血根碱及其衍生物在制备防治多发性硬化症药物中的应用

1.本发明属医药领域，涉及中药单体血根碱新的药用用途，具体涉及血根碱及其衍生物在制备防治多发性硬化症药物中的用途。


背景技术：

2.多发性硬化(multiple sclerosis，ms)是常见的中枢神经系统(central nervous system，cns)炎性脱髓鞘疾病，以炎性细胞浸润损害中枢神经髓鞘及轴索为主要病理表现的自身免疫性疾病。ms患者的主要临床表现为不同程度的肢体瘫痪、共济失调、大小便失禁以及感觉障碍等不可逆性神经功能障碍，且该病病程长达数十年，对患者的健康状况和生活质量造成了极大影响。ms是一种罕见病，多发于20-40岁的中青年群体，女性高于男性，全球约250万患者，是除创伤外年轻人永久致残的最常见病因，严重影响患者生活质量，给患者家庭和社会带来沉重负担，但目前全球范围内对于ms的防治均尚未获得较为理想的效果，其确切病因及发病机制亦尚未完全阐明[非专利文献1]。
[0003]
尽管目前有关ms的病理机制尚不清晰，但cd4+t细胞的异常活化(包括cd4+t细胞的激活、cns浸润和促炎性分化)及其所引起的白质脱髓鞘和轴突损伤已被学术界公认为是ms的关键病理进程[非专利文献2]。多数学者认为该病是一种自身免疫性疾病，遗传易感人群在环境因素的作用下，免疫系统产生了针对中枢神经系统髓鞘抗原的自身反应性淋巴细胞，包括t、b淋巴细胞，在一些趋化因子的作用下，免疫细胞穿过血脑屏障进入中枢神经系统(cns)，导致cns炎症、神经髓鞘破坏和继发轴索损害。有研究在ms病灶中发现了炎性细胞浸润，提示免疫应答异常参与了cns的髓鞘脱失，随后发生的神经元轴突损伤和髓鞘丢失则是ms病人临床神经症状出现的主要原因。
[0004]
多发性硬化目前尚无根治手段，ms的治疗主要包括急性发作期的大剂量激素冲击治疗和缓解期的疾病修饰治疗(disease-modifying therapy，dmt)，但尚无理想的治疗措施能阻止ms疾病的发展和神经功能残疾的恶化。据报道，世界范围内，目前有18种治疗多发性硬化药物可用，且小分子、多肽、单抗等药物均有分布，2019版《罕见病诊疗指南》推荐国际上的13种药物，如干扰素(注射)、醋酸格列默(注射)、芬戈莫德(口服)、特立氟胺(口服)、富马酸二甲酯(口服)、那他珠单抗(注射)、阿伦单抗(注射)、奥瑞珠单抗(注射)、米托蒽醌(注射)等，但是国内可选择药物极为有限(口服特立氟胺和注射用重组人β-1b干扰素)，调查显示其中31％患者由于药费昂贵而选择放弃治疗。上述治疗主要针对的是免疫调节，仅能延缓疾病的发作和恶化，尚不能从根本上改善髓鞘及轴突损伤，因而无法帮助患者恢复受损的神经功能，而促进髓鞘的再生、恢复髓鞘功能是改善进展型ms患者临床症状的关键。因此，寻找能促进髓鞘再生的疗法，成为了当前多发性硬化相关领域研究的新热点[非专利文献3]，而寻找既能调节神经炎症又能促进髓鞘再生的药物是业内研究人员关注的目标。
[0005]
本技术的研究团队利用生物信息学大数据分析，结合基因测序技术，通过自身建立的脱髓鞘和髓鞘再生数据库及神经炎症数据库进行多重数据库分析，并利用connectivity-map药物-基因表达谱数据库进行匹配，发现血根碱可能具有潜在的抑制神
remitting multiple sclerosis,rrms)、原发进展型多发性硬化症(primary progressive multiple sclerosis,ppms)、续发进展型多发性硬化症(secondary progressive multiple sclerosis,spms)或进展复发型多发性硬化症(progressive relapsing multiple sclerosis,prms)。
[0019]
本发明一方面提供血根碱在制备用于治疗多发性硬化症药物中的应用，本发明的实施例1中证实中高剂量的血根碱显著缓解动物的发病进程和疾病的严重程度，表明血根碱可能成为临床治疗多发性硬化症的新的药物。
[0020]
本发明中，制备的药物包括血根碱及其衍生物作为单一有效组分。
[0021]
本发明中，制备的药物以血根碱及其衍生物为主要活性成分，血根碱和一种或多种用于治疗多发性硬化症药物联合使用。
[0022]
本发明所述的血根碱在制备防治多发性硬化症药物中的应用还应具备如下技术特征：以血根碱或其衍生物为唯一有效成分或者包含血根碱或其衍生物及目前市场上已有的ms治疗药物中一种或几种药物组合物。
[0023]
本发明中，所述的用于治疗多发性硬化的治疗药物选自：干扰素、醋酸格列默、芬戈莫德、特立氟胺、富马酸二甲酯、那他珠单抗、阿伦单抗、奥瑞珠单抗、米托蒽醌、西尼莫德或达伐吡啶。
[0024]
