5-溴刺甘草查尔酮化合物在制备抗癌药物中的应用

1.本发明属于医药领域，具体涉及一种5-溴刺甘草查尔酮化合物在制备抗癌药物中的应用。


背景技术：

2.癌症是威胁人民生命健康的重大疾病。近年来，随着中国的工业化进程，环境污染、食品安全等因素导致癌症发生率逐年增加。根据国家癌症中心《2019年全国癌症报告》，恶性肿瘤发病约392.9万人，死亡约233.8万人。平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7.5个人被确诊为癌症。近10多年来，恶性肿瘤发病率每年保持约3.9％的增幅，死亡率每年保持2.5％的增幅。此外，癌症治疗药物高度依赖国外进口，不仅治疗费用高，而且药物的整体有效率低(大约25％)。这些因素促使我们加快科学研究，了解癌细胞的作用机制，并针对性地开发高效的、具有自主知识产权的抗癌药物。
3.蛋白酪氨酸磷酸酶1b(protein tyrosine phosphatase 1b，ptp1b)作为蛋白酪氨酸磷酸酶(ptps)家族中最具代表性的成员，在信号转导过程中起关键作用，并在许多生理调节过程中也具有重要作用，其主要通过调节细胞内酪氨酸的磷酸化水平来调控细胞的生长、分化、代谢、迁移、基因转录和凋亡等。大量的实验研究表明，ptp1b在肿瘤细胞中过表达，且能影响肿瘤的发生和转移。因此，ptp1b能够作为治疗恶性肿瘤的潜在靶点。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效抑制ptp1b高表达肿瘤细胞增殖及转移的抗癌药物。
5.一种5-溴刺甘草查尔酮化合物在制备抗癌药物中的应用，所述的5-溴刺甘草查尔酮化合物的结构如式(i)所示：
[0006][0007]
作为优选，所述的抗癌药物用于治疗前列腺或卵巢癌。
[0008]
作为优选，所述的抗癌药物用于抑制前列腺癌细胞pc3和du145、卵巢癌细胞株a2780和skov3的增殖。
[0009]
作为优选，所述的抗癌药物用于抑制前列腺癌细胞pc3和du145、卵巢癌细胞株a2780和skov3的转移。
[0010]
作为优选，所述的药物还含有药学上可接受的载体或赋形剂。
[0011]
实验证明，式i化合物5-溴刺甘草查尔酮化合物对于前列腺癌细胞和卵巢癌细胞，包括但不限于例如人前列腺癌细胞pc3和du145、人卵巢癌细胞a2780和skov3等，均有显著抑制肿瘤细胞增殖和转移的效用，因此，可以作为一种潜在的抗癌药物进行开发。
附图说明
[0012]
图1为实施例1得到式i的氢谱；
[0013]
图2为实施例4得到的细胞集落形成实验的结果；
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图3为实施例5得到的细胞粘附实验的结果；
[0015]
图4为实施例6得到的transwell实验的结果。
具体实施方式
[0016]
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
[0017]
以下实施例中，以前列腺癌细胞pc3和人卵巢癌细胞skov3为例说明式i化合物(5-溴刺甘草查尔酮化合物)在抑制前列腺癌细胞和卵巢癌细胞增殖方面的效用，但应理解的是，虽然仅以人前列腺癌细胞pc3和人卵巢癌细胞skov3为例说明其用于制备抗癌药物的用途，但本发明所称的“癌症”细胞包括但不限于例如人前列腺癌细胞pc3和du145、人卵巢癌细胞a2780、skov3等。实验证明，式i化合物(5-溴刺甘草查尔酮化合物)对于多种人前列腺癌细胞和人卵巢癌细胞，包括但不限于例如人前列腺癌细胞pc3和du145、人卵巢癌细胞a2780、skov3等，均有显著抑制肿瘤细胞增殖的效用。
[0018]
实验材料：
[0019]
人正常肝(lo2，正常细胞)细胞株、人卵巢癌(skov3、a2780)、人前列腺癌细胞(pc3、du145)细胞株购自中国典型物种保藏中心(ctcc)。
[0020]
实施例1式i化合物5-溴刺甘草查尔酮化合物的合成及表征
[0021]
(e)-3-(5-溴-2-甲氧基-4-(四氢-2h-吡喃-2-酰氧基)苯基)-1-(4-羟基苯基)-2-烯-1-酮(0.21mmol)溶于吡啶(3ml)中，缓慢加入酰氯(0.23mmol)。室温反应2h后，用h2o(5ml)淬灭，用乙酸乙酯(2
×
10ml)提取。组合的有机层用盐水(10ml)洗涤，在无水mgso4上干燥，过滤，真空浓缩，用柱层析纯化残渣得到纯的化合物，氢谱谱图见图1。1h nmr of i(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):10.99(s,1h),8.39(d,j＝6.7hz,4h),8.26(d,j＝8.7hz,2h),8.21(s,1h),7.94(d,j＝15.6hz,1h),7.83(d,j＝15.6hz,1h),7.52(d,j＝8.7hz,2h),6.63(s,1h),3.83(s,3h).
[0022]
实施例2抗肿瘤活性的检测
[0023]
