多种或所有：神经元形态、一种或多种神经元标记物的表达、神经元的电生理特征、突触形成和神经递质的释放。
14.根据本发明的方面，提供了在神经胶质细胞中产生神经元表型的方法，其包括在所述神经胶质细胞中表达外源的neurod1，其中neurod1是所述神经胶质细胞中唯一的外源表达的转录因子，其中所述神经胶质细胞选自星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞、ng2细胞和反应性ng2细胞。所述神经胶质细胞可以是人的或非人哺乳动物的，在体外或在体内。
15.在神经胶质细胞(其中neurod1是唯一的外源表达的转录因子)中产生的神经元表型包括如下中的一种或多种或所有：神经元形态、一种或多种神经元标记物的表达、神经元的电生理特征、突触形成和神经递质的释放。
16.根据本发明的方面，提供了在神经胶质细胞中产生神经元表型的方法，其包括在所述神经胶质细胞中表达外源的neurod1，其中neurod1是所述神经胶质细胞中唯一的外源表达的转录因子，其中所述神经胶质细胞选自星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞、ng2细胞和反应性ng2细胞，并且其中表达外源的neurod1包括将包含编码neurod1的核酸的表达载体递送到所述神经胶质细胞中。
17.根据本发明的方面，提供了在神经胶质细胞中产生神经元表型的方法，其包括在所述神经胶质细胞中表达外源的neurod1，其中neurod1是所述神经胶质细胞中唯一的外源表达的转录因子，其中所述神经胶质细胞选自星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞、ng2细胞和反应性ng2细胞，其中表达外源的neurod1包括将包含编码neurod1的核酸的病毒表达载体递送到所述神经胶质细胞中。
18.根据本发明的方面，提供了在神经胶质细胞中产生神经元表型的方法，其包括在所述神经胶质细胞中表达外源的neurod1，其中neurod1是所述神经胶质细胞中唯一的外源表达的转录因子，其中所述神经胶质细胞选自星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞、ng2细胞和反应性ng2细胞，其中表达外源的neurod1包括将包含编码neurod1的核酸的逆转录病毒表达载体递送到所述神经胶质细胞中。
19.根据本发明的方面，提供了在神经胶质细胞中产生神经元表型的方法，其包括在所述神经胶质细胞中表达外源的neurod1，其中neurod1是所述神经胶质细胞中唯一外源表达的转录因子，其中所述神经胶质细胞选自星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞、ng2细胞和反应性ng2细胞，其中表达外源的neurod1包括将包含编码neurod1的核酸的逆转录病毒表达载体递送到所述神经胶质细胞中。
20.根据本发明的方面，提供了包括包含外源的neurod1的体外神经胶质细胞的组合物。
21.根据本发明的方面，提供了包括包含编码neurod1的表达载体的体外神经胶质细胞的组合物。
22.根据本发明的方面，提供了包括包含外源neurod1的体外神经胶质细胞的组合物，所述组合物具有神经元表型，其中所述神经元表型包括如下中的一种或多种：神经元形态、一种或多种神经元标记物的表达、神经元的电生理特征、突触形成和神经递质的释放。
23.根据本发明的方面，提供了包括包含编码neurod1的表达载体的体外神经胶质细胞的组合物，所述组合物具有神经元表型，其中所述神经元表型包括如下中的一种或多种：神经元形态、一种或多种神经元标记物的表达、神经元的电生理特征、突触形成和神经递质的释放。
24.根据本发明的方面，提供了包括包含外源neurod1的体外神经胶质细胞的组合物，其中neurod1是所述神经胶质细胞中唯一的外源表达的转录因子，并且所述组合物具有神经元表型，其中所述神经元表型包括如下中的一种或多种：神经元形态、一种或多种神经元标记物的表达、神经元的电生理特征、突触形成和神经递质的释放。
25.根据本发明的方面，提供了包括包含编码neurod1的表达载体的体外神经胶质细胞的组合物，其中neurod1是所述神经胶质细胞中唯一的外源表达的转录因子，并且所述组合物具有神经元表型，其中所述神经元表型包括如下中的一种或多种：神经元形态、一种或多种神经元标记物的表达、神经元的电生理特征、突触形成和神经递质的释放。
26.根据本发明的方面，提供了在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其包括将治疗有效剂量的neurod1给予所述受试者的神经胶质细胞；由此使外源neurod1在所述神经胶质细胞中表达，从而在所述神经胶质细胞中产生神经元表型以改善所述受试者的神经学病症。
27.根据本发明的方面，提供了在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其包括将治疗有效剂量的neurod1给予所述受试者的神经胶质细胞，其中给予所述治疗有效剂量的neurod1包括给予包含编码neurod1蛋白的核酸序列的表达载体；由此使外源neurod1在所述神经胶质细胞中表达，从而在所述神经胶质细胞中产生神经元表型以改善所述受试者的神经学病症。
28.根据本发明的方面，提供了在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其包括将治疗有效剂量的neurod1给予所述受试者的神经胶质细胞，其中给予治疗有效剂量的neurod1包括给予包含编码neurod1蛋白的核酸序列的表达载体，其中所述编码neurod1蛋白的核酸序列包括选自以下的核酸序列：编码seq id no:2的核酸序列或其功能性片段；编码seq id no:4的核酸序列或其功能性片段；seq id no:1或其功能性片段；seq id no:3或其功能性片段；以及编码与seq id no:2或seq id no:4具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的蛋白的核酸序列或其功能性片段；由此使外源neurod1在所述神经胶质细胞中表达，从而在所述神经胶质细胞中产生神经元表型以改善所述受试者的神经学病症。
29.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法是治疗特征为存在反应性星形胶质细胞的神经学病症的方法。
30.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法是治疗中枢或周围神经系统的损伤的方法。
31.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法是治疗阿兹海默
病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(als)、癫痫和中风的方法。
32.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法包括通过局部给药、全身给药(systemic administration)或其组合给予治疗有效剂量的neurod1。
33.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法包括通过局部给药给予包含编码neurod1蛋白的核酸序列的表达载体，所述核酸序列与泛在启动子(ubiquitous promoter)可操作地连接。
34.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法包括通过局部给药将包含编码neurod1蛋白的核酸序列(所述核酸序列与泛在启动子可操作地连接)的表达载体给予至所述受试者的神经系统中的损伤或疾病位点，所述位点处需要额外的神经元和/或更少的神经胶质细胞或反应性神经胶质细胞。
35.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法包括通过局部给药将包含编码neurod1蛋白的核酸序列(所述核酸序列与选自星形胶质细胞特异性启动子和ng2细胞特异性启动子的细胞类型特异性启动子可操作地连接)的表达载体给予至所述受试者的神经系统中的损伤或疾病位点，所述位点处需要额外的神经元和/或更少的神经胶质细胞或反应性神经胶质细胞，或通过全身给药将所述表达载体给予所述受试者。
36.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法包括给予包含编码neurod1蛋白的核酸序列的表达载体，其中所述表达载体是病毒表达载体。
37.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法包括给予包含编码neurod1蛋白的核酸序列的表达载体，其中所述表达载体是逆转录病毒。
38.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法包括给予包含编码neurod1蛋白的核酸序列的表达载体，其中所述表达载体是腺病毒。
39.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法包括给予包含编码neurod1蛋白的核酸序列的表达载体，其中所述表达载体是腺伴随病毒。
40.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法包括给予包含编码neurod1蛋白的核酸序列的表达载体，其中所述表达载体是慢病毒。
41.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法包括给予包含编码neurod1蛋白的核酸序列的表达载体，其中给予治疗有效剂量的neurod1包括给予neurod1蛋白。
42.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法包括给予包含编码neurod1蛋白的核酸序列的表达载体，其中给予治疗有效剂量的neurod1包括给予编码neurod1蛋白的mrna。
43.根据本发明的方面，在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法包括：提供包含编码neurod1的核酸的病毒表达载体；将所述病毒表达载体递送到所述受试者的中枢神经系统或周围神经系统，由此所述病毒载体分别感染所述中枢神经系统或周围神经系统的分裂细胞，产生感染的细胞，并且由此外源neurod1以治疗有效的水平在所述感染的细胞中表达，其中与具有相同神经学病症的未经治疗的受试者相比，所述neurod1在所述感染的细胞中的表达导致在所述受试者中产生数量更多的神经元，因此使该神经学病症得到治疗。
44.根据本发明的方面，提供了在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其包括将治疗有效剂量的neurod1给予至所述受试者的神经胶质细胞中，其中neurod1是所述神经
胶质细胞中唯一的外源表达的转录因子；由此使外源neurod1在所述神经胶质细胞中表达，在所述神经胶质细胞中产生神经元表型以改善所述受试者的神经学病症。
45.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子。
46.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子，其中neurod1是此核酸编码的唯一的转录因子。
47.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子，其中所述神经胶质细胞特异性启动子是星形胶质细胞特异性启动子或ng2细胞特异性启动子。
48.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子，其中所述神经胶质细胞特异性启动子是星形胶质细胞特异性启动子或ng2细胞特异性启动子，并且其中所述表达载体是病毒载体。
49.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子，其中所述神经胶质细胞特异性启动子是星形胶质细胞特异性启动子或ng2细胞特异性启动子，并且其中所述表达载体是逆转录病毒表达载体。
50.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子，其中所述神经胶质细胞特异性启动子是星形胶质细胞特异性启动子或ng2细胞特异性启动子，并且其中所述表达载体是腺病毒、腺伴随病毒或慢病毒。
51.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子，其中所述启动子是gfap启动子、ng2启动子、aldh1l1启动子或lcn2启动子。
52.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子，其中所述启动子是gfap启动子、ng2启动子、aldh1l1启动子或lcn2启动子，并且其中所述表达载体是病毒载体。
53.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子，其中所述启动子是gfap启动子、ng2启动子、aldh1l1启动子或lcn2启动子，并且其中所述表达载体是逆转录病毒表达载体。
54.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子，其中所述启动子是gfap启动子、ng2启动子、aldh1l1启动子或lcn2启动子，并且其中所述表达载体是腺病毒、腺伴随病毒或慢病毒。
55.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子，其中所述编码neurod1蛋白的核酸序列包括选自以下的核酸序列：编码seq id no:2的核酸序列或其功能性片段；编码seq id no:4的核酸序列或其功能性片段；seq id no:1或其功能性片段；seq id no:3或其功能性片段；以及编码与seq id no:2或seq id no:4具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的蛋白的核酸序列或其功能性片段。
56.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接
的神经胶质细胞特异性启动子，其中所述启动子是gfap启动子、ng2启动子、aldh1l1启动子或lcn2启动子，并且其中所述编码neurod1蛋白的核酸序列包括选自以下的核酸序列：编码seq id no:2的核酸序列或其功能性片段；编码seq id no:4的核酸序列或其功能性片段；seq id no:1或其功能性片段；seq id no:3或其功能性片段；以及编码与seq id no:2或seq id no:4具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的蛋白的核酸序列或其功能性片段。
57.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子，其中所述启动子是gfap启动子、ng2启动子、aldh1l1启动子或lcn2启动子，其中所述表达载体是病毒载体，并且其中编码neurod1蛋白的核酸序列包括选自以下的核酸序列：编码seq id no:2的核酸序列或其功能性片段；编码seq id no:4的核酸序列或其功能性片段；seq id no:1或其功能性片段；seq id no:3或其功能性片段；以及编码与seq id no:2或seq id no:4具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的蛋白的核酸序列或其功能性片段。
58.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子，其中所述启动子是gfap启动子、ng2启动子、aldh1l1启动子或lcn2启动子，其中所述表达载体是逆转录病毒载体，并且其中编码neurod1蛋白的核酸序列包括选自以下的核酸序列：编码seq id no:2的核酸序列或其功能性片段；编码seq id no:4的核酸序列或其功能性片段；seq id no:1或其功能性片段；seq id no:3或其功能性片段；以及编码与seq id no:2或seq id no:4具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的蛋白的核酸序列或其功能性片段。
59.根据本发明的方面，提供了表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子，其中所述启动子是gfap启动子、ng2启动子、aldh1l1启动子或lcn2启动子，其中所述表达载体是腺病毒、腺伴随病毒或慢病毒载体，并且其中编码neurod1蛋白的核酸序列包括选自以下的核酸序列：编码seq id no:2的核酸序列或其功能性片段；编码seq id no:4的核酸序列或其功能性片段；seq id no:1或其功能性片段；seq id no:3或其功能性片段；以及编码与seq id no:2或seq id no:4具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的蛋白的核酸序列或其功能性片段。
附图说明
60.图1a示出了代表性图像，其说明了左图中的gfp荧光，中图中所示的相同视场中的gfap免疫荧光，以及右图中所示的相同视场中的gfp荧光和gfap免疫荧光的重叠。
61.图1b示出了代表性图像，其说明了左图中的neurod1
‑
gfp荧光，中图中所示的相同视场中的neun免疫荧光，以及右图中所示的相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光和neun免疫荧
光的重叠。
62.图1c示出了代表性图像，其说明了左图中的gfap启动子
‑
驱动的neurod1
‑
gfp荧光，中图中所示的相同视场中的neun免疫荧光，以及右图中所示的相同视场中的gfap启动子
‑
驱动的neurod1
‑
gfp荧光和neun免疫荧光的重叠。
63.图1d示出了在2dpi时的代表性图像，其说明了左图中的neurod1
‑
gfp荧光，中图中所示的相同视场中的ng2免疫荧光，以及右图中所示的dcx免疫荧光。
64.图1e示出了代表性图像，其说明了左图中的neurod1
‑
gfp荧光，中图中所示的相同视场中的neun免疫荧光，以及右图中所示的相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光和neun免疫荧光的重叠。
65.图1f示出了来自皮质切片(cortical slice)记录的代表性迹线，其示出了在30dpi时在neurod1转化的神经元中的na
+
和k
+
电流。发现neurod1转化的神经元能够激发重复动作电位(n＝4)。
66.图1g示出了来自皮质切片记录的代表性迹线，其示出了在30dpi时在neurod1转化的神经元中的重复动作电位。
67.图1h示出了代表性迹线，其示出了在26dpi时在皮质切片记录中的neurod1转化的神经元中的自发性突触事件(cnqx，10μμ；bic，20μμ)。
68.图1i示出了图1h中突触事件的放大视图。
69.图2a示出了代表性图像，其说明了在感染了仅编码gfp的逆转录病毒构建体的细胞中的gfp荧光(左上图)，或在感染了编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体的细胞中的gfp荧光(左下图)，对应的中上图和中下图中所示的相同视场中的免疫荧光标记轴突。
70.图2b是示出了在感染了编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体的损伤区域中轴突纤维的定量结果的图表，其示出了neurod1诱导的转化。
71.图2c示出了代表性图像，其说明了在感染了仅编码gfp的逆转录病毒构建体的细胞中的gfp荧光(左上图)，或在感染了编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体的细胞中的gfp荧光(左下图)，对应的中上图和中下图中示出了相同视场中的cspg免疫荧光。
72.图2d是示出了在感染了编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体的损伤区域中cspg的定量结果的图表，其示出了neurod1诱导的转化。
73.图2e示出了代表性图像，其说明了在感染了仅编码gfp的逆转录病毒构建体的细胞中的gfp荧光(左上图)，或在感染了编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体的细胞中的gfp荧光(左下图)，对应的中上图和中下图中所示的相同视场中的葡聚糖
‑
德克萨斯红(葡聚糖
‑
tr)荧光标记血管。
