一种氨基糖苷类药物-DNA纳米载体复合物及其应用

一种氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物及其应用。


背景技术：

2.梅尼埃病是一种特发性内耳疾病，其典型症状是眩晕。眩晕常反复发作，复发次数越多，持续越长、间歇越短，对正常生活和工作造成巨大影响。发作性眩晕多呈突发旋转性，患者多神志清醒。眩晕持续时间不等，多为20分钟至12小时，通常2～3小时即转入间歇期，持续超过24小时者较少见。间歇期无眩晕发作，但可能出现不平衡或者不稳感，可持续数天。患者可感到摇晃、升降或漂浮，或感到自身或周围物体沿一定方向与平面旋转。闭目静卧时可减轻，睁眼转头时会加剧。双侧梅尼埃病患者可表现为头晕、不稳感、摇晃感或振动幻视。
3.现有治疗方式中，全身静脉滴注链霉素方式，可治疗双侧梅尼埃病，缓解眩晕症状。但存在药物在体内存留时间短，需要持续给药；传统的多次给药方案由于药物清除速度快，或因其生物分布原因，导致肾毒性和耳毒性等不良反应等问题。
4.为优化全身给药方式的治疗效果，利用纳米颗粒给药系统治疗梅尼埃病开始兴起。其中，利用嵌段聚合物plga装载的庆大霉素药物因其纳米尺度特性，能够延长庆大霉素体内活性时间，降低给药频率和用药剂量，从而降低药物副作用。但依旧存在如下问题：
5.1)嵌段聚合物plga材料本身亲水性弱，对带正电的庆大霉素分子结合能力差。
6.2)嵌段聚合物plga在体内降解时间长，虽然一定程度上提高了药物的体内作用时间，降低了给药频率，但是作为一种水溶性较差的多聚物纳米材料，长时间留存在体内，增加了患者的健康风险。
7.因此，加快研究优化纳米颗粒给药系统已经成为系统治疗梅尼埃病内耳疾病的一项紧迫和高技术含量的任务。