将lo2、skov3细胞分别接种于96孔板中，接种密度为5000个细胞/160μl/孔，等细胞6小时贴壁后，加入40μl含有相应浓度式i化合物(5-溴刺甘草查尔酮化合物)和阳性参考化合物的培养基或者等体积的含0.1％dmso的培养基。继续孵育48h，之后再加入mtt(5mg/ml)孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加100ul dmso，振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，计算半数抑制浓度ic
50
值。结果见下表：
[0024]
表1 化合物1和阳性对照化合物的ic
50
值
[0025]
[0026][0027]aic
50
值表示抑制一半肿瘤细胞活力所需要的药物浓度。本次实验的数据来源于3次独立重复实验的结果，且数据的处理方式为标准方差，本实验的药物处理时间为48小时。b阳参化合物对应参考文献zhiguo liu,et al.bioorganic&medicinal chemistry letters 21(2011)3755-3758里面的化合物13。
[0028]
实验结果表明，式i化合物(5-溴刺甘草查尔酮化合物)对正常细胞(lo2)的细胞毒性小于阳性参考化合物，对卵巢癌细胞株的抗肿瘤效果相对于阳性参考化合物明显提升，可见比现有化合物具有更强的抗癌活性和更低的毒性。
[0029]
实施例3
[0030]
为进一步研究式i化合物(5-溴刺甘草查尔酮化合物)的抗癌活性，进一步按照实施例2的方法测试了对其他几种癌细胞(pc3、du145、a2780)的活性，结果见表2。
[0031]
表2
[0032][0033]
表2的结果表明，对于其他几种前列腺癌细胞株和卵巢癌细胞株，式i化合物同样具有较好的抗肿瘤效果，说明该化合物可以作为一种有潜力的抗癌化合物。
[0034]
实施例4细胞集落形成实验
[0035]
将pc3和skov3细胞培养于35mm的corning激光共聚焦培养皿中。加入指定浓度的式i化合物(5-溴刺甘草查尔酮化合物)孵育48h后，然后用胰蛋白酶消化细胞，使之分离成单个细胞，离心收集细胞沉淀。再把加药处理过的细胞铺入新的12孔板中，每个孔的细胞密度为500个/孔，每个孔加入1ml完全培养基于37℃继续孵育10天。用4％的多聚甲醛固定15分钟，然后用0.04％结晶紫染液室温下染色15分钟。用显微镜观察细胞集落的数量，结果见图2。
[0036]
实验结果表明，经过式i化合物(5-溴刺甘草查尔酮化合物)处理之后，pc3和skov3细胞的集落形成能力被显著的抑制。
[0037]
实施例5细胞粘附实验：
[0038]
提前一天，在4℃下，用2.5μg/ml人纤连蛋白fn混匀在pbs中然后每孔50μl包被96孔板过夜。将加药处理过的pc3和skov3细胞，以每孔5
×
104个细胞的密度混合于无血清培养基中，并用排枪小心的接种在人纤维蛋白预处理过的干燥板上(至少每个样品3个平行孔)，并置于在37℃，5％co2恒温培养箱中培养30min左右，期间要每隔10min看一次细胞形态，贴壁情况。待对照组细胞贴壁到大概30％的时候，小心的取出96孔板。用4％多聚甲醛固定15min，用结晶紫染色5min，用33％冰醋酸去完全溶解染色部分，并通过560nm处的吸光度测定颜色强度。使用以下等式计算附着于细胞外基质的细胞的相对数目：处理细胞的平均od/对照细胞的平均od。用0.1％dmso处理的pc3或者skov3细胞用作对照，实验结果见图3。
[0039]
实验结果表明，经过式i化合物(5-溴刺甘草查尔酮化合物)处理之后，pc3和skov3细胞与外基质的粘附能力明显减弱。
[0040]
实施例6transwell实验：
[0041]
将细胞按照密度为2.5
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105个/孔接种于6孔板中，等到细胞贴壁后分别加入相应浓度的式i继续孵育48小时，消化、计数细胞，将1
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105个细胞混于100μl不含血清的培养基中并接种在transwell小室中，小室下方加入600μl含有血清的培养基。把transwell板放入培养箱继续培养48h；用棉花签擦干净小室内层上未穿过去的细胞，每个孔内加入4％的多聚甲醛室温下固定15min。用pbs沿着小室的侧壁清洗，用棉签粘干多余的水。每孔内加入500μl结晶紫避光染色5min；用dd h2o沿小室侧壁洗干净未染上细胞的结晶紫，再用棉签粘干水。于显微镜下观察细胞的透膜情况。用0.1％dmso处理的pc3或者skov3细胞用作对照，实验结果见图4。
[0042]
实验结果表明，经过式i化合物(5-溴刺甘草查尔酮化合物)处理之后，pc3和skov3细胞的透膜能力明显减弱。
[0043]
由以上实验结果可见，式i化合物5-溴刺甘草查尔酮化合物能够有效抑制前列腺癌和卵巢癌细胞的增殖和转移，可用于制备有效抗前列腺癌和卵巢癌的药物。