74.图2f是示出了在感染了编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体的损伤区域中血管面积的定量结果的图表，其示出了neurod1诱导的转化。
75.图2g示出了代表性图像，其说明了左图中的neurod1
‑
gfp荧光，中左图中所示的相同视场中的gfap免疫荧光(箭头)，中右图所示的相同视场中的cx43免疫荧光(箭簇)，以及右图所示的相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光、gfap免疫荧光和cx43免疫荧光的重叠。
76.图3a示出了代表性图像，其说明了左图中的野生型小鼠皮质中的gfap免疫荧光，中图中所示的5xfad小鼠皮质中的gfap免疫荧光，以及右图中所示的相同视场中5xfad小鼠皮质中的gfap免疫荧光和硫磺素
‑
s(thioflavin
‑
s)免疫荧光的重叠。
77.图3b示出了代表性图像，其说明了左图中的7月龄5xfad小鼠皮质中的neurod1
‑
gfp荧光；中图中所示的相同视场中的neun免疫荧光，以及右图中所示的相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光和neun免疫荧光的重叠。
78.图3c示出了代表性图像，其说明了左图中的5xfad小鼠皮质中的gfap启动子
‑
驱动的neurod1
‑
gfp荧光，中图中所示的相同视场中的neun免疫荧光，以及右图中所示的相同视场中的gfap启动子
‑
驱动的neurod1
‑
gfp荧光和neun免疫荧光的重叠。
79.图3d示出了代表性图像，其说明了上图中的5xfad小鼠皮质中的neurod1
‑
gfp荧光，以及下图中所示的相同视场中的vglut1免疫荧光(箭簇)。
80.图3e示出了代表性图像，其说明了上图中的与图3d相同视场中的5xfad小鼠皮质中的gad65免疫荧光(箭头)，以及下图中所示的相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光、vglut1免疫荧光和gad65免疫荧光的重叠。
81.图3f示出了在ad皮质切片(5xfad小鼠皮质)中，使用编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体在28dpi时neurod1转化的神经元中的na和k电流的代表性迹线。
82.图3g示出了在ad皮质切片中，使用编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体在28dpi时从neurod1转化的神经元中记录的自发性突触事件的代表性迹线。
83.图3h示出了图3g中所示的2个突触事件的放大视图。
84.图3i示出了代表性图像，其说明了在15
‑
17dpi时在感染了仅编码gfp的逆转录病毒构建体的细胞中的gfp荧光(左上图)或在感染了编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体的细胞中的neurod1
‑
gfp荧光(左下图)。
85.图3j示出了代表性图像，其说明了在15
‑
17dpi时在感染了仅编码gfp的逆转录病毒构建体的细胞中的gfp荧光(左上图)或在感染了编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体的细胞中的neurod1
‑
gfp荧光(左下图)。
86.图3k示出了代表性图像，其说明了在15
‑
17dpi时在感染了仅编码gfp的逆转录病毒构建体的细胞中的gfp荧光(左上图)或在感染了编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体的细胞中的neurod1
‑
gfp荧光(左下图)。
87.图3l是示出了在15
‑
17dpi时在感染了编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体的5xfad小鼠皮质区域中αβ的定量结果的图表。
88.图3m是示出了在15
‑
17dpi时在感染了编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体的5xfad小鼠皮质区域中apoe的定量结果的图表。
89.图3n是示出了在15
‑
17dpi时在感染了编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体的5xfad小鼠皮质损伤区域中glt1的定量结果的图表。
90.图4a是代表性的免疫荧光图像，其示出了大多数经培养的人星形胶质细胞被s100β抗体免疫标记(比例尺，50μm)。
91.图4b是一对代表性的相差图像，其示出了使用编码neurod1的逆转录病毒，在45dpi时neurod1诱导的从星形胶质细胞(左)到神经元(右)的形态变化。
92.图4c示出了代表性图像，其说明了在被编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体感染的人星形胶质细胞中的gfp荧光。
93.图4d示出了代表性图像，其说明了在被编码gfap启动子
‑
驱动的neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体感染的人星形胶质细胞中的gfp荧光。
94.图4e示出了代表性图像，其说明了人星形胶质细胞直接转化为神经元。
95.图4f示出了在45dpi时neurod1转化的人神经元的树突(map2，中图)上免疫染色的突触点(synaptic puncta)(sv2，左图)的代表性图像，neurod1
‑
gfp荧光。
96.图4g是高放大倍数图像，其示出了在neurod1转化的神经元上与树突棘共定位的囊泡谷氨酸转运蛋白1(vglut1)免疫染色点。
97.图4h是在20dpi时在neurod1转化的神经元中的重复动作电位的代表性迹线。
98.图4i示出了代表性迹线，其示出了在30dpi时从neurod1转化的神经元记录的na
+
和k
+
电流。
99.图4j示出了代表性迹线，其示出了通过浴施用(bath application)100μμ谷氨酸诱导的受体电流。
100.图4k示出了代表性迹线，其示出了通过浴施用100μμ的gaba诱导的受体电流。
101.图4l示出了代表性迹线，其示出了通过浴施用100μμ的nmda诱导的受体电流。
102.图4m示出了在40dpi时在neurod1转化的神经元中自发性突触事件的代表性迹线。
103.图5a是一组低倍图像，其示出了在14dpi时在损伤中心附近被gfp逆转录病毒感染的反应性神经胶质细胞。
104.图5b示出了neurod1
‑
gfp荧光，相同视场中的dcx免疫染色(中图)，以及相同视场中的gfp荧光和dcx免疫染色的重叠(右图)。
105.图5c示出了在14dpi时沿着注射位点被neurod1
‑
gfp感染的dcx阳性细胞的低倍图像。
106.图5d示出了在14dpi时沿着注射位点被neurod1
‑
gfp感染的dcx阳性细胞的高倍图像。
107.图5e示出了说明被gfap::gfp逆转录病毒感染的星形胶质细胞是dcx阴性的图像。
108.图6a示出了代表性图像，其说明了所培养的小鼠星形胶质细胞大多数对星形胶质细胞标记物gfap是免疫阳性的。
109.图6b示出了代表性图像，其说明了经neurod1
‑
gfp逆转录病毒感染的细胞对neun是免疫阳性的。
110.图6b在左图中示出了neurod1
‑
gfp荧光，在中图中所示了相同视场中的neun免疫染色，以及在右图中示出了相同视场中的neurod1免疫染色。
111.图6c示出了代表性图像，其说明了被gfap::neurod1逆转录病毒感染的细胞也是neun阳性的(8dpi)。
112.图6c在左图中示出了neurod1
‑
gfp荧光，在中图中示出了相同视场中的neun免疫染色，以及在右图中示出了相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光和neun免疫染色的重叠。
113.图6d示出了代表性图像，其说明了经neurod1
‑
gfp感染的细胞大多数对皮质神经元标记物tbr1是阳性的。
114.图6d在左图中示出了neurod1
‑
gfp荧光，在中图中示出了相同视场中的tbrl免疫染色，以及在右图中示出了相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光和tbrl免疫染色的重叠。
115.图6e示出了代表性图像，其说明了一些经neurod1感染的细胞对齿状回颗粒细胞(dentate granule cell)标记物prox1也是阳性的。
116.图6e在左图中示出了neurod1
‑
gfp荧光，在中图中示出了相同视场中的prox1免疫
染色，以及在右图中示出了相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光和prox1免疫染色的重叠。
117.图6f是示出了对呈gfap、iba1和ng2免疫阳性的培养的小鼠星形胶质细胞进行定量的图表。
118.图7a示出了在小鼠星形胶质细胞转化的神经元中，通过浴施用gaba(100μμ)诱导的较大受体电流。
119.图7b示出了谷氨酸(100μμ)诱发的电流。
120.图7c示出了nmda(100μμ)诱发的电流。
121.图7d示出了从neurod1转化的神经元中记录的自发性突触电流。
122.图8a示出了所培养的小鼠ng2细胞的代表性图像，其示出了ng2免疫染色(左图)、iba1免疫染色(中图)以及gfap免疫染色(右图)。
123.图8b在左图中示出了gfp荧光，在中图中示出了cnpase免疫染色，以及在右图中示出了相同视场中的gfp荧光和cnpase免疫染色的重叠。
124.图8c示出了代表性图像，其说明了被编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒感染的ng2细胞变成了neun阳性神经元。
125.图8c在左图中示出了neurod1
‑
gfp荧光，在中图中示出了neun免疫染色，以及在右图中示出了相同视场中的gfp荧光和neun免疫染色的重叠。
126.图8d示出了代表性图像，其说明了许多neurod1感染的ng2细胞变成了gaba能神经元。
127.图8e示出了代表性图像，其说明了neurod1感染的ng2细胞大多数对皮质神经元标记物tbr1是免疫阳性的。
128.图8f示出了代表性图像，其说明了neurod1感染的ng2细胞或者为prox1阳性(箭头)，或者为prox1阴性(箭簇)。
129.图8g是示出了对呈gfap、iba1和ng2免疫阳性的培养的小鼠ng2细胞进行定量的图表。
130.图9a示出了代表性图像，其说明了在用neurod1
‑
gfp逆转录病毒感染小鼠ng2细胞培养物之后，在被neurod1转化为神经元的ng2细胞上检测到许多vglut1点(puncta)。
131.图9b是代表性迹线，其示出了被neurod1转化为神经元的ng2细胞表现出较大的na
+
和k
+
电流。
132.图9c是代表性迹线，其示出了被neurod1转化为神经元的ng2细胞表现出重复动作电位。
133.图9d是代表性迹线，其示出了被neurod1转化为神经元的ng2细胞表现出较大的谷氨酸诱发的电流。
134.图9e是代表性迹线，其示出了被neurod1转化为神经元的ng2细胞表现出较大的gaba诱发的电流。
135.图9f是代表性迹线，其示出了从被neurod1转化为神经元的ng2细胞中记录的自发性突触事件表现出谷氨酸能成分。
136.图9g是代表性迹线，其示出了从被neurod1转化为神经元的ng2细胞中记录的自发性突触活动表现出gaba能成分。
137.图10a是在病毒注射后在2月龄的neurod1转化的神经元中观察到的清晰树突棘
(箭头)中的neurod1
‑
gfp荧光图像。
138.图10b是代表性迹线，其示出了在皮质切片记录中，从2月龄的neurod1转化的神经元中记录的较大的自发性突触事件。
139.图10c是代表性迹线，其示出了图10b中所示的突触事件的放大视图。
140.图11a示出了如下的代表性图像：损伤后4天时的brdu免疫染色(左图)，相同视场中的dcx免疫染色(中图)，以及相同视场中的brdu免疫染色和dcx免疫染色的重叠(右图)。
141.图11b示出了如下的代表性图像：损伤后1个月时的brdu免疫染色(左图)，相同视场中的neun免疫染色(中图)，以及相同视场中的brdu免疫染色和neun免疫染色的重叠(右图)。
142.图12a示出了免疫染色的代表性图像，其示出了在脑穿刺损伤之前(d0)和之后最长达1个月的gfap(星形胶质细胞)、ng2(ng2细胞)和iba1(小胶质细胞)信号的变化。
143.图12b示出了tunel染色的代表性图像。
144.图12c示出了代表性图像，其表明星形胶质细胞谷氨酸转运蛋白glt1和轴突纤维显著减少。
145.图12d示出了柱状图，其示出了在脑损伤之前和之后的免疫染色信号的定量数据。
146.图13a包括如下的图像：gfp荧光、neurod1
‑
gfp荧光、cx43免疫染色，以及gfp或neurod1
–
gfp与cx43免疫染色的重叠。
147.图13a还包括图表，其示出了与被gfp逆转录病毒感染的对照区域相比，在被neurod1感染的区域中星形胶质细胞间隙连接(cx43)减少。
148.图13b包括如下的图像：gfp荧光、neurod1
‑
gfp荧光、tunel染色，以及gfp或neurod1
–
gfp与tunel染色的重叠。
149.图13b还包括图表，其示出了tunel染色表明在包含neurod1转化的神经元的区域中细胞死亡降低。
150.图13c包括如下的图像：gfp荧光、neurod1
‑
gfp荧光、vegf免疫染色，以及gfp或neurod1
–
gfp与vegf免疫染色的重叠。
151.图13c还包括图表，其示出了血管生成标记物vegf在包含neurod1转化的神经元的区域中显著增多。
152.图13d示出了代表性图像，其说明了在包含neurod1转化的神经元的区域中，星形胶质细胞与血管紧密接触。
153.图13e示出了代表性图像，其说明了在包含neurod1转化的神经元的区域中。
154.图13e示出了smi312免疫染色、mbp免疫染色，以及smi312免疫染色和mbp免疫染色的重叠。
155.图14a示出了将磺酰罗丹明b透析进入1日龄的neurod1转化的神经元的代表性图像。
156.图14b示出了neurod1诱导的星形胶质细胞到神经元的转化的代表性图像。
157.图14c是示出了对这些结果进行定量的图表。
158.图15a示出了代表性图像，其表明在7月龄的wt小鼠中，感染了编码neurod1和gfp的逆转录病毒的细胞(14dpi)是neun阳性的。
159.图15a示出了neurod1
‑
gfp荧光、neun免疫染色，以及在相同视场中的neurod1
‑
gfp
荧光和neun免疫染色的重叠。
160.图15b示出了代表性图像，其表明在14月龄的动物中，neurod1转化的神经元(16dpi)具有强健的树突。
161.图15c示出了neurod1
‑
gfp荧光、αβ42免疫染色，以及在相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光和αβ42免疫染色的重叠。
162.图16示出了neurod1
‑
gfp荧光、musashi免疫染色，以及在相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光和musashi免疫染色的重叠。
163.图17a和17b是示出了在小鼠的培养的神经元中谷氨酸免疫染色的代表性图像。
164.图17c和17d是示出了在小鼠的培养的神经元中gaba免疫染色的代表性图像。
165.图17e和17f是示出了在小鼠的培养的神经元中tbr1免疫染色的代表性图像。
166.图18a示出了代表性图像，其表明在人星形胶质细胞培养物中，大多数细胞对星形胶质细胞标记物s100β是免疫阳性的。
167.图18b示出了代表性图像，其表明neurod1
‑
gfp感染的人星形胶质细胞变成neun免疫阳性的。
168.图18c示出了代表性图像，其表明通过用编码neurod1的逆转录病毒感染人星形胶质细胞而产生的neurod1转化的神经元是prox1阳性的。
169.图18d示出了代表性图像，其表明人小胶质细胞培养物中的大多数细胞是iba1阳性的。
170.图18e和18f是代表性图像，其示出了人小胶质细胞不能被neurod1转化为神经元。
171.图18g是示出了对呈s100β免疫阳性的培养的人星形胶质细胞进行定量的图表。
172.图18h是示出了对呈gfap、iba1免疫阳性的培养的人小胶质细胞进行定量的图表。
173.图19a示出了将hng2::neurod1
‑
ires
‑
gfp逆转录病毒注射到1月龄的小鼠皮质之后获得的代表性图像；以及
174.图19b示出了在用hng2::neurod1
‑
ires
‑
gfp逆转录病毒感染培养的ng2细胞之后获得的代表性图像。
具体实施方式
175.出乎意料的是，如本文所公开的，单一转录因子neurod1将星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞、ng2细胞和反应性ng2细胞转化为功能性神经元。neurod1将星形胶质细胞和反应性星形胶质细胞转化为功能性谷氨酸能神经元，并且将ng2细胞和反应性ng2细胞主要转化为功能性gaba能神经元以及一些功能性谷氨酸能神经元。
176.在体外、离体和/或体内的星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞、ng2细胞和反应性ng2细胞向神经元的转化可用来治疗神经退行性疾病和损伤，替换退化的神经元并恢复神经功能。
177.本发明提供了通过单一转录因子neurod1将反应性神经胶质细胞直接转化为功能性神经元的方法，以治疗神经系统的损伤和/或疾病。
178.在星形胶质细胞和/或ng2细胞中neurod1的表达将所述星形胶质细胞和ng2细胞转化为功能性神经元，并对脑损伤产生了一些重要的结果：1)减少了损伤部位中的反应性神经胶质细胞的数量；2)产生新的功能性神经元，以与现有的神经元连接；3)损伤部位中的
轴突纤维增加；4)在星形胶质细胞和ng2细胞转化为功能性神经元之后血管增加；5)在星形胶质细胞和ng2细胞转化为功能性神经元之后细胞死亡减少。因此，损伤部位的整体环境转变成更适合神经元生存的环境，这会是功能恢复的关键步骤。
179.由neurod1介导的从神经胶质细胞向功能性神经元的直接转化不仅发生在年轻的成年动物中，还发生在非常老的动物甚至是患有阿兹海默病的老年动物中，这使得在成体脑中的脑修复成为可能。此外，在阿兹海默病的公认模型中，反应性神经胶质细胞通过单一转录因子neurod1的外源表达被转化为功能性神经元，并且此转化伴随着淀粉样β肽沉积物的减少。
180.通过单独表达外源neurod1将星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞、ng2细胞和反应性ng2细胞转化为功能性神经元——在本文被称为neurod1转化的神经元，其代表首次在体外和体内将上述细胞直接转化为功能性神经元。neurod1转化的神经元的特征是，神经元表型的长期稳定性。
181.根据本发明的方面，提供了用于在体内在脑中产生新的神经元的方法，其包括将neurod1导入神经胶质细胞，特别是导入星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞、ng2细胞或反应性ng2细胞，从而将神经胶质细胞“转化”为神经元，即“neurod1转化的神经元”。
182.本发明的方法和组合物具有多种用途，包括例如原位产生神经元以治疗受试者的神经学病症。
183.通过将内源反应性星形胶质细胞转化为神经元而进行的对损伤神经元细胞的原位置换有利地消除了免疫排斥的可能性，例如，当进行组织/细胞移植以替换损伤的神经元细胞时会发生免疫排斥。
184.在脑/脊髓损伤或神经障碍发生后，神经胶质细胞如星形胶质细胞经常过度增殖。将冗余的神经胶质细胞转变为神经元将减少反应性神经胶质细胞的数量，同时补充损失的神经元，用于内部脑修复。
185.根据本发明的方面，提供了从神经胶质细胞(如ng2细胞、反应性ng2细胞、星形胶质细胞和/或反应性星形胶质细胞)中产生神经元表型的方法，其包括在神经胶质细胞中表达外源neurod1。
186.神经胶质细胞，例如ng2细胞、反应性ng2细胞、星形胶质细胞和/或反应性星形胶质细胞，为体外的、离体的或体内的。表达外源neurod1的神经胶质细胞可被转移至神经系统损伤或疾病的位点，以治疗需要其的受试者。
187.神经胶质细胞，例如ng2细胞、反应性ng2细胞、星形胶质细胞和/或反应性星形胶质细胞，可以是人的或非人哺乳动物的，也可以是非哺乳动物的。
188.本文使用的科学和技术术语旨在具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。这些术语在多种标准参考文献的上下文中被说明性地定义和使用，包括：