技术实现要素：

8.针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物作为治疗系统治疗梅尼埃病等内耳疾病的药物-载体复合物。以有效的解决能够解决氨基糖苷类药物-纳米载体复合物载药量低和纳米材料本身的生物相容性问题。
9.第一方面，本发明提供一种氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物，所述氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物以dna分子片段为主体结构，所述主体结构与氨基糖苷类分子间相互作用，形成所述氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物；
10.优选地，所述dna分子片段为小牛胸腺dna片段或鲑鱼精dna片段。
11.优选地，所述dna纳米药物载体的制备方法，包括：
12.将所述小牛胸腺dna分子片段或所述鲑鱼精dna分子片段于常温下溶解于不含dnase与rnase的去离子蒸馏水中，得到溶液1；
13.将所述氨基糖苷类分子于常温下溶解在生理盐水中，得到溶液2；
14.将所述溶液1与所述溶液2混合，得到所述氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物。
15.优选地，所述氨基糖苷类分子包括：庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素。
16.优选地，所述小牛胸腺dna分子片段为已剪切的dna分子，平均大小为小于等于2000bp。
17.优选地，所述溶液1的浓度为10mg/ml。
18.优选地，所述溶液2的浓度为1mg/ml。
19.优选地，所述生理盐水的质量分数为0.9％。
20.优选地，所述氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物中，所述氨基糖苷分子与dna碱基比例为10：1-12：1。
21.第二方面，本发明提供一种氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物的应用，所述氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物基于静脉注射的方式，用于治疗梅尼埃病。
22.与现有技术相比，本技术包括以下优点：
23.(1)现有技术中采用的纳米材料做药物载体，大多具有细胞毒性，而dna则具有天然的生物相容性和细胞穿透能力，其可通过细胞内吞作用穿透细胞膜进入活细胞，而无需使用任何配体或转染剂，具有优异的细胞膜通透性。因而，本发明提供的氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物为低毒性的氨基糖苷类抗生素纳米药物载体。
24.(2)本发明提供的dna纳米载体以小牛胸腺dna分子片段和鲑鱼精dna分子片段为主体。能够在用作静脉输送内耳药物的载体时，抵抗核酸酶和蛋白酶的攻击而不被其水解，具有长时间保持结构完整性和稳定性的能力。
25.(3)得益于dna合成技术的发展，小牛胸腺dna分子片段和鲑鱼精dna分子片段简单容易获取，且成本低廉，因此，基于小牛胸腺dna分子片段和鲑鱼精dna分子片段的纳米载体，研究制备氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物，在提高梅尼埃病的治疗效果的同时，能够有效降低疾病的治疗成本。
26.(4)利用dna纳米颗粒生理环境下带负电，而氨基糖苷类药物生理环境下带正电的性能，使dna纳米载体与氨基糖苷类药物间基于分子间相互作用，形成结构连接紧密的纳米级药物-载体复合物。同时，本技术提供的氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物的载药量较常规药物-载体复合物的载药量高，相当于氨基糖苷分子与dna碱基比例在10：1-12：1。
附图说明
27.图1示出了本发明实施例提供的氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物制备方法的步骤流程图。
具体实施方式
28.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
29.实施例中未注明具体实验步骤或者条件，按照本领域内的现有技术所描述的常规
实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
30.首先，本发明对梅尼埃病的发展历史进行了探究，发现梅尼埃病是一种特发性内耳疾病，在1861年由法国医师prosper m
é
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re首次提出，主要病理改变为膜迷路积水，临床表现为反复发作的旋转性眩晕、波动性听力下降、耳鸣和耳闷胀感。诱发因素包括：劳累、精神紧张及情绪波动、睡眠障碍、不良生活事件、天气或季节变化等。梅尼埃病的发病率约为(10～157)/10万，患病率约为(16～513)/10万。女性多于男性，比例约为1.3：1。发病年龄4～90岁，多发于青壮年，发病高峰为40～60岁，儿童梅尼埃病患者约占3％。部分梅尼埃病患者存在家族聚集倾向。双耳患病者占10％～50％。1938年hallpike和cairns报告本病的主要病理变化为膜迷路积水，得到了许多学者的证实。然而膜迷路积水是如何产生的却难以解释清楚。目前已知的病因包括以下因素：各种感染因素(细菌、病毒等)、损伤(包括机械性损伤或声损伤)、耳硬化症、梅毒、遗传因素、过敏、肿瘤、白血病及自身免疫病等。desousa(2002)将由已知原因引起的膜迷路积水产生的前庭症状疾患称为梅尼埃综合征。
31.发明人发现，现有治疗方式中，氨基糖苷类分子是治疗梅尼埃病眩晕的重要手段。氨基糖苷类分子(例如庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素等)是广谱抗生素，对多种革兰阴性菌及阳性菌都具有抑菌和杀菌作用，具有一定的耳毒性(过量使用会降低内耳前庭功能和听力)。利用氨基糖苷类药物的耳毒性，部分破坏内耳前庭功能，能够达到治疗眩晕的目的。可选择全身用药及局部用药两种用药方式。
32.但利用氨基糖苷类药物的耳毒性治疗疾病，存在如下缺点：全身用药后药物的体内存留时间短，需要持续给药；传统的多次给药方案由于药物清除速度快，或因其生物分布原因，导致肾毒性和耳毒性等不良反应；局部用药的手段多采用经手术直接局部给药和内耳局部给药，比如鼓膜穿刺、圆窗膜缓释和内耳开窗给药等。但手术需要经过传统外科手术或者微创手术进行操作，对操作人员技术水平有一定要求。同时，直接局部给药增加了病人手术并发症风险，给药便利性不及静脉注射等全身给药方式。
33.因此，借助纳米药物载体的给药研究成为提高全身给药效果的突破重点。目前，主要用于制备纳米药物载体的材料包括脂质体、聚乙烯亚胺、聚乳酸、聚乳酸/甘醇酸、壳聚糖、超支链聚赖氨酸和嵌段聚合物plga等。其中，利用嵌段聚合物plga装载的庆大霉素药物因其纳米尺度特性，能够延长庆大霉素体内活性时间，降低给药频率和用药剂量，从而降低药物副作用。
34.但是，现有装载庆大霉素药物的纳米颗粒存在如下问题：