本发明中，血根碱及其衍生物和联用的治疗药物包含在单一剂型中；或，血根碱及其衍生物和联用的治疗药物包含在不同剂型中。
[0025]
此外，上述的药物或药物组合可以和药学上常用的辅料制成任何剂型，即本发明制备的药物还含有制剂许可的药物赋形剂或载体，例如汤剂、注射剂、舌下片(丸)剂、气雾剂、蜜丸、水丸、糊丸、膏滋、膏药、软膏、栓剂、条剂、线剂、钉剂、糊丸、蜡丸、肠溶胶囊、散剂、片剂、粉针剂、离子透入剂、透皮吸收剂，以及脂质体、纳米粒、微球、缓控释等新型复杂制剂。
[0026]
另一方面，本发明所述的血根碱及其衍生物在治疗eae小鼠的同时，制备具有以下任一项用途的药物中的应用：
[0027]
1)用于改善多发性硬化症患者神经功能损伤症状；
[0028]
2)用于减少多发性硬化症患者炎症细胞浸润或炎症因子合成；
[0029]
3)用于减少多发性硬化症患者脱髓鞘损伤；
[0030]
4)用于减少多发性硬化患者外周血效应性t细胞数量。
[0031]
5)用于促进多发性硬化症患者损伤局部髓鞘再生
[0032]
为了便于理解，下面通过附图和具体实施例方式对发明的血根碱在多发性硬化疾病中减轻神经炎症、减少髓鞘损伤、抑制效应t细胞的应用进行详细的描述。需要特别指出的是，此

技术实现要素：
并非本揭示内容的完整概述，附图和具体实施例仅是为了说明，显然本领域的技术人员可以根据本文说明，对本发明进行各种修正或改变，这些修正和改变也将纳入本发明范围之内。
附图说明
[0033]
图1，血根碱能够剂量依赖性减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)模型小鼠临床神经功能评分。
[0034]
图2，血根碱能够减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)小鼠脊髓的炎症浸润(he染色)。
[0035]
图3，血根碱能减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)小鼠脊髓的髓鞘损伤(lfb染色)。
[0036]
图4，血根碱减少实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)小鼠外周免疫器官效应性t细胞(流式细胞分析)。
[0037]
图5，血根碱能抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)小鼠脊髓的t细胞浸润(免疫组织化学)。
[0038]
图6，血根碱抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)小鼠脊髓病灶局部细胞因子表达(rt-pcr)。
[0039]
图7，血根碱促进实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)小鼠脊髓髓鞘相关基因合成(rt-pcr)。
具体实施方式
[0040]
实施例1：血根碱改善实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)小鼠神经行为学功能障碍
[0041]
1.实验动物：
[0042]
本实验采用成年c57bl/6雌性小鼠，8～10周龄，体重18～20g(购自上海斯莱克公司)。实验期间小鼠自由进食进水；实验期间3级以上瘫痪及濒危小鼠予以单笼饲养，鼠粮用饲水浸湿后喂给。所有动物实验操作均符合复旦大学动物管理委员会实验动物伦理要求。
[0043]
2.eae模型制备：
[0044]
1)乳化剂准备：每只小鼠需要0.2ml乳化剂，其中含有300ug mog35-55+cfa+h37ra 1mg/ml。
[0045]
配制mog35-35母液：少突胶质细胞糖蛋白多肽片段-mog35-55(上海强耀公司人工合成，hplc级别，纯度95％以上)，计算最终用量，用消毒生理盐水溶解，终浓度为3mg/ml，置于冰上备用。
[0046]
免疫佐剂制备：将结核菌素粉末(h37ra)与完全弗氏佐剂混合(completefreund’s adjuvant,cfa,sigma公司，f5881)，结核菌素终浓度为2mg/ml)，在研钵中充分研磨保证结核菌素完全悬浮。
[0047]
1:1混合mog和完全弗氏佐剂(ifa+h37ra，终浓度为1mg/ml)。使用三通管使之混合和乳化，制备好后立即使用。
[0048]
2)小鼠麻醉：开放吸入5％～8％异氟烷麻醉，注射乳化剂过程中通过面罩吸入异氟烷维持麻醉。
[0049]