189.j.sambrook and d.w.russell，molecular cloning：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press；3
rd ed.，2001；f.m.asubel，ed.，short protocols in molecular biology，current protocols；5
th
ed.，2002；b.alberts et a1.，molecular biology of the cell，4
th eu.，garland，2002；d.l.nelson and m.m.cox，lehninger principles of biochemistry，4
th ed.，w.h.freeman&company，2004；engelke，d.r.，rna interference(rnai)：nuts and bolts df rnai technology，dna press llc，
eagleville，pa，2003；herdewijn，p.(ed.)，oligonucleotide synthesis：methods and applications，methods in molecular biology，humana press，2004；a.nagy，m.gertsenstein，k.vintersten，r.behringer，manipulatingthe mouse embryo：alaboratory manual，cold spring harbor laboratory press，3
rd ed.；december 15，2002，isbn
‑
10：0879695919；kursad turksen (ed.)，embryonic stem cells：methods and protocols in methods in molecular biology，2002；185，human press：current protocols in stem cell biology，isbn：9780470151808。
190.除非另有明确说明或上下文中另有明确指出，术语“一”、“一个”和“所述”不意欲进行限制，并且包括复数指代对象。
191.术语“neurod1蛋白”是指参与胚胎脑发育和成体神经发生的bhlh前神经转录因子，参见cho，j.h.et al.，mol，neurobioi.，30：35
‑
47，2004；kuwabara，t.et ai.，nature neurosci.，12：1097
‑
1105，2009；和gao，z.et al.，nature neurosci.，12：1090
‑
1092，2009。neurod1在发育晚期表达一一主要在神经系统中，并且参与神经元分化、成熟和存活。
192.术语“neurod1蛋白”包括人neurod1蛋白，其在本文被鉴定为seq id no：2；以及小鼠neurod1蛋白，其在本文被鉴定为seq id no：4。除了seq id no：2和seq id no：4的neurod1蛋白，术语“neurod1蛋白”还包括neurod1蛋白的变体，如seq id no：2和seq id no：4的变体，其可被包括在本发明的方法中。本文使用的术语“变体”是指天然发生的遗传变异和重组方法制备的变异，与参照neurod1蛋白(如seq id no：2或seq id no：4)相比，每一种变异都在其氨基酸序列上包含一个或多个改变。这类改变包括其中一个或多个氨基酸残基已经通过氨基酸置换、添加或缺失而被修饰的那些。术语“变体”包含人neurod1的直系同源物，包括例如哺乳动物和鸟类neurod1，例如但不限于来自非人灵长类、猫、狗、绵羊、山羊、马、牛、猪、鸟类、家禽动物以及啮齿动物(例如但不限于小鼠和大鼠)的neurod1直系同源物。在一个非限制性的实施例中，小鼠neurod1(其在本文被示例为氨基酸序列seq id no:4)是人neurod1的直系同源物。
193.优选的变体与seq id no:2或seq id no:4具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
194.利用标准分子生物学技术，如定点诱变和pcr介导的诱变，能够引入突变。本领域普通技术人员会了解，能够引入一个或多个氨基酸突变，而不会改变neurod1蛋白的功能特性。例如，可进行一个或多个氨基酸置换、添加或缺失而不改变seq id no:2或seq id no:4的neurod1蛋白的功能特性。
195.可在neurod1蛋白中进行保守性氨基酸置换以产生neurod1蛋白变体。保守性氨基酸置换是一个氨基酸被置换为另一个具有相似特征的氨基酸的本领域公认的置换。例如，每个氨基酸可被描述为具有以下特征中的一个或多个：带正电的、带负电的、脂肪族的、芳香族的、极性的、疏水性的和亲水性的。保守性置换是一个具有特定结构或功能特征的氨基酸被另一个具有相同特征的氨基酸置换。酸性氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸；碱性氨基酸包括组氨酸、赖氨酸、精氨酸；脂肪族氨基酸包括异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸和色氨酸；极性氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；疏水氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸和色氨酸；保守性置换包括
在每组内氨基酸之间的置换。氨基酸还可按照相对大小被描述，丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸通常都被认为是小氨基酸。
196.neurod1变体可包括合成的氨基酸类似物、氨基酸衍生物和/或非标准氨基酸，举例说明性地包括但不限于α
‑
氨基丁酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、氰丙氨酸、二氨基丁酸、二氨基庚二酸、二羟基苯丙氨酸、黎豆氨酸、高精氨酸、羟基脯氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、3
‑
磷酸丝氨酸、高丝氨酸、5
‑
羟基色氨酸、1
‑
甲基组氨酸、3
‑
甲基组氨酸和鸟氨酸。
197.为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，对所述序列进行比对用于最佳比较目的(例如，可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入空位，以与第二氨基酸序列或核酸序列进行最佳比对)。然后比较对应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当所述第一序列上的某一位置被与所述第二序列中对应位置上的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，所述分子在此位置上是相同的。所述两个序列之间的同一性百分比是所述序列共有的相同位置的数量的函数(即，同一性百分比(％)＝相同重叠位置的数量/位置总数
×
100％)。在一个实施方案中，两个序列的长度相同。
198.确定两个序列之间的同一性百分比还可利用数学算法来完成。用来比较两个序列的数学算法的一个优选的非限制性实例是karlin and altschul,1990,pnas 87:2264 2268中的算法，在karlin and altschul,1993,pnas.90:5873 5877中被改良。此算法被纳入altschul et al.,1990,j.mol.biol.215:403中的nblast和xblast程序。利用nblast核苷酸程序参数组(例如，得分＝100，字长＝12)进行blast核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。利用xblast程序参数组(例如，得分＝50，字长＝3)进行blast蛋白搜索，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，按照altschul et al.,1997,nucleic acids res.25:3389 3402中所述使用gapped blast。或者，使用psi blast进行迭代检索——其检测分子间的远缘关系(同上)。当利用blast、gapped blast和psi blast程序时，使用各个程序(例如xblast和nblast)的默认参数(参见，例如，ncbi网站)。用于序列比较的数学算法的另一个优选的非限制性实例是myers and miller,1988,cabios 4:11 17中的算法。此算法被纳入align程序(2.0版本)——其为gcg序列比对软件包的一部分。当利用所述align程序来比较氨基酸序列时，其使用pam120权重残基表、空位长度罚分为12且空位罚分为4。
199.在允许或不允许空位的情况下，使用与上述方法类似的技术来确定两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比时，通常仅计算精确的匹配。
200.术语“neurod1蛋白”包括可用在本发明的方法和组合物中的neurod1蛋白的片段，如seq id no:2和seq id no:4的片段及其变体。
201.neurod1蛋白和核酸可从天然来源(如表达neurod1的生物的脑或细胞系中的细胞)中分离。或者，neurod1蛋白或核酸可通过重组方法产生，如利用表达构建体在体外或体内表达。neurod1蛋白和核酸还可通过公知的方法合成。
202.优选利用重组核酸技术产生包括在本发明的方法和组合物中的neurod1。重组neurod1的生产包括将包含编码neurod1的dna序列的重组表达载体引入宿主细胞。
203.根据本发明的实施方案，被引入宿主细胞以产生neurod1的编码neurod1的核酸序列编码seq id no:2、seq id no:4或其变体。
204.根据本发明的方面，在本文被鉴定为seq id no:1的核酸序列编码seq id no:2，
且被包含在表达载体中并且被表达以产生neurod1。根据本发明的方面，在本文被鉴定为seq id no:3的核酸序列编码
205.seq id no:4，且被包含在表达载体中并且被表达以产生neurod1。
206.应理解，由于遗传密码的简并性，与seq id no:1和seq id no:3基本上相同的核酸序列编码neurod1及neurod1的变体，并且这类替代核酸可被包括在表达载体中并表达以产生neurod1及其变体。本领域普通技术人员会了解，编码neurod1蛋白的核酸片段可被用来产生neurod1蛋白的片段。
207.术语“表达载体”是指用于将编码neurod1的核酸在体外或体内引入宿主细胞(在其中所述核酸被表达以产生neurod1)的重组载体。在具体的实施方案中，使包含seq id no:1或seq id no:3或基本上相同的核酸序列的表达载体在包含此表达载体的细胞中表达以产生neurod1。术语“重组体”被用来指这样的核酸构建体，在其中两个或多个核酸是被连接起来并且它们在自然界中并不相连。表达载体包括但不限于质粒、病毒、bac和yac。具体的病毒表达载体示例性地包括衍生自腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒和慢病毒的那些。
208.表达载体包含核酸，此核酸包含编码目的多肽的片段，该片段可操作地连接至一个或多个提供用于转录编码所述目的多肽的片段的调控元件。本文使用的术语“可操作地连接”是指一个核酸与另一个核酸处于功能性关系中。术语“可操作地连接”包括两个或多个核酸分子(如待转录的核酸和调控元件)的功能性连接。本文使用的术语“调控元件”指这样的核苷酸序列，其控制可操作地连接的核酸的表达的某些方面。示例性的调控元件包括增强子，例如但不限于：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)、内部核糖体进入位点(ires)或2a结构域、内含子、复制起点、多腺苷酸化信号(pa)、启动子、转录终止序列、上游调控区，其有助于可操作地连接的核酸序列的复制、转录、转录后加工。本领域普通技术人员仅利用常规实验即能够选择上述和其他调控元件并将其使用在表达载体中。
209.本文使用的术语“启动子”指这样的dna序列，其与待转录的核酸序列(如编码neurod1的核酸序列)可操作地连接。启动子通常位于待转录的核酸序列的上游，并且为rna聚合酶和其他转录因子的特异性结合提供位点。在具体的实施方案中，启动子通常位于待转录以生成所需分子的核酸序列的上游，并且为rna聚合酶和其他转录因子的特异性结合提供位点。
210.技术人员会了解，可以分离基因的5’非编码区并将其整体用作启动子以驱动可操作地连接的核酸的表达。或者，可分离或使用5’非编码区的一部分来驱动可操作地相连的核酸的表达。通常，使用基因的5’非编码区的约500
‑
6000bp来驱动可操作地相连的核酸的表达。任选地，使用基因的5’非编码区的一部分，其包含驱动可操作地连接的核酸表达所必需的最少量的5’非编码区。用来确定基因的5’非编码区的指定部分驱动可操作地连接的核酸表达的能力的实验是本领域公知的。
211.根据本文所述方法，用于驱动neurod1表达的特定启动子是“泛在”或“组成型”启动子，所述启动子其中转移入所述表达载体的生物的许多、大多数或所有细胞类型中驱动表达。可被用于neurod1表达的泛在启动子的非限制性实例是巨细胞病毒启动子、猿猴病毒40(sv40)早期启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、腺病毒主要晚期启动子、β肌动蛋白启动子、甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶、葡萄糖
‑
调节的蛋白78启动子、葡萄糖
‑
调节的蛋白94启动子、热激蛋白70启动子、β驱动蛋白启动子、rosa启动子、泛素b启动子、真核起始因子4a1启动子和延长
因子i启动子，其所有均为本领域所公知的并且可使用常规方法从原始来源中分离或可从商业来源获得。
212.启动子可全部衍生自单个基因或者可以是嵌合的，即具有衍生自多于一种基因的部分。
213.调控序列的组合可被包含在表达载体中并被用于驱动neurod1的表达。包含在表达载体中以驱动neurod1表达的非限制性实例是cag启动子，其结合巨细胞病毒cmv早期增强子元件和鸡β
‑
肌动蛋白启动子。
214.根据本文所述方法，用于驱动neurod1表达的具体启动子是优先在神经胶质细胞(特别是星形胶质细胞和/或ng2细胞)中驱动表达的启动子。此类启动子被称为“星形胶质细胞特异性”和/或“ng2细胞特异性”启动子。
215.星形胶质细胞特异性启动子的非限制性实例是胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)启动子和醛脱氢酶1家族成员l1(aldh1l1)启动子。
216.人gfap启动子在本文被表示为seq id no:6。小鼠aldh1l1启动子在本文被表示为seq id no:7。
217.ng2细胞特异性启动子的非限制性实例是硫酸软骨素蛋白多糖4基因(又称为神经元
‑
神经胶质抗原2(ng2))的启动子。人ng2启动子在本文被表示为seq id no:8。
218.根据本文所述方法，用于驱动neurod1表达的具体启动子是优先在反应性神经胶质细胞(特别是反应性星形胶质细胞和/或反应性ng2细胞)中驱动表达的启动子。此类启动子被称为“反应性星形胶质细胞特异性”和/或“反应性ng2细胞特异性”启动子。
[0219]“反应性星形胶质细胞特异性”启动子的一个非限制性实例是脂质运载蛋白2(lcn2)基因的启动子。小鼠lcn2启动子在本文被表示为seq id no:5。
[0220]
泛在和细胞类型特异性启动子的同系物和变体可被用于表达neurod1。
[0221]
根据本发明，启动子同系物和启动子变体可被包含在表达载体中，用于表达neurod1。术语“启动子同系物”和“启动子变体”是指与本文公开的启动子相比，具有基本相似的功能特性以赋予可操作地连接的编码neurod1的核酸所需的表达类型(如neurod1的细胞类型特异性表达或neurod1的泛在表达)的启动子。例如，与gfap、aldh1l1、ng2、lcn2和cag启动子相比，启动子同系物或变体具有基本相似的功能特性，以赋予可操作地连接的编码neurod1的核酸以细胞类型特异性表达。
[0222]
本领域技术人员会了解，可引入一个或多个核酸突变而不改变给定启动子的功能特性。可使用标准分子生物学技术(如定点诱变和pcr介导的诱变)引入突变以产生启动子变体。本文使用的术语“启动子变体”是指参照启动子(例如但不限于，gfap、aldh1l1、ng2、lcn2和pcag启动子)的经分离的天然存在的变异或者以重组方法制备的变异。
[0223]
本领域已知来自其他物种的启动子是功能性的，例如，小鼠aldh1l1启动子在人细胞中是功能性的。可使用本领域中已知的生物信息学工具来鉴定来自其他物种的同系物和同源启动子，参见，例如xuan et al.,2005,genome biol 6:r72；zhao et al.,2005,nucl acid res33:d103
‑
107；和halees et al.2003,nucl.acids.res.2003 31:3554
‑
3559。
[0224]
从结构上看，neurod1的细胞类型特异性表达和/或泛在启动子的同系物和变体与参照的发育调节和/或泛在启动子具有至少为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核酸
序列同一性，并且包含rna聚合酶的结合位点，以及任选的一个或多个转录因子的结合位点。
[0225]
与seq id no:1或3基本相同的核酸序列的特征是具有能够在高严格杂交条件下与seq id no:1或3杂交的互补核酸序列。
[0226]
除了一个或多个编码neurod1的核酸，一个或多个编码其他蛋白的核酸序列也可包含在表达载体中。例如，这类其他蛋白包括非neurod1蛋白如报告分子，包括但不限于β半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白和抗生素抗性报告分子。
[0227]
在具体的实施方案中，所述重组表达载体至少编码seq id no:2的neurod1、与seq id no:2具有至少95％同一性的蛋白或者由与seq id no:1基本相同的核酸序列编码的蛋白。
[0228]
在具体的实施方案中，所述重组表达载体至少编码seq id no:4的neurod1、与seq id no:4具有至少95％同一性的蛋白或由与seq id no:2基本相同的核酸序列编码的蛋白。
[0229]
seq id no:9是一个这样的核酸的实例，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的cag启动子，还包含编码egfp的核酸序列和增强子wpre。ires将编码neurod1的核酸和编码egfp的核酸分隔开。将seq id no:9插入到表达载体中用于表达neurod1和报告基因egfp。任选地，可去除ires和编码egfp的核酸，将剩下的cag启动子和可操作地连接的编码neurod1的核酸插入到表达载体中用于表达neurod1。可任选包括wpre或另一个增强子。
[0230]
任选地，在编码neurod1的重组表达载体中包含报告基因。可包含报告基因以产生作为从所述重组表达载体中表达neurod1的替代标记物的肽或蛋白。本文使用的术语“报告基因”是指在表达时可容易被检测到的基因，例如通过化学发光、荧光、比色反应、抗体结合、可诱导标记物和/或配体结合测定。示例性的报告基因包括但不限于绿色荧光蛋白(gfp)、增强的绿色荧光蛋白(egfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、增强的黄色荧光蛋白(eyfp)、青色荧光蛋白(cfp)、增强的青色荧光蛋白(ecfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)、增强的蓝色荧光蛋白(ebfp)、mmgfp(zernicka
‑
goetz et al.,development,124:1133
‑
1137,1997)、dsred、萤光素酶和β
‑
半乳糖苷酶(lacz)。
[0231]
将遗传物质导入受体宿主细胞的过程(例如用于在宿主细胞中瞬时或稳定表达由所述遗传物质编码的所需蛋白)被称为“转染”。转染技术是本领域中公知的，包括但不限于电穿孔、粒子加速转化(也称为“基因枪”技术)、脂质体介导的转染、磷酸钙或氯化钙共沉淀介导的转染、deae
‑
葡聚糖介导的转染、微注射、聚乙二醇介导的转染、热激介导的转染和病毒介导的转染。如本文所述，可使用病毒载体(如衍生自腺病毒、腺伴随病毒和慢病毒的那些)完成病毒介导的转染。