35.1)嵌段聚合物plga材料本身亲水性弱，对带正电的庆大霉素分子结合能力差。
36.2)嵌段聚合物plga在体内降解时间长，虽然一定程度上提高了药物的体内作用时间，降低了给药频率，但是作为一种水溶性较差的多聚物纳米材料，长时间留存在体内，增加了患者的健康风险。
37.发明人基于上述发现的问题，提出的技术构思为：基于核酸分子天然具有低毒、生物相容性优异等优点，通过dna分子与氨基糖苷类分子间的相互作用，形成尺寸在纳米水平的药物-载体复合物。该复合物具有纳米级dna颗粒的生物相容性、细胞穿透能力、和较高的载药量，从而解决氨基糖苷类纳米药物载药量低和纳米材料本身的生物相容性问题。基于上述技术构思，本发明提供了氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物及其应用。具体实施内
容如下：
38.第一方面，本发明提供一种氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物，该氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物以dna分子片段为主体结构，主体结构与氨基糖苷类分子基于分子间相互作用，形成氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物；
39.具体实施时，优选地，dna分子片段为小牛胸腺dna片段或鲑鱼精dna片段。
40.具体实施时，小牛胸腺dna分子片段和鲑鱼精dna分子片段简单容易获取，且成本低廉，因此，基于小牛胸腺dna分子片段和鲑鱼精dna分子片段的纳米载体，研究制备氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物，在提高梅尼埃病的治疗效果的同时，能够有效降低疾病的治疗成本。
41.具体实施时，优选地，图1示出了本发明实施例提供的氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物制备方法的步骤流程图，如图1所述，dna纳米药物载体的制备方法包括：
42.s11、将小牛胸腺dna分子片段或鲑鱼精dna分子片段于常温下溶解于不含dnase与rnase的去离子蒸馏水中，得到溶液1；
43.s12、将氨基糖苷类分子于常温下溶解在生理盐水中，得到溶液2；
44.s13、将溶液1与溶液2混合，得到氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物。
45.具体实施时，优选地，氨基糖苷类分子包括：庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素。
46.优选地，小牛胸腺dna分子片段为已剪切的dna分子，平均大小为小于等于2000bp。
47.具体实施时，优选地，溶液1的浓度为10mg/ml。
48.具体实施时，优选地，溶液2的浓度为1mg/ml。
49.具体实施时，优选地，生理盐水的质量分数为0.9％。
50.具体实施时，优选地，氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物中，氨基糖苷分子与dna碱基比例为10：1-12：1。
51.具体实施时，利用dna纳米颗粒生理环境下带负电，而氨基糖苷类药物生理环境下带正电的性能，时dna纳米载体与氨基糖苷类药物间通过分子间相互作用，形成结构连接紧密的纳米级药物-载体复合物。同时，本技术提供的氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物的载药量较常规药物-载体复合物的载药量高，相当于氨基糖苷分子与dna碱基比例在10：1-12：1。
52.第二方面，本发明提供一种氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物的应用，该氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物基于静脉注射的方式，用于治疗梅尼埃病。
53.具体实施时，本发明提供的dna纳米载体以小牛胸腺dna分子片段和鲑鱼精dna分子片段为主体。能够在用作静脉输送内耳药物的载体时，抵抗核酸酶和蛋白酶的攻击而不被其水解，具有长时间保持结构完整性和稳定性的能力。
54.为使本领域技术人员更加清楚地理解本发明，现通过以下实施例对本发明所述方法进行详细说明。
55.实施例1：利用小牛胸腺dna与氨基糖苷类抗生素制备纳米药物载体复合物。
56.小牛胸腺dna分子是已剪切的dna分子。由苯酚/氯仿提取，溶解于不含dnase与rnase的去离子蒸馏水中。其中，小牛胸腺dna平均大小《＝2000bp，形成的dna药物复合物结构将处于纳米尺度。测算依据：常用的dna折纸(dna origami)结构含有约7500bp，尺度在数
十到数百纳米。
57.常温下，将中性的、冻干形式的庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素等氨基糖苷类分子分别溶解在0.9％生理盐水中，浓度为10毫克/毫升。分别与浓度为1毫克的小牛胸腺dna混合，得到小牛胸腺dna与氨基糖苷类药物合成的氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物。其中，氨基糖苷分子与dna碱基比例约为10：1。
58.实施例2：利用鱼精dna与氨基糖苷类抗生素制备纳米药物载体复合物
59.鲑鱼精dna分子是已剪切的dna分子。dna分子由苯酚/氯仿提取，溶解于不含dnase与rnase的去离子蒸馏水中其中，鲑鱼精dna分子平均大小《＝2000bp，形成的dna药物复合物结构将处于纳米尺度。测算依据：常用的dna折纸(dna origami)结构含有约7500bp，尺度在数十到数百纳米。
60.常温下，将中性的、冻干形式的庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素等氨基糖苷类分子分别溶解在0.9％生理盐水中，浓度为10毫克/毫升。分别与浓度为1毫克的鱼精dna混合，得到鱼精dna与氨基糖苷类药物合成的氨基糖苷类药物-dna纳米载体复合物。其中，氨基糖苷分子与dna碱基比例约为10：1。
61.实施例3：原子力显微镜(afm)表征药物载体复合物(结果)
62.原子力显微镜扫描使用bruker multimode 8，在液体扫描模式下使用scanasyst-fluid+探针进行。将一滴3μl样品溶液移液到新鲜切割的云母表面上并保持2分钟进行吸附；缓冲液中的mg
2+
充当胶水离子以使带负电荷的dna结合带负电的云母表面。然后将两份20μl tae缓冲液分别加入到云母和afm尖端。
63.实施例4：透射电镜(tem)表征药物载体复合物(结果)
64.使用荷兰fei公司tecnai g2 20透射电子显微镜对样品进行成像。电子显微镜成像电压为100千伏。将10微升的加入氨基糖苷分子的dna溶液滴在一个铜网上，先覆盖一层火棉胶膜，然后用碳蒸气使碳粉层固定。碳粉层在氩气的作用下固定下来。然后，停留2分钟后，使用压力约为0.5巴的氩气吹干样品。铜网与气体软管出口之间的距离大约1厘米，角度大约为45
°
。孵育时间为2.5分钟。在含有1％乙酸铀或磷钨酸盐的染色溶液的情况下进行测量，60秒后将其去除。