3)模型诱导：第0天，用1ml注射器吸取弗氏完全佐剂(cfa)乳化的抗原0.2ml，背部皮下分4点注射，每点注射50μl。同时腹腔注射200μl用pbs溶解的500ng pertussis toxin(ptx，百日咳毒素，sigma公司，p7208)，间隔48h再注射一次ptx。
[0050]
3.分组和给药：
[0051]
50只小鼠随机分为5组，每组10只，血根碱购于陕西宝鸡辰光生物科技有限公司：
[0052]
1)正常组(ctrl,control)
[0053]
2)模型+低剂量血根碱组(1mg/kg)(eae+san 1mg/kg)：从造模后第10天开始每天
灌胃给药，0.2ml/只/天
[0054]
3)模型+中等剂量血根碱组(2.5mg/kg)(eae+san 2.5mg/kg)：从造模后第10天开始每天灌胃给药，0.2ml/只/天
[0055]
4)模型+高剂量血根碱组(5mg/kg)(eae+san 5mg/kg)：从造模后第10天开始每天灌胃给药，0.2ml/只/天
[0056]
5)模型+溶剂对照组(eae+veh)：从造模第10天开始每天灌胃给予溶剂对照，0.2ml/只/天；
[0057]
4.eae模型临床神经功能评分标准：
[0058]
免疫后每天观察小鼠，直至实验结束(约4周)，依据kerlero等提出的标准对其进行神经功能评分:0，无症状；1,鼠尾张力障碍；2，单侧后肢的瘫痪；3，双后肢瘫痪伴有前肢无力；4，四肢瘫痪；5，濒死状态或死亡。死亡鼠在发现死亡当日记为5分，次日起不再计分；介于两个分级间的临床表现可以允许取两个分级的平均值。
[0059]
5.数据分析：
[0060]
采用graphpad prism 8.0软件进行分析，若p《0.05认为差异有显著性。
[0061]
6.结果：
[0062]
模型组小鼠最早于诱导后第10-11天出现症状，大部分以尾部远端张力下降、爬行时尾尖下垂为首发症状，发病进展集中在免疫后第14-20天，疾病高峰期为诱导后第17天，发病率为100％；血根碱低剂量组发病和溶剂对照组无明显区别，中等剂量和高剂量治疗组显著降低eae小鼠临床神经功能评分，且高剂量组疗效更为明显(如图1所示，*，**分别表示血根碱治疗组与eae组相比，p《0.05，0.01)。
[0063]
实施例2：血根碱抑制eae小鼠脊髓神经炎症及脱髓鞘损伤
[0064]
1.实验动物和模型制备：eae模型小鼠制备及给药同前，选取有显著治疗效果的5mg/ml剂量组观察血根碱对eae小鼠脊髓神经炎症和髓鞘损伤的影响。
[0065]
2.病理切片及神经炎症和脱髓鞘损伤观察：
[0066]
造模后第18天(高峰期)，小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，依次用pbs和4％多聚甲醛经心脏灌流固定组织，取脊髓腰膨大段常规制备石蜡切片，进行组织染色观察和分析，苏木精-伊红(he)和固蓝(luxol fast blue，lfb)染色分别观察炎症细胞浸润和髓鞘脱失情况，免疫组织化学染色观察中枢效应t细胞浸润情况。
[0067]
3.he染色：
[0068]
苏木精-伊红染色方法，简称he染色方法，是生物学和医学的细胞与组织学最广泛应用的染色方法。其染色原理为细胞核内的染色质主要是脱氧核糖核酸(dna)，dna的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而染色。苏木精在碱性染料中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。细胞浆内主要成分是蛋白质，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷(阳离子)，就可被带负电荷(阴离子)的染料染色。伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中解离成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷(阳离子)结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。染色步骤为1)二甲苯i脱蜡10min；二甲苯ii脱蜡5min；无水乙醇洗去二甲苯1min
×
2次；95％酒精1min；90％酒精1min；85％酒精1min；自来水洗2min；苏木精染色1min至5min。自来水洗1min；1％
blocking室温湿盒孵育30min，然后用pbs洗涤三次，每次5min；6、加入稀释好的辣根过氧化物酶(hrp)，标二抗，室温下湿盒孵育30min；7、用pbs洗涤玻片5次，每次5min；8、按照dab试剂盒说明书添加显色液，避光显色30s-5min，用蒸馏水终止显色反应；9、苏木精进行复染色3min，用蒸馏水冲洗；10、立即进行脱水和透明：1