[0232]
任选地，离体转染宿主细胞，然后将其重新导入宿主生物中。例如，可从受试者中取出细胞或组织，用编码neurod1的表达载体转染，然后将其返回至所述受试者。
[0233]
通过多种转染方法中的任何方法可实现将包含编码neurod1的核酸或其功能性片段的重组表达载体在体外或体内导入宿主神经胶质细胞，用于在宿主神经胶质细胞中表达外源neurod1以将神经胶质细胞转化为神经元。
[0234]
在宿主神经胶质细胞中表达外源neurod1以将神经胶质细胞转化为神经元，可任选地通过将编码neurod1的mrna或其功能性片段在体外或体内导入宿主神经胶质细胞来实现。
[0235]
在宿主神经胶质细胞中表达外源neurod1以将神经胶质细胞转化为神经元，可任选地通过将neurod1蛋白在体外或体内导入宿主神经胶质细胞来实现。
[0236]
上述或其他技术的细节是本领域中已知的，例如，如j.sambrook and d.w.russell,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press；3rd ed.,2001；f.m.ausubel,ed.,short protocols in molecular biology,current protocols；5th ed.,2002；和engelke,d.r.,rna interference(rnai):nuts and bolts of rnai technology,dna press llc,eagleville,pa,2003中所述。
[0237]
包括编码neurod1的核酸或其功能性片段、编码neurod1的mrna或其功能性片段，和/或neurod1蛋白(全长或其功能性片段)的表达载体任选地与载体(carrier)结合，以在体外或体内导入至宿主细胞中。
[0238]
在具体的方面中，所述载体是颗粒载体，如脂质颗粒，其包括脂质体、胶束、单层或多层囊泡；聚合物颗粒，如水凝胶颗粒、聚乙醇酸颗粒或聚乳酸颗粒；无机颗粒，如例如美国专利no.5,648,097中所述的磷酸钙颗粒；以及如例如美国专利no.6,630,486中所述的无机/有机颗粒载体。
[0239]
颗粒载体可选自脂质颗粒、聚合物颗粒、无机颗粒和无机/有机颗粒。还可包括多种颗粒类型的混合物作为颗粒状的可药用的载体。
[0240]
一般配制颗粒载体以使得颗粒具有范围为约1nm
‑
10μm的平均颗粒大小(particle size)。在具体的方面，配制颗粒载体以使得颗粒具有范围为约1nm
‑
100nm的平均颗粒大小。
[0241]
对脂质体及其制备和使用方法的其他描述可见于：liposomes:a practical approach(the practical approach series,264),v.p.torchilin and v.weissig(eds.),oxford university press；2nd ed.,2003。纳米颗粒的其他方面记载于s.m.moghimi et al.,faseb j.2005,19,311
‑
30。
[0242]
通过以下方式实现使用重组表达载体进行的neurod1表达：将表达载体导入真核或原核宿主细胞表达系统，如本领域公认的昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或任何其他单细胞或多细胞生物。宿主细胞可任选地为原代细胞或无限增殖化的衍生细胞。无限增殖化的细胞是可在体外维持至少5次复制传代的细胞。
[0243]
在产生neurod1的条件下维持包含重组表达载体的宿主细胞。可使用已知的如celis,julio,ed.,1994,cell biology laboratory handbook,academic press,n.y.中所述的细胞培养技术培养和维持宿主细胞。这些细胞的多种培养条件，包括关于具体营养物、氧气、张力、二氧化碳和降低的血清水平的培养基配方，可由本领域技术人员选择并优化。
[0244]
根据本发明的方面，将包含编码neurod1的核酸的重组表达载体导入受试者的神经胶质细胞中。在神经胶质细胞中表达外源neurod1将神经胶质细胞“转化”为神经元。
[0245]
根据本发明的方面，将包含编码neurod1或其功能性片段的核酸的重组表达载体导入受试者的星形胶质细胞中。在星形胶质细胞中表达外源neurod1将星形胶质细胞“转化”为神经元。
[0246]
根据本发明的方面，将包含编码neurod1的核酸或其功能性片段的重组表达载体导入受试者的反应性星形胶质细胞中。在反应性星形胶质细胞中表达外源neurod1或其功能性片段将反应性星形胶质细胞“转化”为神经元。
[0247]
根据本发明的方面，将包含编码neurod1的核酸或其功能性片段的重组表达载体
导入受试者的ng2细胞中。在ng2细胞中表达外源neurod1或其功能性片段将ng2细胞“转化”为神经元。
[0248]
将包含编码外源neurod1或其功能性片段的核酸的重组表达载体导入以后，对外源neurod1表达的检测可使用多种标准方法中的任何方法来完成，其包括但不限于：检测neurod1的免疫测定、检测neurod1核酸的核酸测定，以及检测与外源neurod1共表达的报告基因。
[0249]
本文使用术语“转化”和“转化的”来描述neurod1或其功能性片段的表达的效果，其导致神经胶质细胞、星形胶质细胞或反应性星形胶质细胞表型变为神经元表型。类似地，本文使用术语“neurod1转化的神经元”和“转化的神经元”来指定包含外源neurod1蛋白或其功能性片段的细胞，其具有随之发生的神经元表型。
[0250]
术语“表型”是指本文所提及细胞的公知的可检测的特征。神经元的表型可以是但不限于以下中的一种或多种：神经元形态、一种或多种神经元标记物的表达、神经元的电生理特征、突触形成和神经递质的释放。例如，神经元表型包括但不限于：神经元的特征性形态特性，例如存在树突、轴突和树突棘；特征性神经元蛋白表达和分布，例如在突触点中存在突触蛋白，在树突中存在map2；以及特征性电生理标志，例如自发性和诱发性突触事件。
[0251]
在其他实施例中，神经胶质细胞表型(如星形胶质细胞表型和反应性星形胶质细胞表型)包括但不限于：星形胶质细胞和反应性星形胶质细胞特征性形态特性，如通常的“星形”形态；以及特征性星形胶质细胞和反应性星形胶质细胞蛋白表达，如存在胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)。
[0252]
术语“neurod1核酸”是指经分离的neurod1核酸分子。
[0253]
术语“核酸”是指具有以下任意形式的多于一个核苷酸的rna或dna分子：包括单链、双链、寡核苷酸或多核苷酸。术语“核苷酸序列”是指单链核酸形式的寡核苷酸或多核苷酸中的核苷酸的排序。
[0254]
术语“neurod1核酸”包括分离的neurod1核酸，其具有与seq id no:1或seq id no:3中所示的dna序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的序列，或其互补物，或其片段；或者分离的dna分子，其具有在高严格杂交条件下与seq id no:1或seq id no:3所示的核酸杂交的序列，或其互补物，或其片段。seq id no:3的核酸是这样的分离的dna分子的实例，即其具有在高严格杂交条件下与seq id no:1所示的核酸杂交的序列。neurod1核酸的片段是可用在包括neurod1核酸的本发明的方面中的neurod1核酸的任何片段。
[0255]
能够与靶neurod1 mrna或cdna杂交的核酸探针或引物可用来检测和/或定量编码neurod1蛋白的mrna或cdna。核酸探针可以是长度至少为10、15、30、50或100个核苷酸的寡核苷酸，且足以在严格条件下与neurod1 mrna或cdna或其互补序列特异性杂交。核酸引物可以是长度至少为10、15或20个核苷酸的寡核苷酸，且足以在严格条件下与所述mrna或cdna或其互补序列特异性杂交。
[0256]
术语“互补物”和“互补”是指核苷酸之间的watson
‑
crick碱基配对，并且具体是指核苷酸彼此氢键合——胸腺嘧啶或尿嘧啶残基与腺嘌呤残基通过两个氢键连接；并且胞嘧啶残基和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。通常，一个核酸包括被描述为与特定的第二核苷酸序列具有“互补性百分比”的核苷酸序列。例如，一个核苷酸序列可与特定的第二核苷酸
序列具有80％、90％或100％的互补性，表明在序列的10个核苷酸中有8、9或10个核苷酸与所述特定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3'
‑
tcga
‑
5'与核苷酸序列5'
‑
agct
‑
3'100％互补。此外，核苷酸序列3'
‑
tcga
‑
与核苷酸序列5'
‑
ttagctgg
‑
3'的一个区域100％互补。
[0257]
术语“杂交”指互补核酸的配对和结合。如本领域所公知的，两个核酸之间发生程度不同的杂交，这取决于诸如核酸的互补程度、核酸的解链温度(t
m
)和杂交条件的严格性的因素。术语“杂交条件的严格性”是指杂交介质的温度、离子强度和组成(针对具体的常用添加剂，例如甲酰胺和denhardt溶液)。针对特定核酸的具体杂交条件的确定是常规的且是本领域中公知的，例如，如j.sambrook and d.w.russell,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press；3rd ed.,2001；和f.m.ausubel,ed.,short protocols in molecular biology,current protocols；5th ed.,2002中所述。高严格杂交条件是仅允许基本上互补的核酸杂交的那些。通常，具有约85
‑
100％互补性的核酸被认为是高度互补的，并在高严格条件下杂交。中等严格条件的实例是这样的条件，在该条件下具有中度互补性(约50
‑
84％互补性)的核酸，以及具有高度互补性的核酸发生杂交。相比之下，低严格杂交条件是在其中具有低互补性程度的核酸发生杂交的条件。
[0258]
术语“特异性杂交”和“特异性地杂交”是指特定的核酸与靶核酸的杂交，而基本上不与样品中非靶核酸的其他核酸杂交。
[0259]
如本领域技术人员所公知的，杂交和洗涤条件的严格性取决于一些因素，包括探针和靶标的t
m
值，以及所述杂交和洗涤条件的离子强度。实现所需杂交严格性的杂交和条件记载于例如sambrook et al.,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,2001；和ausubel,f.et al.,(eds.),short protocols in molecular biology,wiley,2002中。
[0260]
高严格度杂交条件的实例是，在包含6x ssc、5x denhardt溶液、30％甲酰胺和100mg/ml变性的鲑鱼精子的溶液中，长度超过约100个核苷酸的核酸于37℃下过夜杂交，然后在60℃下在0.1x ssc和0.1％sds的溶液中洗涤15分钟。ssc是0.15m nacl/0.015m柠檬酸钠。denhardt溶液是0.02％牛血清白蛋白/0.02％ficoll/0.02％聚乙烯吡咯烷酮。在高严格条件下，seq id no:1和seq id no:3将与基本上相同的靶标的互补序列杂交，但不与非相关序列杂交。
[0261]
治疗神经学病症的方法
[0262]
根据本发明的方面，提供了在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其包括将治疗有效剂量的neurod1递送到所述受试者的中枢神经系统或周围神经系统中的神经胶质细胞；与患有相同神经学病症的未经治疗的受试者相比，神经胶质细胞中的治疗有效剂量的neurod1导致在所述受试者中产生数量更多的神经元，由此所述神经学病症得到治疗。
[0263]
反应性神经胶质细胞向神经元的转化还减少了与反应性神经胶质细胞相关的神经炎症和神经抑制因子，从而使得胶质细胞瘢痕组织更易允许神经元生长以使得神经学病症得到减轻。
[0264]
本文使用的术语“神经学病症”是指受试者中枢和/或周围神经系统的任何病症，其被额外的神经元减轻、改善或预防。导致神经元损失或抑制和/或神经元功能损失或抑制
的损伤或疾病是通过根据本发明方面的方法来治疗的神经学病症。
[0265]
导致谷氨酸能神经元损失或抑制和/或谷氨酸能神经元功能损失或抑制的损伤或疾病是通过根据本发明方面的方法来治疗的神经学病症。其他类型神经元(例如gaba能、胆碱能、多巴胺能、去甲肾上腺素能或血清素能神经元)的损失或抑制可使用类似方法治疗。
[0266]
因此，例如，导致神经元损失或抑制和/或神经元功能损失或抑制的损伤或疾病——其包括但不限于阿兹海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(als)、中风、癫痫、物理损伤(如脑或脊髓损伤)和肿瘤——是通过根据本发明方面的方法来治疗的神经学病症。
[0267]
本文使用的术语“治疗有效剂量”意在指有效减轻、改善或预防待治疗的神经学病症的症状或征象的本发明组合物的量。在具体的实施方案中，治疗有效剂量是对具有神经学病症的征象和/或症状的受试者产生有益效果的量。
[0268]
本文使用的术语“治疗”是指减轻、抑制或改善神经学病症、神经学病症的症状或征象，以及预防神经学病症的症状或征象，其包括但不限于治疗性和/或预防性治疗。
[0269]
神经学病症的征象和症状，以及此类征象和症状的检测和评估方法，是本领域中公知的。
[0270]
根据本发明的方面，提供了在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其包括提供包含编码neurod1的核酸的病毒载体；将所述病毒载体递送到所述受试者的中枢神经系统或周围神经系统，由此所述病毒载体分别感染中枢神经系统或周围神经系统的神经胶质细胞，产生了感染的神经胶质细胞；并且由此外源neurod1在感染的神经胶质细胞中以治疗有效水平被表达，其中与患有相同神经学病症的未经治疗的受试者相比，neurod1在感染的细胞中的表达导致在所述受试者中产生数量更多的神经元，由此所述神经学病症得到治疗。除了产生新神经元，反应性神经胶质细胞的数量也将下降，导致释放的神经抑制因子减少，从而使得局部环境更容易允许神经元生长或轴突穿透，因此减轻了神经学病症。
[0271]
将药物组合物给予受试者的中枢神经系统或周围神经系统是通过包括全身或局部给药的方法来实现。
[0272]
根据本发明的方面，包含编码neurod1的核酸的病毒载体是通过注射被递送到受试者的中枢神经系统或周围神经系统中，例如通过脑内注射、脊髓注射和/或注射进脑脊髓液。其他病毒递送方法包括但不限于静脉注射和腹膜内注射。
[0273]
根据本发明的方面，给予用于受试者的神经学病症的疗法的组合。
[0274]
术语“受试者”是指人类和非人哺乳动物，例如但不限于非人灵长类动物、猫、狗、绵羊、山羊、马、牛、猪和啮齿动物(例如但不限于小鼠和大鼠)；以及非哺乳动物，例如但不限于鸟类、家禽、爬行动物、两栖动物。
[0275]
本发明的组合物和方法的实施方案通过以下实施例进行举例说明。提供这些实施例是为了举例说明的目的，并且不应被认为是对本发明的组合物和方法的范围的限制。
[0276]
实施例
[0277]
实施例1
[0278]
小鼠皮质星形胶质细胞和ng2培养
[0279]
对于星形胶质细胞培养，解离出生后(p3
‑
p5)的小鼠的皮质组织并铺板在25cm2的烧瓶中。培养细胞5
‑
6天，每天剧烈振荡烧瓶以除去神经元和非星形胶质细胞。在到达汇合后，将星形胶质细胞以1000rpm离心5分钟，重悬，并铺板在多聚d
‑
赖氨酸(sigma)包被的盖
玻片(12mm)上。星形胶质细胞培养基包含dmem/f12(gibco)、10％胎牛血清(gibco)、青霉素/链霉素(gibco)、3.5mm葡萄糖(sigma)并补充有b27(gibco)、10ng/ml表皮生长因子(egf,invitrogen)和10ng/ml成纤维细胞生长因子2(fgf2,invitrogen)。
[0280]
对于小鼠ng2培养，解离出生后(p3
‑
p5)小鼠的皮质组织并铺板在包被有多聚
‑
d
‑
赖氨酸(sigma)的25cm2的烧瓶中。细胞在具有10％胎牛血清(gibco)的dmem/f12(gibco)中培养9天，每3天更换培养基。在第9天，剧烈振荡烧瓶并收集上清，离心收集ng2细胞，具有少量神经元和小胶质细胞。离心后，重悬细胞并接种在多聚
‑
d
‑
赖氨酸(sigma)包被的盖玻片(12mm)上。在含有n2补充剂(stemcelltm)、10ng/ml血小板衍生生长因子(pdgf,invitrogen)、10ng/ml表皮生长因子(egf,invitrogen)和10ng/ml成纤维细胞生长因子2(fgf2,invitrogen)的无血清dmem培养基(gibco)中培养细胞3天。在37℃下在含5％co2的潮湿空气中培养细胞。小鼠神经元培养与wu,x.et al.,j.biol.chem.,287(33):27417
‑
27430,2012中所述的相同。
[0281]
实施例2
[0282]
人皮质星形胶质细胞培养和小胶质细胞培养
[0283]
人皮质星形胶质细胞(ha 1800)购自sciencell(美国加州)。当细胞超过90％汇合时，对其进行继代培养。对于继代培养，通过trypletmselect(invitrogen)将细胞进行胰蛋白酶消化，并以1000rpm离心5分钟，重悬，铺板于培养基上——该培养基由dmem/f12(gibco)、10％胎牛血清(gibco)、青霉素/链霉素(gibco)、3.5mm葡萄糖(sigma)组成，并补充有b27(gibco)、10ng/ml表皮生长因子(egf,invitrogen)和10ng/ml成纤维细胞生长因子2(fgf2,invitrogen)。在24孔板(bd biosciences)中，以密度为50,000个细胞/盖玻片在多聚
‑
d
‑
赖氨酸(sigma)包被的盖玻片(12mm)上培养星形胶质细胞。人原代小胶质细胞获自clonexpress inc.(美国马里兰州)。在补充有5％fbs、10ng/ml巨噬细胞集落刺激因子(m
‑
csf,invitrogen)、10ng/ml表皮生长因子(egf,invitrogen)和10ng/ml成纤维细胞生长因子2(fgf2,invitrogen)的dmem/f
‑
12(gibco)中培养细胞。在37℃下在含5％co2的潮湿空气中培养细胞。
[0284]
实施例3
[0285]
逆转录病毒生产
[0286]
从zhou,q.et al.,nature 455(7213):627
‑
632,2008中所述的pad neurod
‑
i
‑
ngfp构建体(addgene)中亚克隆小鼠neurod1基因，并将其插入到zhao,c.et al.,j.neurosci.,26(1):3
‑
11,2006中所述的逆转录病毒载体pcag
‑
gfp
‑
ires
‑
gfp逆转录病毒载体中以生成pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp逆转录病毒载体。
[0287]
cag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp的序列在本文如seq id no:9所示。对照逆转录病毒构建体pcag
‑
gfp编码gfp但不编码neurod1。
[0288]
从hgfap promoter
‑
cre
‑
mp
‑
1(addgene)中亚克隆人gfap启动子基因，并替换cag启动子以生成pgfap
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp和pgfap
‑
gfp
‑
ires
‑
gfp逆转录病毒载体。
[0289]
亚克隆人ng2启动子并替换cag启动子，以生成hng2
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp和hng2
‑
gfp
‑
ires
–
gfp逆转录病毒载体。
[0290]
亚克隆小鼠lcn2启动子并替换cag启动子，以生成mlcn2
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp和mlcn2
‑
gfp
‑
ires
‑
gfp逆转录病毒载体。在损伤后，反应性神经胶质细胞通常具有炎症标记
物lcn2的高表达。
[0291]
亚克隆小鼠aldh1l1启动子并替换cag启动子，以生成maldh1l1
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp和maldh1l1
‑
gfp
‑
ires
‑
gfp逆转录病毒载体。反应性神经胶质细胞通常具有aldh1l1的高表达。
[0292]
由于表达neurod1而不表达gfp，所以不包含编码gfp的核酸。类似地，当仅表达neurod1时，所述构建体中不需要包含ires。
[0293]
在gpg无辅助hek(人胚胎肾)细胞中包装病毒粒子以生成vsv
‑
g(水疱性口炎病毒糖蛋白)
‑
假型逆转录病毒，其在cellmax
tm
中空纤维细胞培养系统中编码神经源因子(spectrum laboratories)。在hek细胞转导后确定病毒颗粒的滴度为约108个颗粒/μl。
[0294]
实施例4
[0295]
神经胶质细胞向神经元的转分化
[0296]
在用gfp或neurod1逆转录病毒感染星形胶质细胞、ng2细胞或小胶质细胞之后24小时，将培养基完全替换为分化培养基，所述分化培养基包含dmem/f12(gibco)、0.5％fbs(gibco)、3.5mm葡萄糖(sigma)、青霉素/链霉素(gibco)和n2补充剂(gibco)。在分化过程中，每4天在培养基中添加脑源性神经营养因子(bdnf,20ng/ml,invitrogen)以促进突触成熟，如song,h.et al.,nature,417(6884):39
‑
44,2002中所述。由于在转化过程中从星形胶质细胞或ng2细胞到神经元的形态变化，用额外的人或小鼠星形胶质细胞填充空白空间以支持转化的神经元的功能发育。
[0297]
实施例5
[0298]
间隙连接测定
[0299]
将磺酰罗丹明b(srb，558da，2mm)添加到电极液(pipette solution)中以用于染料透析到细胞中。对被neurod1
‑
gfp感染的新转化的神经元进行全细胞记录(1
‑
3dpi)，染料透析持续20分钟。在40x物镜下观察染料扩散。为了阻断间隙连接，在分化培养基中加入甘珀酸(cbx,100μμ,sigma)并且每2天更换。为了在星形胶质细胞培养物中诱导细胞死亡，用100μμlps处理细胞6小时。
[0300]
实施例6
[0301]
动物和体内测定
[0302]
在野生型c57/bl6和阿兹海默病的5xfad转基因小鼠模型(在本文中称为“ad转基因小鼠”)上进行体内实验。ad转基因小鼠购自jackson实验室(b6sjl
‑
tg(appswfllon,psenl*m146l*l286v)6799vas/mmjax)，其记载于oakley,h.et al.,j.neurosci.,26(40):10129
‑
10140,2006，并且与c57/bl6小鼠交配。小鼠被安置在12小时光/暗循环中，并提供足够的食物和水。
[0303]
实施例7
[0304]
立体定向病毒注射(stereotaxic viral injection)
[0305]
对1、5
‑
7、14月龄的野生型小鼠和5
‑
7、14月龄的ad小鼠实施手术，以进行病毒注射或单纯穿刺损伤。通过向腹膜内注射20ml/kg2.5％阿佛丁(25mg/ml三溴乙基乙醇和25μl/ml叔戊醇的混合物)麻醉小鼠，然后将其放置于立体定位装置。施用人工眼膏以覆盖和保护眼部。通过沿头皮中线切开，并在躯体感觉皮质上方的颅骨上钻孔对所述动物进行手术。使用5μl注射器和34号针头使每只小鼠接受病毒注射(部位：ap 1.25mm,ml 1.4mm,dv
‑
1.5mm)。将注射体积和流速控制在以0.2μl/min进行3μl，并且在注射过程中将针头以0.1mm/min的速度向上移动。注射后，将针头再保持至少5分钟，然后缓慢拔出。所述针头注射本身被用作穿刺损伤模型。
[0306]
实施例8
[0307]
免疫细胞化学
[0308]
对于脑切片染色，用2.5％阿佛丁麻醉小鼠，然后依次灌注，首先用盐水溶液(0.9％nacl)洗掉血液，然后用4％多聚甲醛(pfa)固定脑。将脑移出并在4％pfa中于4℃下后固定过夜，然后用振动切片机(leica)切成45μm切片。为分析血管区域，在固定后用10kd赖氨酸可固定的葡聚糖
‑
德克萨斯红(lysine fixable dextran
‑
tr，invitrogen，0.5ml，10mg/ml)灌注动物。首先将冠状脑切片在含0.3％triton x
‑
100的磷酸缓冲盐溶液(pbs,ph 7.4)中预处理1小时，然后在溶于pbs的3％正常山羊血清、2％正常驴血清和0.1％triton x
‑
100中孵育1小时。
[0309]
对于细胞培养物染色，在室温下将培养物在溶于pbs的4％pfa中固定15分钟。首先用pbs洗涤细胞3次，然后在溶于pbs的0.1％triton x
‑
100中预处理30分钟，然后在溶于pbs的3％正常山羊血清、2％正常驴血清和0.1％triton x
‑
100中孵育1小时。将一级抗体与脑切片或细胞培养物在溶于pbs的3％正常山羊血清、2％正常驴血清和0.1％triton x
‑
100中于4℃下过夜孵育。在pbs中再次洗涤之后，将样品与适合的二级抗体——其与alexa fluor 488、alexa 546、alexa 647(1:300，molecular probes)、fitc、tritc或dylight(1:500，jackson immunoresearch)缀合——在室温下孵育1小时，然后在pbs中充分洗涤。最后使用含dapi的抗衰减固定液(anti
‑
fading mouting solution invitrogen)将盖玻片固定(mount)在载玻片上。首先用落射荧光显微镜(nikon te
‑
2000
‑
s)检查载玻片，然后用共聚焦显微镜(olympus fv1000)分析。利用fv10
‑
asw 3.0viewer软件(olympus)获得并分析数字图像的z轴叠加(z
‑
stack)，其能够释放单张共聚焦图像或叠加为一张结果照片。
[0310]
使用了以下一级抗体：抗绿色荧光蛋白的多克隆抗体(gfp，鸡，1:1000,abeam，ab 13970)、抗胶质细胞原纤维酸性蛋白的多克隆抗体(gfap，兔，1:500，abeam，z0334)、抗胶质细胞原纤维酸性蛋白的多克隆抗体(gfap，鸡，1:500，millipore，ab5541)、抗s100β的单克隆抗体(小鼠，1:500，abeam，ab66028)、抗红色荧光蛋白的单克隆抗体(rfp，小鼠，1:300，cell biolabs)、抗红色荧光蛋白的多克隆抗体(rfp，兔，1:2000，rockland)、抗囊泡型谷氨酸转运蛋白1的多克隆抗体(vglut1，兔，1:500，synaptic systems)、抗囊泡型谷氨酸转运蛋白的多克隆抗体(sv2，兔，1:2000，developmental studies hybridoma bank，艾奥瓦市)、抗微管相关蛋白2的多克隆抗体(map2，鸡，1:1000，abeam，ab5392)、抗微管相关蛋白2的多克隆抗体(map2，兔，1:500，chemicon，ab5622)、抗t
‑
box脑蛋白1(t
‑
box,brain,1)的多克隆抗体(tbr1，1:300，兔，abeam，ab31940)、抗prox1的多克隆抗体(兔，1:1000，reliatech gmbh，102
‑
pa32)、抗musashi
‑
1的多克隆抗体(兔，1:300，neuromics，ra14128)、抗sry(性别决定区y)
‑
box2的单克隆抗体(sox
‑
2，小鼠，1:300，abeam，ab79351)、抗sry(性别决定区y)
‑
box2的多克隆抗体(sox
‑
2，兔，1:500，millipore，ab5603)、抗gad6的单克隆抗体、抗βιιι微管蛋白的单克隆抗体(tuj1，小鼠，1:500，covance，mms
‑
435p)、抗双皮质素的多克隆抗体(dcx，兔，1:500，abeam，ab18723)、抗β
‑
淀粉样蛋白的单克隆抗体(αβ，小鼠，1:200，abeam，ab11132)、抗β
‑
淀粉样蛋白1
‑
42的单克隆抗体(兔，1:1000，invitrogen，700524)、抗apoe
[d6e10]的单克隆抗体(小鼠，1:200，abeam，ab1906)、抗neun的多克隆抗体(兔，1:500，millipore，abn78)、抗ng2的单克隆抗体(小鼠，1:200、abeam、ab50009)、抗iba1的多克隆抗体(山羊，1:200，abeam，ab5076)、抗iba1的多克隆抗体(兔，1:1000，wako，019
‑
19741)、抗cnpase的单克隆抗体(小鼠，1:200，abeam，ab6319)、抗硫酸软骨素蛋白多糖的单克隆抗体(cspg，1:200，小鼠，sigma，c8035)、抗血管内皮生长因子的单克隆抗体(vegf，1:500，小鼠，abeam，ab1316)、抗全轴突神经丝蛋白标记物(pan
‑
axonal neurofilament marker)的单克隆抗体(smi 312，1:1000，小鼠，covance，smi
‑
312r)、抗胶质细胞谷氨酸转运蛋白glt
‑
1的多克隆抗体(eaat2)(glt1，豚鼠，1:2000，millipore，ab1783)、抗连接蛋白43的多克隆抗体(cx43，兔，1:1000，abeam，ab 11370)、抗brdu的单克隆抗体(小鼠，1:500，dako，074401
‑
8)、抗neurod1的单克隆抗体(小鼠，1:1000，abeam，ab60704)、抗mbp的多克隆抗体(兔，1:300，millipore，ab908)、抗gaba的多克隆抗体(兔，1:2000，sigma，a2052)和抗谷氨酸的单克隆抗体(小鼠，1:500，sigma，g9282)。
[0311]
实施例9
[0312]
brdu免疫组织化学
[0313]
从损伤后第2天(2dpi)到损伤后4dpi，连续3天通过腹膜内注射将100mg/kg brdu(5
‑
溴
‑2‑
脱氧尿苷；invitrogen)给予穿刺损伤的小鼠。在4dpi或损伤后1个月对小鼠处以安乐死。将漂浮的脑切片(floating brain section)在85
‑
90℃的ix柠檬酸缓冲液(sigma#c9999)中浸泡15分钟，并冷却至室温，持续20分钟。用pbs洗涤3次之后，将脑切片用2m hcl在37℃下处理20分钟并用pbs洗涤6次。然后，将脑切片用溶于pbs中的0.3％triton在室温下透化2小时，并在室温下于封闭缓冲液(溶于pbs中的2.5％正常驴血清、2.5％正常山羊血清、0.1％triton)中封闭1小时。在4℃下，将切片在一级brdu抗体(dako，1:500)中孵育过夜。
[0314]
实施例10
[0315]
tunel测定
[0316]
使用漂浮的脑切片或固定的细胞培养物进行tunel测定，以检测凋亡的细胞。根据生产商的说明书，使用原位细胞死亡检测试剂盒(roche，laval，quebec，canada)。简言之，将酶溶液和标记溶液以1:9混合以获得tunel反应混合物。将脑切片与tunel反应混合物在37℃下孵育1小时。孵育之后，用pbs漂洗脑切片3次。使用570
‑
620nm的检测波长在荧光显微镜下检测tunel信号。
[0317]
实施例11
[0318]
细胞培养物中的膜片钳记录
[0319]
对于neurod1转化的神经元，如deng,l.et al.,j.neurosci.,27(40):10860
‑
10869,2007中所述，利用multiclamp 700a膜片钳放大器(moleculardevices，paloalto，ca)进行全细胞记录，并用浴液——由128mm nacl、30mm葡萄糖、25mm hepes、5mm kcl、2mm cacl2和1mm mgcl2组成——持续灌注腔室。用naoh将浴液的ph调至7.3，摩尔渗透压浓度为315
‑
325mosm/l。从硼硅酸盐玻璃(4
‑
5μω)中拉出膜片电极(patch pipette)，使其充满电极液(由135mm kcl(或10mm kcl+125mm葡萄糖酸钾)、5mm磷酸肌酸钠、10mm hepes、2mm egta、4mm mgatp和0.5mm na2gtp组成，用koh将ph调节至7.3)。为了区分epsc和ipsc，还使用了0mm cl
‑
(135mm葡萄糖酸钾)电极液。串联电阻通常为10
‑
25μω。对于电压钳实验，膜
电位通常保持在
‑
70或
‑
80mv。通过重力驱动的药物递送系统(vc
‑
6,warner hamden,ct)施用药物。在加入10μμ甘氨酸、0.5μμttx和20μμbic的无mg2
+
的浴液(128mm nacl、30mm d
‑
葡萄糖、25mm hepes、5mm kc1和2mm cacl2，用naoh将ph调至7.3)中记录nmda电流。利用pclamp 9软件(moleculardevices，paloalto，ca)获取数据，在10khz下取样并在1khz下过滤。利用pclamp 9clampfit软件分析na
+
和k
+
电流和动作电位。利用minianalysis软件(synaptosoft，decator，ga)分析自发性突触事件。所有实验均在室温下进行。
[0320]
实施例12
[0321]
脑切片记录
[0322]
通常在病毒注射后1个月制备皮质切片，使用leica振动切片机在冰冷的切片溶液(含有75mm蔗糖、87mm nacl、2.5mm kc1、0.5mm cacl2、7mm mgcl2、25mm nahco3、1.25mm nah2po4和20mm葡萄糖)中切成300μm厚的冠状切片。在含有119mm nacl、2.5mm kc1、1.25mm nah2po4、26mm nahco3、1.3mm mgcl2、2.5mm cacl2和10mm葡萄糖的人工脑脊髓液(acsf)中保存切片。在acsf中孵育切片，持续通入95％o2和5％co2，首先在34℃进行30分钟，然后在室温下进行。使用含有135mm葡萄糖酸钾、5mm磷酸肌酸钠、10mm hepes、2mm egta、4mm mgatp和0.5mm na2gtp的电极液(用koh将ph调节至7.3，290mosm/l)进行全细胞记录。电极电阻为3
‑
4μω，串联电阻通常为20
‑
40μω。电压钳实验的保持电位为
‑
70mv。利用pclamp 9软件(moleculardevices，paloalto，ca)收集数据，在10khz下取样并在1khz下过滤，利用clampfit和synaptosoft软件分析。
[0323]
实施例13
[0324]
数据分析
[0325]
通过对每个盖玻片的几个随机选取的视图拍照进行细胞计数并通过image j软件进行分析。通过image j软件分析强度或像素区域。数据以平均值
±
sem表示。使用学生t检验(成对或不成对)进行统计学分析。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
[0326]
实施例14
[0327]
脑损伤后反应性星形胶质细胞和ng2细胞在体内转化为功能性神经元
[0328]
将仅编码gfp的对照逆转录病毒注射到小鼠的皮质，显示出在注射后14天(dpi)时的损伤部位处的gfap阳性反应性星形胶质细胞。52.1
±
4.3％的gfp阳性细胞是gfap阳性的(n＝3只动物)，参见图1a和图5a。图1a示出了代表性图像，其说明了左图中的gfp荧光，中图中所示的相同视场中的gfap免疫荧光，以及右图中所示的相同视场中的gfp荧光和gfap免疫荧光的重叠，比例尺为20μm。
[0329]
被同时编码neurod1和gfp的逆转录病毒构建体感染的细胞在7dpi时表现出广泛的神经突，并且对神经元标记物neun是免疫阳性的，参见图1b和图5b
‑
d；n＝6只动物。图1b示出了代表性图像，其说明了左图中的neurod1
‑
gfp荧光，中图中所示的相同视场中的neun免疫荧光，以及右图中所示的相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光和neun免疫荧光的重叠，比例尺为20μm。在本文的实施例中使用的术语“neurod1
‑
gfp荧光”指在感染了同时编码neurod1和gfp的逆转录病毒构建体的细胞中检测到的gfp荧光，因此所述gfp荧光是neurod1表达的替代标记物。在具体情况下，neurod1的表达是通过neurod1抗体测定独立验证，其实例如本文所述或所示。值得注意的是，在用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染后损伤部位处的大量neun阳性神经元。
[0330]
在将编码人gfap启动子控制下的neurod1的逆转录病毒(称为hgfap::neurod1
‑
ires
‑
gfp)注射到成年小鼠皮质(其通常没有成体神经干细胞)之后，发现neurod1感染的细胞具有明显的神经元形态并且对neun呈免疫阳性，参见图1c；n＝3只动物。在其中产生gfap启动子
‑
驱动的neurod1和gfp的感染了hgfap::neurod1
‑
ires
–
gfp的细胞在7dpi时对neun呈免疫阳性并且延伸出较长的神经突。图1c示出了代表性图像，其说明了左图中的gfap启动子
‑
驱动的neurod1
‑
gfp荧光，中图中所示的相同视场中的neun免疫荧光，以及右图中所示的相同视场中的gfap启动子驱动的neurod1
‑
gfp荧光和neun免疫荧光的重叠，比例尺为40μm。相比之下，注射编码gfp但不编码neurod1的对照病毒hgfap::gfp未导致任何神经元转化，参见图5e；n＝3只动物。
[0331]
除了反应性星形胶质细胞，脑损伤还激活了其他两种类型的反应性神经胶质细胞——ng2细胞和小胶质细胞。星形胶质细胞和ng2细胞都起源于神经干细胞系，而小胶质细胞由造血干细胞产生并通过血管渗透进入脑。发现一小部分(4.7
±
2％，n＝7只动物)被逆转录病毒载体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp新感染的细胞(即在2dpi时)同时对ng2和双皮质素(dcx，一种未成熟神经元的标记物)呈免疫阳性。图1d示出了在2dpi时的代表性图像，其说明了左图中的neurod1
‑
gfp荧光，中图中所示的相同视场中的ng2免疫荧光，以及右图中所示的dcx免疫荧光，比例尺为20μm。
[0332]
在21dpi之后，脑损伤后体内neurod1转化的神经元是neun阳性的并且表现出强健的树突和潜在的轴突。图1e示出了代表性图像，其说明了左图中的neurod1
‑
gfp荧光；中图中所示的相同视场中的neun免疫荧光；右图中所示的相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光和neun免疫荧光的重叠。neurod1转化的神经元被显示是neun阳性的(箭簇)，其具有强健的树突，箭头所示为潜在的轴突，比例尺为20μm。
[0333]
发现neurod1转化的神经元是功能性的。在用逆转录病毒pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的细胞——其在荧光显微镜下被鉴定为绿色——上进行皮质切片记录。neurod1转化的神经元表现出较大的na电流(3840+302pa，n＝5)和k电流(4672+602pa，n＝5)。图1f示出了来自皮质切片记录的代表性迹线，其显示了在30dpi时在neurod1转化的神经元中的na
+
和k
+
电流。发现neurod1转化的神经元能够激发重复动作电位(n＝4)。图1g示出了来自皮质切片记录的代表性迹线，其显示了在30dpi时在neurod1转化的神经元中的重复动作电位。此外，在25
‑
31dpi时的皮质切片记录中记录了neurod1转化的神经元中的强烈自发性突触事件——频率1.96
±
0.43hz；振幅23.7
±
2.0pa；n＝8，表明其已经被功能性地纳入到现有神经回路中。图1h示出了代表性迹线，其显示了在26dpi时在皮质切片记录中neurod1转化的神经元中的自发性突触事件(cnqx，10μμ；bic，20μμ)。图1i示出了图1h中突触事件的放大视图。
[0334]
实施例15
[0335]
脑损伤后反应性星形胶质细胞和ng2细胞转化为功能性神经元的有益效果
[0336]
检测了反应性神经胶质细胞
‑
神经元的转化对损伤区域的影响。与用逆转录病毒构建体pcag
‑
gfp感染的对照区域相比，用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的损伤区域的轴突纤维显著增多。与损伤部位处新神经元的产生相一致，与用gfp对照载体感染的区域相比，用逆转录病毒载体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的区域中被smi312标记的轴突纤维显著增多，n＝9只动物。图2a示出了代表性图像，其说明了在12
‑
16dpi时在感染
了仅编码gfp的逆转录病毒构建体的细胞中的gfp荧光(左上图)，或在用逆转录病毒载体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的细胞中的gfp荧光(左下图)。相应的中上图和中下图示出了在相同视场中smi 312免疫荧光标记轴突。相应的右图示出了在相同视场中的gfp荧光和smi 312免疫荧光的重叠，比例尺为20μm。图2b是示出了在用逆转录病毒载体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的损伤区域中对轴突纤维进行定量的结果的图表，表明了neurod1诱导的转化，与用pcag