×
5min 70％乙醇，1
×
5min 80％乙醇，1
×
5min 90％乙醇，1
×
5min100％乙醇，2
×
10min二甲苯；11、中性树胶封片。
[0082]
4.结果：
[0083]
流式细胞分析结果显示血根碱显著减少外周免疫器官效应t细胞的数量(图4)，免疫组织化学结果显示，模型组小鼠脊髓白质集中的部位尤其是靠近软脊膜处的白质有大量cd4+t细胞浸润，血根碱治疗后仅能观察到零星分布的cd4+效应性t细胞，提示血根碱减少脊髓cd4+效应细胞浸润，改善eae小鼠脊髓损伤(图5)。
[0084]
实施例4血根碱抑制中枢减少脊髓炎症因子合成，促进髓鞘再生相关基因表达
[0085]
1.实验动物和模型制备：
[0086]
eae模型小鼠制备及给药同前，造模后在疾病第18天(高峰期)处死小鼠，取脊髓。
[0087]
2.实时荧光定量pcr实验(rt-pcr)
[0088]
为了进一步验证血根碱在eae模型中对脊髓炎症和髓鞘再生的影响，我们通过rt-pcr实验检测脊髓组织炎症相关基因、髓鞘相关基因(plp1)以及与少突胶质细胞分化相关基因(pdgfa,sox10,olig2)的mrna表达。
[0089]
常规方法抽提脊髓腰膨大部位组织总rna，取1μg总rna进行逆转录合成cdna，1)在ep管中加入如下反应混合物：模板rna 1.5μg，oligo(dt)15 1μl，并用rnase-free超纯水定容至24μl；2)稍微震荡混匀后瞬时离心3-5s；3)在70℃水浴下反应5min后，将ep管置于冰上，瞬时离心3-5s；4)在冰浴环境下，往ep管内继续加入：5x mmlv reaction buffer 10μl，rnase inhibito 1μl，dntp mix 2.5μl，mmlv rt 1μl，并加11.5μl rnase-free超纯水，总反应体系为50μl；5)反应混合物在37℃水浴环境下反应60min；6)将反应混合物置于95℃金属浴加热5min终止酶活性并结束反应后，迅速将ep管置于冰上，随后继续扩增实验或置于冰箱内保存。
[0090]
real-time pcr扩增：96孔pcr板中每孔加入：10μl 2x sybr mix，1μlforward primer，1μl reverse primer，1μl cdna，7μl超纯水。用专用膜封闭96孔板后，1000rpm离心2min。(所使用的引物序列如下，
[0091]
nos2：gtgaggatcaaaaactgggg and acctgcaggttggaccac；il-1β：tcgcagcagcacatcaacaagag and tgctcatgtcctcatcctggaagg-3
′
；tnf-α：gcctcttctcattcctgcttgtgg and gtggtttgtgagtgtgagggtctg；arg1：ctccaagccaaagtccttagag and aggagctgtcattagggacatc；mrc1：ctctgttcagctattggacgc and cggaatttctgggattcagcttc；ym1：ctggaattggtgcccctaca and caagcatggtggttttacagga；plp1：ctgagcgcaacgtttgtgg and tacattctggcatcagcgca；pdgfrα：ggagactcaagtaaccttgcac and tcagttctgacgttgctttcaa；sox10：aggttgctgaacgaaagtgac and ccgaggttggtacttgtagtcc；olig2：tccccagaacccgatgatctt and cgtggacgaggacacagtc)
[0092]
荧光实时定量pcr结果分析：
[0093]
目的基因mrna的表达量用2-δδct公式计算，δct＝ct(目的蛋白)-ct(hprt)。
[0094]
δδct为除正常对照组外的各实验组，其δct减去正常对照组的δct，通过2-δδct公式计算出对照组目的基因相对mrna含量平均值，其余组别目的基因mrna相对含量为对照组平均值的倍数。
[0095]
3.结果：
[0096]
血根碱治疗后显著下调m1表型促炎基因nos2、tnf-、il-1表达，上调m2型抑炎基因arg1、ym1、mrc等基因的表达(图6)。同时，血根碱上调髓鞘相关基因plp1表达，促进少突胶质细胞系分化相关基因如pdgfa,sox10,olig2mrna表达(图7)，提示血根碱能抑制神经炎症，调控损伤局部微环境，促进髓鞘再生。