‑
gfp感染的对照损伤区域相比，用编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体感染的损伤区域中的轴突纤维显著增加(n＝9)。
[0337]
在neurod1诱导的转化之后，神经胶质细胞分泌的cspg显著降低(n＝9只动物)。图2c示出了代表性图像，其说明了在12
‑
16dpi时在感染了仅编码gfp的逆转录病毒构建体的细胞中的gfp荧光(左上图)，或在感染了逆转录病毒载体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp的细胞中的gfp荧光(左下图)。相应的中上图和中下图示出了在相同视场中的cspg免疫荧光。对应的右图示出了相同视场中的gfp荧光和cspg免疫荧光的重叠，比例尺为20μm。图2d是示出了在用逆转录病毒载体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的损伤区域中对cspg进行定量的结果的图表，表明了neurod1诱导的转化，与用仅编码gfp的逆转录病毒构建体感染的对照损伤区域相比，用逆转录病毒载体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的损伤区域中的cspg显著降低(n＝9)。
[0338]
相比之下，与gfp对照组相比，用逆转录病毒载体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的区域中被葡聚糖
‑
德克萨斯红标记的血管明显增多(n＝6只动物)。图2e示出了代表性图像，其说明了在12
‑
16dpi时在用仅编码gfp的逆转录病毒构建体感染的细胞中的gfp荧光(左上图)，或在用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的细胞中的gfp荧光(左下图)。对应的中上图和中下图示出了相同视场中的葡聚糖
‑
德克萨斯红(dextran
‑
tr)荧光标记的血管。对应的右图示出了相同视场中的gfp荧光和dextran
‑
tr荧光的重叠，比例尺为20μm。图2f是示出了在用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的损伤区域中对血管面积进行定量结果，表明了neurod1诱导的转化，与用仅编码gfp的逆转录病毒构建体感染的对照损伤区域相比，用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的损伤区域中的血管面积明显增大(n＝6)。
[0339]
在转化的早期阶段，在2dpi时，用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的某些细胞表现出较弱但清晰的gfap表达(箭头处)。在2dpi时，在星形胶质细胞和新转化的神经元之间检测到间隙连接。图2g示出了代表性图像，其说明了左图中的neurod1
‑
gfp荧光，中间左图中所示的相同视场中的gfap免疫荧光(箭头)，中间右图所示的相同视场中的cx43免疫荧光(箭簇)，以及右图所示的相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光、gfap免疫荧光和cx43免疫荧光的重叠，比例尺为10μm。
[0340]
实施例16
[0341]
neurod1在体内在ad小鼠脑中将反应性星形胶质细胞和ng2细胞转化为功能性神经元(neurod1转化的神经元)
[0342]
已在阿兹海默病患者或动物模型的皮质中广泛报道了反应性星形胶质细胞，参见steele,m.l.et al.,neurobiol.aging,33(2):423e421
‑
413,2010；和rodriguez,j.j.et al.,cell death differ.,16(3):378
‑
385,2009。在本实施例中使用了oakley,h.et al.,j.neurosci.,26(40):10129
‑
10140,2006中所述的具有ad、5xfad的转基因小鼠模型以检测
在ad脑中的反应性星形胶质细胞是否能够被转化为功能性神经元。已获得确认的是，与wt小鼠相比，5xfad小鼠(5月龄)的皮质中确实存在许多反应性星形胶质细胞。图3a示出了代表性图像，其说明了左图中的野生型小鼠皮质中的gfap免疫荧光，中图中所示的5xfad小鼠皮质中的gfap免疫荧光，以及右图中所示的5xfad小鼠皮质中的gfap免疫荧光和相同视场中的硫磺素
‑
s免疫荧光的重叠，比例尺为20μm。硫磺素
‑
s标记aβ斑块。与野生型小鼠皮质相比，5xfad小鼠皮质中的反应性星形胶质细胞(被gfap标记)明显增多。
[0343]
将逆转录病毒pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp注射到5xfad小鼠皮质中，随后在ad脑中发现neun阳性的类神经元细胞。在ad小鼠皮质(7月龄的5xfad小鼠皮质)中在14dpi时用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的细胞表现出清晰的类神经元形态和neun染色。图3b示出了在14dpi时的代表性图像，其说明了左图中的7月龄的5xfad小鼠皮质中的neurod1
‑
gfp荧光，中图中所示的相同视场中的neun免疫荧光，以及右图中所示的相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光和neun免疫荧光的重叠，比例尺为40μm。
[0344]
由人gfap启动子驱动的编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体hgfap::neurod1
‑
gfp被用来特异性感染星形胶质细胞。随后在ad脑中观察到被neun标记的neurod1转化的神经元。被编码gfap启动子
‑
驱动的neurod1
‑
gfp的逆转录病毒感染的ad皮质(5xfad小鼠皮质)在7dpi时表现出神经元形态和neun标记。图3c示出了代表性图像，其说明了左图中的5xfad小鼠皮质中的gfap启动子驱动的neurod1
‑
gfp荧光，中图中所示的相同视场中的neun免疫荧光，以及右图中所示的相同视场中的gfap启动子
‑
驱动的neurod1
‑
gfp荧光和neun免疫荧光的重叠，比例尺为20μm。
[0345]
ad脑中的neurod1转化的神经元受到谷氨酸能(vglut1免疫阳性)末梢和gaba能(gad65免疫阳性)末稍的神经支配。图3d示出了代表性图像，其说明了上图中的5xfad小鼠皮质中的neurod1
‑
gfp荧光，以及下图中所示的相同视场中的vglut1免疫荧光(箭簇)，比例尺为5μm。图3e示出了代表性图像，其说明了上图中的与图3d在相同视场下的5xfad小鼠皮质中的gad65免疫荧光(箭头)，以及下图中所示的相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光、vglut1免疫荧光和gad65免疫荧光的重叠，比例尺为5μm。
[0346]
皮质切片记录证明，ad脑中的neurod1转化的神经元是功能性的，i
na
和i
k
的峰值振幅为2270
±
282pa(n＝5)和5498
±
706pa(n＝5)。图3f示出了在ad皮质切片(5xfad小鼠皮质)中，使用编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体在28dpi时neurod1转化的神经元的na和k电流的代表性迹线。
[0347]
记录了neurod1转化的神经元中的自发性突触事件；频率2.80
±
0.95hz，振幅20.5
±
2.7pa，n＝7，表明这些新转化的神经元已被整合到神经回路中。图3g示出了在ad皮质切片(5xfad小鼠皮质)中，使用编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体在28dpi时从neurod1转化的神经元中记录的自发性突触事件的代表性迹线。所有的突触事件被ampa/红藻氨酸盐受体阻断剂cnqx(10μμ)和gaba
a
受体阻断剂bic(20μμ)的混合物阻断。图3h表示图3g中所示的2个突触事件的放大视图。
[0348]
检查了通过neurod1将反应性神经胶质细胞转化为神经元对ad脑的有益效果。
[0349]
αβ1
‑
42免疫染色表明，与gfp对照相比，neurod1转化的区域中的αβ沉淀物明显减少。在用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的5xfad小鼠皮质区域中，αβ沉淀物减少(n＝8)。图3i示出了代表性图像，其说明了在15
‑
17dpi时在用仅编码gfp的逆转录
病毒构建体感染的细胞中的gfp荧光(左上图)，或在用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的细胞中的neurod1
‑
gfp荧光(左下图)。相应的中上图和中下图示出了相同视场中的αβ42免疫荧光。相应的右图示出了相同视场中的gfp荧光或neurod1
‑
gfp荧光与αβ42免疫荧光的重叠，比例尺为100μm。
[0350]
在neurod1感染后，ad皮质中的apoe信号也明显下降，参见图3j，其在图3m中被定量。在用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的5xfad小鼠皮质区域中，apoe信号下降，n＝8。图3j示出了代表性图像，其说明了在15
‑
17dpi时在用仅编码gfp的逆转录病毒构建体感染的细胞中的gfp荧光(左上图)，或在用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的细胞中的neurod1
‑
gfp荧光(左下图)。相应的中上图和中下图示出了相同视场中的apoe免疫荧光。相应的右图示出了相同视场中的gfp荧光或neurod1
‑
gfp荧光与apoe免疫荧光的重叠，比例尺为100μm。
[0351]
值得注意的是，星形胶质细胞谷氨酸转运蛋白glt1——其通常在损伤或疾病之后减少——在neurod1转化的区域中明显增多，参见图3k，其在图3n中被定量。在用编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体感染的5xfad小鼠皮质区域中，星形胶质细胞谷氨酸转运蛋白glt1增多，n＝7。图3k示出了代表性图像，其说明了在15
‑
17dpi时在用仅编码gfp的逆转录病毒构建体感染的细胞中的gfp荧光(左上图)，或在用编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体感染的细胞中的neurod1
‑
gfp荧光(左下图)。相应的中上图和中下图示出了相同视场中的glt1免疫荧光。相应的右图示出了相同视场中的gfp荧光或neurod1
‑
gfp荧光与glt1免疫荧光的重叠，比例尺为40μm。
[0352]
图3l是示出了在15
‑
17dpi时在用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的5xfad小鼠皮质区域中对αβ进行定量的结果的图表，表明neurod1诱导的转化，与用仅编码gfp的逆转录病毒构建体感染的对照损伤区域相比，用编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体感染的损伤区域中的αβ明显减少，n＝8。
[0353]
图3m是示出了在15
‑
17dpi时在用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的5xfad小鼠皮质区域中对apoe进行定量的结果的图表，表明neurod1诱导的转化，与用仅编码gfp的逆转录病毒构建体感染的对照损伤区域相比，用编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体感染的损伤区域中的apoe明显减少，n＝8。
[0354]
图3n是示出了在15
‑
17dpi时在用编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体感染的5xfad小鼠皮质区域中对glt1进行定量的结果，表明neurod1诱导的转化，与用仅编码gfp的逆转录病毒构建体感染的对照损伤区域相比，用编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体感染的损伤区域中的glt1明显增多，n＝8。
[0355]
实施例17
[0356]
所培养的人星形胶质细胞向功能性神经元的直接转化
[0357]
用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染人皮质星形胶质细胞(sciencell，california)的体外培养物。所述培养的人星形胶质细胞大多数对s100β是免疫阳性的(94.3
±
0.7％，n＝12)，并且对ng2而言很少被染色。图4a是代表性的免疫荧光图像，其示出了大多数所培养的人星形胶质细胞被s100β抗体免疫标记，比例尺为50μm。
[0358]
逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp的感染明显将细胞形态从星形胶质细胞改变为神经元。图4b是一对代表性的相差图像，其示出了使用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp，在45dpi时neurod1诱导的从星形胶质细胞(左)到神经元(右)的形态变化，比例尺为20μm。
[0359]
在neurod1感染之后，大多数细胞变成对神经元标记物map2呈免疫阳性。图4c示出了代表性图像，其说明了在30dpi时在用逆转录病毒构建体pcag
‑
neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的人星形胶质细胞中的gfp荧光(左上图)，在相同视场中转化为map2阳性神经元(中图)，以及左图和中图的重叠，还示出了dapi荧光，比例尺为50μm。
[0360]
用编码在人gfap启动子控制下的neurod1的逆转录病毒gfap::neurod1
‑
ires
‑
gfp感染所培养的人星形胶质细胞，导致大多数neurod1感染的细胞转化为neun阳性神经元。图4d示出了代表性图像，其说明了在12dpi时在用编码gfap启动子
‑
驱动的neurod1
‑
gfp的逆转录病毒构建体感染的人星形胶质细胞中的gfp荧光(左图)，并示出了感染的人星形胶质细胞还对neun是免疫阳性的(相同视场，右图)，比例尺为40μm。
[0361]
在数量上，在所有用gfap::neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的人星形胶质细胞中(n＝976，4次独立重复)，约95.4
±
1％细胞被转化为神经元(neun阳性)。
[0362]
用编码neurod1的逆转录病毒感染人星形胶质细胞之后的24小时到5天内，检查随着外源neurod1的表达而从人星形胶质细胞转化为神经元的转分化过程。在早期转化过程中，神经干细胞标记物sox2或musashi的表达水平未出现瞬时升高。图4e示出了代表性图像，其说明了通过表达编码neurod1的逆转录病毒构建体将外源neurod1引入星形胶质细胞，使人星形胶质细胞直接转化为神经元，而不需要经过sox2阳性神经前体细胞阶段的过渡。在neurod1感染仅1
‑
3天之后，某些星形胶质细胞已经变为具有清楚的延伸神经突的类神经元细胞(图4e，箭头处)。星形胶质细胞通常具有低水平的sox2表达，但用gfap::neurod1
‑
ires
‑
gfp感染的星形胶质细胞(箭头处)没有sox2信号。细胞核的dapi染色示出了成像视场中的细胞总量。左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图示出了sox2免疫荧光，以及右图示出了相同视场中的neurod1
‑
gfp荧光、sox2免疫荧光和dapi荧光的重叠，比例尺为20μm。
[0363]
通过gfap::neurod1
‑
ires
‑
gfp的感染来表达外源neurod1而被转化为神经元的人星形胶质细胞对谷氨酸是免疫阳性的，但对gaba不是免疫阳性(图17)。用编码neurod1
–
gfp的逆转录病毒感染所培养的人小胶质细胞，但未检测到dcx阳性神经元(图18d
‑
18f)。因此，人星形胶质细胞而非小胶质细胞可通过所诱导的neurod1表达被直接转化为神经元。
[0364]
使用突触标记物sv2和谷氨酸能突触标记物vglut1进行免疫染色，以确定neurod1转化的人神经元是否被功能性连接。在用编码neurod1的逆转录病毒感染星形胶质细胞之后，在map2标记的神经元树突上观察到许多sv2点。图4f示出了如下的代表性图像：在45dpi时在neurod1转化的人神经元的树突上(map2，中图)被免疫染色的突触点(sv2，左图)，neurod1
‑
gfp荧光(右图)，比例尺为20μm。
[0365]
一些神经元表现出了蘑菇状的成熟棘，其与vglut1点共定位。图4g是高度放大倍数图像，其示出了在neurod1转化的神经元上与树突棘共定位的囊泡型谷氨酸转运蛋白1(vglut1)免疫染色点，比例尺为10μm。
[0366]
膜片钳记录被用来检测转化为人神经元的人星形胶质细胞的功能。在20dpi之后，记录了重复动作电位的激发(n＝15)和较大的na电流(i
na
)和k电流(i
k
)(n＝12)。图4h是在20dpi时在neurod1转化的神经元中的重复动作电位的代表性迹线。图4i示出了显示在
30dpi时从neurod1转化的神经元中记录到的na
+
和k
+
电流的代表性迹线。
[0367]
还检测到了较大的谷氨酸受体电流(31
‑
35dpi，548
±
138pa，n＝7)、gaba
a
受体电流(31
‑
35dpi，599
±
114pa，n＝8)和nmda诱发的电流(40dpi，966
±
101pa，n＝8)。图4j示出了显示通过浴施用100μμ谷氨酸诱导的受体电流的代表性迹线。图4k示出了显示通过浴施用100μμgaba诱导的受体电流的代表性迹线。图4l示了显示通过浴施用100μμnmda诱导的受体电流的代表性迹线。
[0368]
此外，在neurod1转化的神经元中，检测到功能性突触事件(频率1.6
±
0.3hz；振幅23.2
±
0.8pa；n＝13)——其完全被ampa/红藻氨酸盐受体拮抗剂cnqx(10μμ)阻断，但不被gaba
a
受体拮抗剂荷包牡丹碱(20μμ)阻断。图4m示出了在40dpi时在neurod1转化的神经元中自发性突触事件的代表性迹线。需注意到全部突触事件被cnqx(10μμ)阻断但不被bic(20μμ)阻断，表明通过外源neurod1表达被转化为人神经元的人星形胶质细胞是谷氨酸能细胞。
[0369]
实施例18
[0370]
用编码neurod1的逆转录病毒感染的细胞是双皮质素(dcx)阳性神经元
[0371]
图5a是一组低倍图像，其示出了在14dpi时在损伤中心(以*表示)附近被仅编码gfp的逆转录病毒感染的反应性神经胶质细胞。左图示出了gfp荧光，中图为相同视场的gfap免疫染色，以及右图为相同视场的gfp荧光、gfap免疫染色和dapi荧光的重叠，比例尺为40μm。
[0372]
在4dpi时，被编码neurod1和gfp的逆转录病毒感染的细胞大多数为dcx(一种未成熟神经元的标记物)阳性。在图5b中，左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图为相同视场的dcx免疫染色，以及右图为相同视场的gfp荧光和dcx免疫染色的重叠，比例尺为40μm。需注意到在neurod1感染后dcx阳性神经元的显著数量。
[0373]
图5c示出了在14dpi时沿着注射位点被编码neurod1和gfp的逆转录病毒感染的dcx阳性细胞的低倍图像。左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图是相同视场的dcx免疫染色，以及右图是相同视场的neurod1
‑
gfp荧光、dcx免疫染色和dapi荧光的重叠，比例尺为100μm。需注意到损伤位点在由dapi染色圈定出的海马上方的皮质区域中。图5d示出了在14dpi时沿着注射位点被编码neurod1和gfp的逆转录病毒感染的dcx阳性细胞的高倍图像。左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图是相同视场的dcx免疫染色，以及右图是相同视场的neurod1
‑
gfp荧光、dcx免疫染色和dapi荧光的重叠。需注意到损伤位点在由dapi染色圈定出的海马上方的皮质区域中，比例尺为20μm。
[0374]
图5e示出的图像说明了被gfap::gfp逆转录病毒感染的星形胶质细胞是dcx阴性的，比例尺为40μm。
[0375]
实施例19
[0376]
neurod1将所培养的小鼠星形胶质细胞转化为神经元
[0377]
编码neurod1的逆转录病毒被用来感染所培养的小鼠星形胶质细胞和ng2细胞。neurod1有效地将所培养的小鼠星形胶质细胞转化为神经元。图6a示出了代表性图像，其说明了所培养的小鼠星形胶质细胞大多数对星形胶质细胞标记物gfap为免疫阳性(左图，87.8
±
1.4％)，其中一些为iba1阳性(中图)，但很少为ng2阳性(右图)。
[0378]
图6b示出了代表性图像，其说明了neurod1
‑
gfp逆转录病毒感染的细胞对neun为
免疫阳性。通过neurod1染色来确定neurod1表达(8dpi)。在图6b中，左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图示出了相同视场的neun免疫染色，以及右图示出了相同视场的neurod1免疫染色，比例尺为40μm。
[0379]
图6c示出了代表性图像，其说明了被gfap::neurod1逆转录病毒感染的细胞对neun也是阳性的(8dpi)。在图6c中，左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图示出了相同视场的neun免疫染色，以及右图示出了相同视场的neurod1
‑
gfp荧光和neun免疫染色的重叠，比例尺为40μm。
[0380]
图6d示出了代表性图像，其说明了被编码neurod1的逆转录病毒构建体感染的细胞大多数对皮质神经元标记物tbr1是阳性。在图6d中，左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图示出了相同视场的tbr1免疫染色，以及右图示出了相同视场的neurod1
‑
gfp荧光和tbr1免疫染色的重叠，比例尺为40μm。
[0381]
图6e示出了代表性图像，其说明了被编码neurod1的逆转录病毒构建体感染的一些细胞还对齿状回颗粒细胞标记物prox1是阳性的(8dpi)。在图6e中，左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图示出了相同视场的prox1免疫染色，以及右图示出了相同视场的neurod1
‑
gfp荧光和prox1免疫染色的重叠，比例尺为40μm。图6f是示出了对呈gfap、iba1和ng2免疫阳性的培养的小鼠星形胶质细胞进行定量的图表。
[0382]
实施例20
[0383]
通过用编码neurod1的逆转录病毒感染小鼠星形胶质细胞而产生的neurod1转化的神经元的功能特征
[0384]
通过用编码neurod1的逆转录病毒感染小鼠星形胶质细胞而产生的neurod1转化的神经元表现出较大的gaba、谷氨酸和nmda电流，以及自发性突触事件，其可被cnqx而非bic阻断，表明neurod1转化的神经元是谷氨酸能神经元。图7a示出了在小鼠星形胶质细胞转化的神经元中，通过浴施用gaba(100μμ)诱导的较大受体电流，7dpi：405
±
97pa；14dpi：861
±
55pa；n＝8。
[0385]
图7b示出了谷氨酸(100μμ)诱发的电流(7dpi：517
±
145pa；14dpi：1061
±
159pa；n＝8)。图7c示出了nmda(100μμ)诱发的电流(7dpi：676
±
118pa；14dpi：1315
±
95；n＝9)。图7d示出了从neurod1转化的神经元中记录的自发性突触电流(14dpi；频率1.15
±
0.24hz；振幅21.5
±
0.7pa；n＝13)。需注意到，突触事件被谷氨酸受体阻断剂cnqx(10μμ)阻断，但不被gaba
a
受体阻断剂荷包牡丹碱(bic，20μμ)阻断，表明星形胶质细胞通过neurod1转化成的神经元是谷氨酸能神经元。
[0386]
实施例21
[0387]
neurod1将ng2细胞转化为神经元
[0388]
neurod1还将ng2细胞转化为neun阳性神经元，确认了本文所述的体内观察现象。但是，不同于星形胶质细胞的转化，许多ng2转化的神经元对gaba为免疫阳性。图8a示出了所培养的小鼠ng2细胞的代表性图像，其示出了ng2免疫染色(左图)，iba1免疫染色(中图)和gfap免疫染色(右图)，表明小鼠ng2培养物中的大多数细胞对ng2是免疫阳性的(79.2
±
3.2％)，比例尺为40μm。所培养的小鼠ng2细胞有许多少突胶质细胞(被鉴定为cnpase免疫阳性)，使用编码gfp而不编码neurod1的逆转录病毒构建体在5dpi时。在图8b中，左图示出了gfp荧光，中图示出了cnpase免疫染色，以及右图示出了相同视场的gfp荧光和cnpase免
疫染色的重叠，比例尺为40μm。ng2细胞是少突胶质细胞前体细胞。图8c示出了代表性图像，其说明了在5dpi时被编码neurod1
‑
gfp的逆转录病毒感染的ng2细胞变为neun阳性神经元。在图8c中，左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图示出了neun免疫染色，以及右图示出了相同视场的gfp荧光和neun免疫染色的重叠，比例尺为40μm。图8d示出了代表性图像，其说明了与星形胶质细胞不同的是，许多被编码neurod1的逆转录病毒构建体感染的ng2细胞成为gaba能神经元，7dpi；72.7+9.2％，n＝7。在图8d中，左图示出了neurod1
‑
gfp荧光；中图示出了gaba免疫染色；右图示出了相同视场的gfp荧光和gaba免疫染色的重叠，比例尺为40μm。在图8d中，箭头指示gaba能神经元，箭簇指示非gaba能神经元。图8e示出了代表性图像，其说明了被编码neurod1的逆转录病毒构建体感染的ng2细胞大多数对皮质神经元标记物tbr1是免疫阳性的(5dpi)。在图8e中，左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图示出了tbr1免疫染色，以及右图示出了相同视场的gfp荧光和tbr1免疫染色的重叠，比例尺为40μm。图8f示出了代表性图像，其说明了被编码neurod1的逆转录病毒构建体感染的ng2细胞是prox1阳性的(箭头)或prox1阴性的(箭簇，5dpi)。在图8f中，左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图示出了prox1免疫染色，以及右图示出了相同视场的gfp荧光和prox1免疫染色的重叠，比例尺为40μm。图8g是示出了对呈gfap、iba1和ng2免疫阳性的培养的小鼠ng2细胞进行定量的图表。
[0389]
实施例22
[0390]
通过neurod1被转化为神经元的ng2细胞的功能特征
[0391]
膜片钳记录还揭示出，在通过用编码neurod1的逆转录病毒感染ng2细胞而产生的neurod1转化的神经元中的谷氨酸能和gaba能事件。图9a示出了代表性图像，其说明了在用neurod1
‑
gfp逆转录病毒感染小鼠ng2培养物之后，在通过neurod1被转化为神经元的ng2细胞上检测到许多vglut1点。在图9a中，左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图示出了vglut1免疫染色，以及右图示出了相同视场的neurod1
‑
gfp荧光和vglut1免疫染色的重叠，比例尺为20μm。图9b是示出了被neurod1转化为神经元的ng2细胞表现出较大的na和k电流(n＝10)的代表性迹线。图9c是示出了被neurod1转化为神经元的ng2细胞表现出重复动作电位(n＝9)的代表性迹线。图9d是示出了被neurod1转化为神经元的ng2细胞表现出较大的谷氨酸诱发电流(n＝7)的代表性迹线。图9e是示出了被neurod1转化为神经元的ng2细胞表现出较大的gaba诱发电流(n＝9)的代表性迹线。从被neurod1转化为神经元的ng2细胞记录的自发性突触事件同时表现出谷氨酸能成分和gaba能成分，确认neurod1能够将ng2细胞同时转化为兴奋性和抑制性神经元。图9f是示出了从被neurod1转化为神经元的ng2细胞记录的自发性突触事件表现出谷氨酸能成分(n＝8)的代表性迹线。图9g是示出了从被neurod1转化为神经元的ng2细胞中记录的自发性突触事件表现出gaba能成分(n＝7)的代表性迹线。
[0392]
实施例23
[0393]
小鼠脑中neurod1转化的神经元在体内的长期存活
[0394]
发现neurod1转化的神经元能够在小鼠脑中存活非常长的时间——逆转录病毒注射后至少2个月，并且这些转化的神经元表现出许多树突棘和较大的自发性突触事件，n＝3只动物。图10a是病毒注射后在2月龄neurod1转化的神经元中观察到的清晰树突棘(箭头)中的neurod1
‑
gfp荧光图像，比例尺为4μm。图10b是示出了从皮质切片记录中的2月龄neurod1转化的神经元中记录的较大的自发性突触事件的代表性迹线。图10c是示出了图
10b中所示的突触事件的放大视图的代表性迹线。
[0395]
实施例24
[0396]
在穿刺损伤后小鼠皮质中缺乏内源新生神经元
[0397]
在损伤区域处的neurod1转化的神经元数量远多于未经neurod1感染的损伤位点处发现的少数新生神经元。在损伤后4天和1个月时进行免疫染色。图11a示出了如下的代表性图像：损伤后4天时的brdu免疫染色(左图)，相同视场的dcx免疫染色(中图)，以及相同视场的brdu免疫染色和dcx免疫染色的重叠(右图)，比例尺为20μm。图11b示出了如下的代表性图像：损伤后1个月时的brdu免疫染色(左图)，相同视场的neun免疫染色(中图)，以及相同视场的brdu免疫染色和neun免疫染色的重叠(右图)，比例尺为20μm。大多数brdu阳性细胞不是神经元(箭簇)，仅有一些例外(箭头)，n＝3只动物。从数量上看，由穿刺损伤诱导的brdu标记的内源neun阳性神经元数量仅为26
±
4/mm2(n＝3只动物)，而本发明人的穿刺损伤后的neurod1
‑
gfp感染的neun阳性神经元数量为294
±
22/mm2(n＝6只动物)。这些结果表明，在脑损伤后，neurod1能够在体内将大量的反应性神经胶质细胞(包括反应性星形胶质细胞和ng2细胞)转化为功能性神经元。从损伤后2
‑
4天起每天给予brdu(100mg/kg)以标记损伤激活的增殖性细胞。
[0398]
实施例25
[0399]
由脑穿刺损伤诱导的神经胶质细胞应答和有害改变的时程
[0400]
检验了损伤位点处的neurod1转化的神经元的益处。在脑损伤后，损伤区域的神经抑制性蛋白多糖通常增加，而轴突纤维和血管通常减少。在脑损伤后，对许多生物标记物进行分析并追踪其从损伤后2天到1个月的改变的时程。发现gfap(反应性星形胶质细胞)、ng2(ng2细胞)和iba1(小胶质细胞)的免疫染色信号全部显著增强。值得注意的是，gfap和iba1在损伤后30天仍保持非常高的信号，而ng2信号在损伤2周后明显减少。图12a示出了免疫染色的代表性图像，其示出了脑穿刺损伤之前(d0)和之后最长达1个月的gfap(星形胶质细胞)、ng2(ng2细胞)和iba1(小胶质细胞)信号的变化。比例尺为20μm，每次定量时n＝3
‑
4只动物。在穿刺损伤之后，还观察到细胞死亡(tunel)、硫酸软骨素蛋白多糖(cspg)和星形胶质细胞间隙连接(cx43)的大幅增加。图12b示出了tunel染色的代表性图像，其示出了穿刺损伤之后的第2天和第30天时的显著细胞死亡，并伴随着硫酸软骨素蛋白多糖(cspg)和星形胶质细胞间隙连接(由cx43标记)的增加。比例尺为20μm，每次定量时n＝3
‑
4只动物。
[0401]
tunel、cspg和cx43信号在损伤后2周时减少，但在损伤后30天时再次增加。此外，星形胶质细胞谷氨酸转运蛋白(glt1)、轴突纤维(smi312)和少突胶质细胞髓磷脂蛋白(mbp)在损伤后全部减少。图12c示出了代表性图像，其表明星形胶质细胞谷氨酸转运蛋白(glt1)和轴突纤维(smi312)以及少突胶质细胞髓磷脂蛋白(mbp)在脑穿刺损伤后明显减少。比例尺为20μm，每次定量时n＝3
‑
4只动物。图12d示出了显示脑损伤之前和之后免疫染色信号的定量数据的柱形图(d0
‑
d30，除了mbp)，每次定量时n＝3
‑
4只动物。
[0402]
实施例26
[0403]
通过在损伤位点中表达外源neurod1将反应性星形胶质细胞和ng2细胞转化为功能性神经元之后的更多有益效果
[0404]
其他有益效果包括在包含neurod1转化的神经元的区域中，间隙连接减少、细胞死亡减少和vegf增加。图13a包括如下的图像：gfp荧光(左上图)，neurod1
‑
gfp荧光(左下图)，
cx43免疫染色(中图)，以及gfp或neurod1
‑
gfp荧光与cx43免疫染色的重叠(右图，分别为右上图和右下图)，比例尺为20μm。图13a还包括图表，其示出了与被仅编码gfp的逆转录病毒构建体感染的对照区域相比，在被编码neurod1的逆转录病毒构建体感染的区域中星形胶质细胞间隙连接(cx43)减少(n＝7)。图13b包括如下的图像：gfp荧光(左上图)，neurod1
‑
gfp荧光(左下图)，tunel染色(中图)，以及gfp或neurod1
‑
gfp荧光与tunel染色的重叠(右图，分别为右上图和右下图)，比例尺为20μm。图13b还包括图表，其显示了tunel染色表明在包含neurod1转化的神经元的区域中细胞死亡减少(n＝5)。图13c包括如下的图像：gfp荧光(左上图)，neurod1
‑
gfp荧光(左下图)，vegf免疫染色(中图)，以及gfp或neurod1
‑
gfp荧光与vegf免疫染色的重叠(右图，分别为右上图和右下图)，比例尺为10μm。图13c还包括图表，其示出了在包含neurod1转化的神经元的区域中，血管生成标记物vegf明显增加(n＝6)。图13d示出了代表性图像，其说明了在包含neurod1转化的神经元的区域中，星形胶质细胞与血管紧密接触(n＝6)，比例尺为40μm。图13e示出了代表性图像，其说明了在包含neurod1转化的神经元的区域中，smi312标记的轴突纤维与髓磷脂蛋白mbp共定位(n＝4)，比例尺为20μm。在图13e中，左图示出了smi312免疫染色，中图示出了mbp免疫染色，以及右图示出了smi312免疫染色和mbp免疫染色的重叠。
[0405]
实施例27
[0406]
新转化的神经元和周围星形胶质细胞之间的间隙连接偶联
[0407]
间隙连接介导的跨细胞信号转导可介导通过外源neurod1的表达使星形胶质细胞转化为神经元的有益效果。星形胶质细胞以间隙连接相偶联，脑损伤增加了星形胶质细胞间隙连接，参见图12b。本文所述研究表明，在星形胶质细胞
‑
神经元转化的早期阶段，间隙连接可保留在星形胶质细胞和新的neurod1转化的神经元之间，参见图2g。其他结果表明，将染料(磺酰罗丹明b)注射到1日龄的neurod1转化的神经元中导致染料向周围的星形胶质细胞扩散(图14a)。染料偶联被间隙连接抑制剂甘珀酸(cbx)阻断，参见图14a。值得注意的是，将染料注射到3日龄的neurod1转化的神经元中不再产生染料偶联，表明间隙连接在转化后仅保留较短时间，参见图14a。为了研究这类神经元
‑
星形胶质细胞间隙连接是否有任何功能意义，本发明人使用lps(100μμ)在细胞培养物中诱导细胞死亡。与gfp对照逆转录病毒相比，编码neurod1的逆转录病毒的感染显著减少了细胞死亡的数量，并且这类有益效果被间隙连接抑制剂阻断。因此，通过表达外源neurod1将反应性神经胶质细胞转化为功能性神经元，其通过增加轴突纤维和血管同时减少细胞死亡而明显改善损伤区域。图14a示出了代表性图像，其表明磺酰罗丹明b透析进入1日龄的neurod1转化的神经元，标记出周围的星形胶质细胞(如虚线所示)，并且在3日龄转化的神经元中或用甘珀酸(cbx，100μμ)阻断间隙连接之后未观察到这种染料偶联。比例尺为20μm，n＝3份培养物。图14b示出了代表性图像，其示出了neurod1诱导的星形胶质细胞到神经元的转化显著减少了细胞死亡(通过tunel染色标记)。用cbx阻断间隙连接增加了细胞死亡。比例尺为20μm，n＝4份培养物。每60x图像进行tunel细胞计数(面积＝0.044mm2)。图14c是示出了对上述结果进行定量的图表。
[0408]
实施例28
[0409]
在年老动物中，neurod1能够将反应性星形胶质细胞和ng2细胞转化为neurod1转化的神经元
[0410]
发现将编码neurod1的逆转录病毒注射到非常老的脑(14月龄的wt或ad脑)中可将反应性神经胶质细胞转化为神经元。图15a示出了代表性图像，其表明在7月龄的野生型小鼠中，被编码neurod1和gfp的逆转录病毒感染的细胞(14dpi)是neun阳性的(n＝4)，比例尺为40μm。在图15a中，左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图示出了neun免疫染色，以及右图示出了相同视场的neurod1
‑
gfp荧光和neun免疫染色的重叠。
[0411]
图15b示出了代表性图像，其表明在14月龄的动物中(n＝3)，neurod1转化的神经元(16dpi)表现出强健的树突，比例尺为40μm。在图15b中，左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，右图示出了相同视场的neurod1
‑
gfp荧光和dapi荧光的重叠。图15c示出了代表性图像，其表明即使在14月龄5xfad小鼠中(n＝6)，在αβ沉淀物附近有许多neurod1转化的神经元(14dpi)，比例尺为40μm。此结果表明，neurod1转化方法可用于年老脑中以恢复丧失的神经元功能。在图15c中，左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图示出了αβ42免疫染色，以及右图示出了相同视场的neurod1
‑
gfp荧光和αβ42免疫染色的重叠。
[0412]
实施例29
[0413]
人星形胶质细胞
‑
神经元转化过程中没有中间神经前体细胞阶段
[0414]
图16示出了代表性图像，其表明被编码neurod1的逆转录病毒感染的细胞(箭簇)在感染后1天、3天和5天的过程中在神经干细胞标记物musashi的表达方面未表现出任何增加。比例尺为40μm，n＝3份培养物。在图16中，左图示出了neurod1
‑
gfp荧光，中图示出了musashi免疫染色，以及右图示出了相同视场的neurod1
‑
gfp荧光和musashi免疫染色的重叠，以及dapi荧光。
[0415]
实施例30
[0416]
在neurod1感染后，人星形胶质细胞转化的神经元的特性
[0417]
图17a和图17b为代表性图像，其分别示出了在小鼠培养的神经元(7div)和用编码neurod1的逆转录病毒感染人星形胶质细胞而产生的neurod1转化的神经元(21dpi，98.4
±
0.9％是谷氨酸阳性的)中的谷氨酸免疫染色，图17a的比例尺为40μm，图17b的比例尺为20μm，n＝3份培养物。
[0418]
图17c和图17d为代表性图像，其分别示出了在小鼠培养的神经元(7div)和用编码neurod1的逆转录病毒感染人星形胶质细胞而产生的neurod1转化的神经元(21dpi，1.4
±
0.1％是gaba阳性的)中的gaba免疫染色，比例尺为40μm，n＝3份培养物。
[0419]
图17e和图17f为代表性图像，其分别示出了在小鼠培养的神经元(7div)和用编码neurod1的逆转录病毒感染人星形胶质细胞而产生的neurod1转化的神经元(21dpi)中的tbr1免疫染色，比例尺为40μm。
[0420]
实施例31
[0421]
人星形胶质细胞能够被转化为神经元而人小胶质细胞不能。
[0422]
图18a示出了代表性图像，其表明在人星形胶质细胞培养物中的大多数细胞对星形胶质细胞标记物s100β是免疫阳性的(94.3
±
0.7％)，n＝3
‑
5份培养物，比例尺为40μm。图18b示出了代表性图像，其表明被neurod1
‑
gfp感染的人星形胶质细胞变成neun免疫阳性的(21dpi)，n＝3
‑
5份培养物，比例尺为40μm。通过neurod1免疫染色确定了neurod1表达。图18c示出了代表性图像，其表明通过用编码neurod1的逆转录病毒感染人星形胶质细胞而产生的neurod1转化的神经元是prox1阳性的(8dpi)，n＝3
‑
5份培养物，比例尺为40μm。图18d
示出了代表性图像，其表明人小胶质细胞培养物中的大多数细胞是iba1阳性的(97.1
±
1.1％)，n＝3
‑
5份培养物，比例尺40μm。图18e和图18f的代表性图像表明人小胶质细胞不能被neurod1转化为神经元(20dpi)，n＝3
‑
5份培养物，比例尺为40μm。图18g是示出了对呈s100β(94.3
±
0.7％)、iba1和ng2免疫阳性的所培养的人星形胶质细胞进行定量的图表。图18h是示出了对呈gfap、iba1(97.1
±
1.1％)和ng2免疫阳性的所培养的人小胶质细胞进行定量的图表。
[0423]
实施例32
[0424]
体内和体外ng2启动子
‑
驱动的neurod1表达
[0425]
生成了编码在人ng2启动子控制下的neurod1和gfp的逆转录病毒hng2::neurod1
‑
ires
–
gfp，并将其用于感染成年小鼠皮质中的细胞。将hng2::neurod1
‑
ires
–
gfp逆转录病毒注射到成年小鼠皮质中之后，在7dpi时通过gfp荧光鉴定的neurod1感染的ng2细胞是neun免疫阳性的，表明ng2细胞确实在体内被转化为神经元。图19a示出了将hng2::neurod1
‑
ires
–
gfp逆转录病毒注射到1月龄的小鼠皮质之后获得的代表性图像。左图示出了gfp荧光，中图示出了neun免疫荧光，在7dpi时在体内鉴定出neun阳性神经元(箭头)，n＝4只动物。右图的相同视场中示出了gfp荧光和neun免疫荧光的重叠。比例尺为40μm。
[0426]
所培养的ng2细胞被hng2::neurod1
‑
ires
‑
gfp感染，并且在7dpi时在neurod1感染的ng2培养物中发现许多具有清晰神经元形态的neun阳性神经元。因此，ng2细胞能够被neurod1转化为神经元。图19b示出了在用hng2::neurod1
‑
ires
‑
gfp逆转录病毒感染所培养的ng2细胞之后获得的代表性图像。左图示出了gfp荧光，中图示出了neun免疫荧光，在7dpi时在体内鉴定出neun阳性神经元(箭头)。右图的相同视场中示出了gfp荧光和neun免疫荧光的重叠，以及dapi染色。比例尺为40μm。
[0427]
实施例33—局灶性缺血性中风i的动物模型
[0428]
在本实施例中，内皮素
‑
1诱导的局灶性缺血性中风的小鼠模型被用来确定在中风损伤脑的神经胶质细胞中外源neurod1表达的效果。
[0429]
动物：将3
‑
5月龄的c57bl/6雄性小鼠(20
‑
30g)按照12:12光/暗循环饲养在美国宾夕法尼亚州立大学动物中心的标准笼子中。按照限制性喂养计划(3g/天)来饲养小鼠，以避免饱食并促进达到行为标准。一组小鼠接受内皮素
‑
1(et
‑
1)的皮质内注射；一组小鼠接受0.9％无菌盐水的皮质内注射；一组小鼠接受假手术。
[0430]
手术步骤：用0.25％阿佛丁(溶解于无菌盐水中，20ml/kg，腹膜内注射)麻醉小鼠。测试尾/足挤压和角膜反应以确认完全麻醉。在手术过程中，通过加热垫将温度维持在37℃。刮净头皮并用碘酒清洁，然后注射布比卡因(1ml/20g，皮下注射)。然后将每只小鼠放置在立体定向装置上，沿着刮毛区进行中线切开。在躯体感觉皮质的前肢区域中心上方的头骨处(坐标：中线侧向2.25mm和前囱前方+0.6mm)钻一个小钻孔。刺穿硬脑膜并使带有26号针头的1ml注射器向下进入皮质的700μm深处。在10分钟内将4μl et
‑
1(320pmol，溶于无菌盐水，浓度为0.2μg/μl)注射到皮质中，注射后将注射器在原处停留5分钟以防止回流，然后缓慢拔出。然后在钻孔处填充明胶海绵并覆盖上紫外线固化牙科粘固剂，缝合伤口并涂上抗生素软膏。手术后，将动物放在热垫上直到其完全苏醒，然后将其放回至其居住的笼子。在两组对照组中，一组小鼠接受开颅之前的全部手术步骤，另一组小鼠接受开颅手术以及向躯体感觉皮质的前肢区域注入溶剂(0.9％无菌盐水)。在手术后接下来的几天(4
‑
5天)内
检查小鼠以确保小鼠的正常恢复。
[0431]
行为测试——双侧触觉刺激测试——能够被用来评估诱导的中风。对于该测试，将每只小鼠放进一个上面敞开的浅透明的塑料容器中(高8.5cm，直径18cm)并使其熟悉1分钟。取出小鼠并使其颈背受到轻微限制，同时在其每只爪子的腹侧贴上1.27cm长、3mm宽的胶带。然后将小鼠放回容器，允许其用牙齿除去每块胶带。记录了5次试验的接触和除去每块胶带的等待时间，每两次试验之间有30秒休息时间。
[0432]
如实施例3所述生成包含seq id no:2或seq id no:4的neurod1逆转录病毒，并如实施例7所述将其注射到小鼠皮质中。在neurod1注射约2周后，检查脑以确认neurod1逆转录病毒注射处附近的神经元增加。双侧触觉刺激实验能够被用于评估中风相关行为效果的改善。
[0433]
实施例34—局灶性缺血性中风ii的动物模型
[0434]
在本实施例中，光栓(photothrombosis)诱导的局灶性缺血性中风的小鼠模型被用来确定在中风损伤脑的神经胶质细胞中外源neurod1表达的效果。
[0435]
动物：将3
‑
5月龄的c57bl/6雄性小鼠(20
‑
30g)按照12:12光/暗循环饲养在美国宾夕法尼亚州立大学动物中心的标准笼子中。按照限制性喂养计划(3g/天)来饲养小鼠，以避免饱食并促进达到行为标准。手术步骤：用0.25％阿佛丁(溶解于无菌盐水中，20ml/kg，i.p.)麻醉小鼠。测试尾/足挤压和角膜反应以确认完全麻醉。在手术过程中，通过加热垫将温度维持在37℃。切开颅骨上方的头皮，将安装在冷光源上的光纤束(直径51.5mm，波长560nm，孔径b2，1750k，kl 1500lcd)放置在脑右半球的上方，其聚焦在中线侧向2.25mm和前囱前方+0.6mm。将光敏染料玫瑰红(溶解在人工脑脊髓液中)注射进侧向尾静脉(30mg/kg体重)。在注射后立即开始颅骨的焦点照明，持续20分钟。在血栓诱导之后，缝合切口，将动物放在热垫上直到其完全苏醒，然后将其放回其居住的笼子。光束的放置、光强度和光孔径对所有动物而言是相同的。在对照组中，小鼠接受除了光照以外的所有手术步骤。在手术后接下来的几天(4
‑
5天)内检查小鼠以确保其正常恢复。
[0436]
行为测试——双侧触觉刺激测试——能够被用来评估诱导的中风。对于该测试，将每只小鼠放进一个上面敞开的浅透明的塑料容器中(高8.5cm，直径18cm)并使其熟悉1分钟。取出小鼠并使其颈背受到轻微限制，同时在其每只爪子的腹侧贴上1.27cm长、3mm宽的胶带。然后将小鼠放回容器，允许其用牙齿除去每块胶带。记录了5次试验的接触和除去每块胶带的等待时间，每两次试验之间有30秒休息时间。
[0437]
如实施例3所述生成包含seq id no:2或seq id no:4的neurod1逆转录病毒，并如实施例7所述将其注射到小鼠皮质中。在neurod1注射约2周后，检查脑以确认neurod1逆转录病毒注射处附近的神经元增加。双侧触觉刺激实验能够被用于评估中风相关行为效果的改善。
[0438]
实施例35—脊髓损伤的动物模型
[0439]
在本实施例中，脊髓损伤的小鼠模型被用来确定在损伤的脊髓中的神经胶质细胞中外源neurod1表达的效果。
[0440]
本实施例中待使用的动物是雌性c57b/6小鼠(22
‑
29g)。在手术之前，预热加热垫以在整个手术过程中将温度保持在36.6
‑
37.1℃。通过向腹膜内注射15ml/kg的0.25％阿佛丁来麻醉小鼠。在固定小鼠之后，剃净背部。用软膏覆盖眼睛。将小鼠背部朝上放在加热垫
上，用70％的酒精消毒背部两次。在进行下一步之前，检查小鼠以确定对脚趾挤压没有反射。然后，在背部的胸脊柱切口上方开一个1.3cm背部中线切口。颈背韧带的尾端部分和下方从脊柱棘突起始的斜方肌被切断以暴露t8
‑
t10的脊柱棘突。使用一对精密的咬骨钳来完成脊椎t9
‑
t10的椎板切除术，小心避免损伤硬膜。一旦脊髓被暴露，以下两种方法之一将被用于损伤：1)用一对钳子夹住t9的脊柱棘突并拉起以打开椎骨间空间。使用一对改良的钳子侧向压紧脊髓至厚度为0.3mm，并将手术钳保持15秒；或者2)用一对钳子夹住并轻轻拉起t9的脊柱棘突以打开椎骨间空间。使用微型手术刀(刀片深度5mm，15
°
；roboz surgical instruments)从右至左一次横向切断脊髓。从左至右进行第二次横切，应非常小心地使用手术刀尖端划过脊椎管的骨质表面以保证完全横断。假损伤对照组将接受相同的处理，包括暴露、椎板切除术和将钳子放置在脊髓周围，但不会施加挤压或横断损伤。在整个手术过程中监测每只动物的呼吸和心跳。然后，使双侧的自身肌肉(autochtone muscle)和斜方肌复位，并利用10
‑
0ethilon(7718g,ethicon)通过闭合的3次单独缝合轻压肌肉。用相同的缝合闭合皮肤。
[0441]
术后护理：将每只小鼠放在加热垫上直到其醒来，然后将其转移到有寝具(bedding)、充足的水和柔软的食物的笼子中。
[0442]
术后立刻和再过一天，皮下注射1ml用于水化的林格氏溶液和丁丙诺啡(0.01mg/kg)以缓解疼痛，每天2次，持续3天。术后每天检查小鼠，每天手动排空膀胱两次，直到小鼠能够自发排尿。向每只小鼠腹膜内注射0.01ml抗生素baytril以防止膀胱感染。
[0443]
如实施例3所述生成包含seq id no:2或seq id no:4的neurod1逆转录病毒，并将其注射到小鼠脊髓的脊髓损伤位点。在注射neurod1约两周之后，检查脊髓以确认在neurod1逆转录病毒注射处附近的神经元增加。
[0444]
实施例36—在细胞培养物中，外源dlx2的表达将人星形胶质细胞转化为gaba能和谷氨酸能神经元的效果
[0445]
在所培养的人星形胶质细胞中外源dlx2的表达将星形胶质细胞转变为gad阳性的gaba能神经元，其表现出重复动作电位和gaba能事件。偶尔还检测到一些谷氨酸能事件，表明dlx2能够将人星形胶质细胞转化为gaba能和谷氨酸能神经元。
[0446]
实施例37—在非人灵长类动物中将反应性星形胶质细胞转化为神经元
[0447]
将使用非人灵长类动物(例如狨猴或猕猴)进行反应性星形胶质细胞到神经元的转化，以在中风后(类似于实施例33和34中所述)或脊髓损伤后(类似于实施例35中所述)将人neurod1导入反应性星形胶质细胞，将其转化为功能性神经元。可通过逆转录病毒或腺伴随病毒(其包含星形胶质细胞特异性启动子gfap以使得neurod1仅在星形胶质细胞中表达)将neurod1导入动物体内。还可使用能够与质粒或病毒粒子结合的纳米颗粒将neurod1导入神经胶质细胞以用于神经元转化。
[0448]
序列
[0449]
seq id no:l——编码人neurod1蛋白的人neurod1核酸序列——1071个核苷酸，包含终止子
[0450][0451]
seq id no:2——人neurod1氨基酸序列，356个氨基酸，由seq id no:1编码
[0452][0453]
seq id no:3——编码小鼠neurod1蛋白的小鼠neurod1核酸序列，1074个核苷酸，包含终止子
[0454][0455]
seq id no:4——小鼠neurod1氨基酸序列，357个氨基酸，由seq id no:3编码
[0456][0457]
seq id no:5——小鼠lcn2启动子
[0458]
[0459][0460]
seq id no:6——人gfap启动子
[0461]
[0462][0463]
seq id no:7——小鼠aldh1l1启动子
[0464][0465][0466]
seq id no:8——人ng2启动子
[0467][0468]
seq id no:9——cag::neurod1
‑
ires
‑
gfp
[0469]
[0470]
[0471]
[0472]
[0473]
[0474][0475]
项
[0476]
第1项.一种在神经胶质细胞中产生神经元表型的方法，其包括：在所述神经胶质细胞中表达外源neurod1，其中所述神经胶质细胞选自星形胶质细胞、反应性星形胶质细胞、ng2细胞和反应性ng2细胞。
[0477]
第2项.第1项的方法，其中所述神经胶质细胞是在体外。
[0478]
第3项.第1项的方法，其中所述神经胶质细胞是在体内。
[0479]
第4项.第1
‑
3项中任一项的方法，其中所述神经胶质细胞是人神经胶质细胞。
[0480]
第5项.第1
‑
4项中任一项的方法，其中所述神经胶质细胞是非人哺乳动物的神经胶质细胞。
[0481]
第6项.第1
‑
5项任一项的方法，其中表达外源neurod1包括将包含编码neurod1的核酸的表达载体递送到所述神经胶质细胞中。
[0482]
第7项.第1
‑
6项中任一项的方法，其中表达外源neurod1包括将包含编码neurod1的核酸的病毒表达载体递送到所述神经胶质细胞中。
[0483]
第8项.第1
‑
7项中任一项的方法，其中表达外源neurod1包括将包含编码neurod1的核酸的逆转录病毒表达载体递送到所述神经胶质细胞中。
[0484]
第9项.第1
‑
8项中任一项的方法，其中所述神经元表型包括如下中的一种或多种：神经元形态、一种或多种神经元标记物的表达、神经元的电生理特征、突触形成和神经递质的释放。
[0485]
第10项.第1
‑
9项中任一项的方法，其中neurod1是所述神经胶质细胞中唯一的外源表达的转录因子。
[0486]
第11项.一种体外神经胶质细胞，其包含外源的neurod1。
[0487]
第12项.一种体外神经胶质细胞，其包含编码neurod1的表达载体。
[0488]
第13项.第11或12项的体外神经胶质细胞，其具有神经元表型，其中所述神经元表型包括如下中的一种或多种：神经元形态、一种或多种神经元标记物的表达、神经元的电生理特征、突触形成和神经递质的释放。
[0489]
第14项.第11
‑
13项中任一项的体外神经胶质细胞，其中neurod1是所述神经胶质细胞中唯一的外源表达的转录因子。
[0490]
第15项.一种基本上如本文所述的体外神经胶质细胞。
[0491]
第16项.一种基本上如本文所述的在神经胶质细胞中产生神经元表型的方法。
[0492]
第17项.一种在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其包括：将治疗有效剂量的neurod1给予所述受试者的神经胶质细胞；由此使外源neurod1在所述神经胶质细胞中
表达，从而在所述神经胶质细胞中产生神经元表型以改善所述受试者的神经学病症。
[0493]
第18项.第17项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中给予治疗有效剂量的neurod1包括给予包含编码neurod1蛋白的核酸序列的表达载体。
[0494]
第19项.第18项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中所述编码neurod1蛋白的核酸序列包括选自以下的核酸序列：编码seq id no:2的核酸序列或其功能性片段；编码seq id no:4的核酸序列或其功能性片段；seq id no:1或其功能性片段；seq id no:3或其功能性片段；以及编码与seq id no:2或seq id no:4具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的蛋白的核酸序列或其功能性片段。
[0495]
第20项.第17
‑
19项中任一项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中所述神经学病症的特征是存在反应性星形胶质细胞。
[0496]
第21项.第17
‑
20项中任一项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中所述神经学病症是中枢或周围神经系统的损伤。
[0497]
第22项.第17
‑
21项中任一项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中所述神经学病症选自阿兹海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(als)、癫痫和中风。
[0498]
第23项.第17
‑
22项中任一项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中给予治疗有效剂量的neurod1包括局部给药。
[0499]
第24项.第17
‑
23项中任一项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中给予治疗有效剂量的neurod1包括全身给药。
[0500]
第25项.第17
‑
24项中任一项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中给予治疗有效剂量的neurod1包括给予包含编码neurod1蛋白的核酸序列的表达载体，所述核酸序列可操作地连接至泛在启动子。
[0501]
第26项.第17
‑
25项中任一项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中给予治疗有效剂量的neurod1包括给予包含编码neurod1蛋白的核酸序列的表达载体，此核酸序列可操作地连接至选自星形胶质细胞特异性启动子和ng2细胞特异性启动子的细胞类型特异性启动子。
[0502]
第27项.第17
‑
26项中任一项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中所述表达载体是病毒表达载体。
[0503]
第28项.第17
‑
27项中任一项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中所述表达载体是逆转录病毒。
[0504]
第29项.第17
‑
28项中任一项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中所述表达载体是腺病毒。
[0505]
第30项.第17
‑
28项中任一项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中所述表达载体是腺伴随病毒。
[0506]
第31项.第17
‑
28项中任一项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中所述表达载体是慢病毒。
[0507]
第32项.第17
‑
24项中任一项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中给予治疗有效剂量的neurod1包括给予neurod1蛋白。
[0508]
第33项.第17
‑
24项中任一项的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其中给予治疗有效剂量的neurod1包括给予编码neurod1蛋白的mrna。
[0509]
第34项.一种在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法，其包括：提供包含编码neurod1的核酸的病毒表达载体；并且将所述病毒表达载体递送到所述受试者的中枢神经系统或周围神经系统，由此所述病毒载体分别感染所述中枢神经系统或周围神经系统的分裂细胞，产生感染的细胞，并且由此外源neurod1以治疗有效的水平在所述感染的细胞中表达，其中与具有相同神经学病症的未经治疗的受试者相比，所述neurod1在感染的细胞中的表达导致在所述受试者中产生数量更多的神经元，因此使该神经学病症得到治疗。
[0510]
第35项.第17
‑
34项中任一项的方法，其中neurod1是所述神经胶质细胞中唯一的外源表达的转录因子。
[0511]
第36项.一种基本上如本文所述的在需要其的受试者中治疗神经学病症的方法。
[0512]
第37项.一种表达载体，其包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子。
[0513]
第38项.第37项的表达载体，其中所述神经胶质细胞特异性启动子是星形胶质细胞特异性启动子或ng2细胞特异性启动子。
[0514]
第39项.第37或38项的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。
[0515]
第40项.第37
‑
39项中任一项的表达载体，其中所述表达载体是逆转录病毒表达载体。
[0516]
第41项.第37
‑
40项中任一项的表达载体，其中所述表达载体是腺病毒、腺伴随病毒或慢病毒。
[0517]
第42项.第37
‑
41项中任一项的表达载体，其中所述启动子是gfap启动子、ng2启动子、aldh1l1启动子或lcn2启动子。
[0518]
第43项.第37
‑
41项中任一项的表达载体，其中所述编码neurod1蛋白的核酸序列包括选自以下的核酸序列：编码seq id no:2的核酸序列或其功能性片段；编码seq id no:4的核酸序列或其功能性片段；seq id no:1或其功能性片段；seq id no:3或其功能性片段；以及编码与seq id no:2或seq id no:4具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的蛋白的核酸序列或其功能性片段。
[0519]
第44项.一种表达载体，其包含基本上如本文所述的与编码neurod1的核酸可操作地连接的神经胶质细胞特异性启动子。
[0520]
本说明书提及的任何专利或出版物都以引用的方式纳入本文，其程度如同每一个单独的出版物被具体地并且单独地被指明以引用的方式纳入本文一样。
[0521]
本文所述的组合物和方法目前代表优选的实施方案，其为示范性的且不意欲对本发明的范围进行限制。本领域普通技术人员会了解其中的改变和其他用途。可做出这类改变和其他用途，而不偏离如权利要求中所述的本发明的范围。