厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物在制备靶向红细胞的药物载体中的应用的制作方法

1.本发明涉及药物化学技术领域，具体而言，涉及一种厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物在制备靶向红细胞的药物载体中的应用。


背景技术：

2.厚朴酚以及和厚朴酚是中国传统中药厚朴的主要活性成分，通常由传统中药厚朴提取物经过结构改造而获得，厚朴酚以及和厚朴酚的化学结构式分别如下：
[0003][0004]
1930年日本杉井首先从中国厚朴树皮中分离得到了厚朴酚(中草药；2005,36,10,1591-1594)。1989年中国的孟丽珍等也从厚朴分离到和厚朴酚(中成药：1989,11(8)：223.)。
[0005]
厚朴酚以及和厚朴酚具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、肌肉松弛、降胆固醇和抗衰老等广泛的药理作用(中草药；2005,36,10,1591-1594)，如在授权公告号为cn103113264b的中国专利公开的动物药效实验显示该类化合物对急性缺血性脑损伤有显著的脑保护作用，有望成为脑卒中疾病的治疗药物。
[0006]
红细胞作为药物载体，可实现药物靶向性递送，延长药物在体内的半衰期，增强药物在体内的稳定性，提高药物的生物相容性。目前，其已用于包载抗肿瘤药、抗炎药、镇痛药、抗感染药、心血管系统药物以及免疫抑制剂等小分子药物，还可包载部分大分子药物和诊断剂等，被认为是一种良好的药物载体(中国药科大学学报2015,46(4)：481-487)。
[0007]
然而，目前将药物负载到红细胞上的通常做法是，将体外分离的红细胞在含有目标药物的低渗溶液中扩张，使目标药物进入红细胞，再以高渗溶液处理得到载药红细胞，这种做法具有一定的局限性，一是需要体外完成红细胞载药，二是红细胞的反复处理可能影响其细胞功能。


技术实现要素：

[0008]
本发明的主要目的在于提供一种厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物在制备靶向红细胞的药物载体中的应用，以解决现有技术中红细胞载药存在的局限性问题。
[0009]
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物在制备靶向红细胞的药物载体中的应用，该厚朴酚芳环氨基或和厚
朴酚芳环氨基类衍生物为通式i所示化合物或其药学上可接受的盐：
[0010]
通式i中，r1和r4分别独立地选自c1～c8的烃基，且c1～c8的烃基中的碳原子可选地被n、o、s取代；r2和r3分别独立地选自氢或羟基，且r2和r3不同时为氢或羟基；r5为h、c1～c8的酰基、氨基酸在羧基发生缩合后的剩余酰基部分、或多肽在羧基发生缩合后的剩余酰基部分。
[0011]
进一步地，上述c1～c8的烃基为烷基或烯基，且c1～c8的烷基或烯基中的碳原子可选地被n、o、s取代。
[0012]
进一步地，上述c1～c8的烃基选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3烯基、戊-1-烯基、戊-2-烯基、戊-3-烯基、戊-4-烯基、己-1-烯基、己-2-烯基、己-3-烯基、己-4-烯基、己-5-烯基、庚-1-烯基、庚-2-烯基、庚-3-烯基、庚-4-烯基、庚-5-烯基、庚-6-烯基、辛-1-烯基、辛-2-烯基、辛-3-烯基、辛-4-烯基、辛-5-烯基、辛-6-烯基、辛-7-烯基中的任意一种。
[0013]
进一步地，上述r1和r4分别独立地为烯丙基。
[0014]
进一步地，上述c1～c8的酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基或辛酰基中的任一种；氨基酸选自赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、6-羟基正亮氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸苏氨酸、酪氨酸、胱氨酸和半胱氨酸中的任一种；多肽为多个氨基酸形成的肽，且其分子量≤2500da。
[0015]
进一步地，上述氨基酸为赖氨酸。
[0016]
进一步地，当上述厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物为通式i所示化合物的药学上可接受的盐时，药学上可接受的盐选自盐酸盐、草酸盐或富马酸盐形式中的任意一种。
[0017]
进一步地，上述厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物包括并不限于以下化合物中的一种或多种：3'，5-二烯丙基-3-乙酰胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯、3'，5-二烯丙基-3-[(s)-2,6-二氨基-1-己酰]胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯及其盐酸盐、3'，5-二烯丙基-3-[(s)-3-苯基-2-氨基-1-丙酰]胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯及其盐酸盐、3'，5-二烯丙基-3-[(r)-2,6-二氨基-1-己酰]胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯及其盐酸盐、3'，5-二烯丙基-3-[(s)-2-氨基-6-羟基-1-己酰]胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯及其盐酸盐、3'，5-二烯丙基-3-[(s)-2-氨基-4-甲硫基-1-丁酰]胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯及其盐酸盐、
3'，5-二烯丙基-3-[(s)-3-甲基-2-氨基-1-丁酰]胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯及其盐酸盐、3'，5-二丙基-3-[(s)-2,6-二氨基-1-己酰]胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯及其盐酸盐。
[0018]
应用本发明的技术方案，由于通式i所示结构的厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物能够作为靶头被血红细胞识别、结合，因此本技术利用厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物作为载体并利用其对红细胞的靶向作用将药物负载到红细胞上。具体地，药物活性分子可以与通式i所示结构中的氨基、羟基等官能团直接或间接的化学结合，从而利用厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物作为靶向红细胞的药物载体，伴随着红细胞在血液中运输带动药物活性成分到达病灶实现靶向施药，为红细胞载药提供了一种新的手段。
附图说明
[0019]
构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0020]
图1示出了化合物1在高效液相下的标准曲线图；
[0021]
图2示出了化合物1的高效液相色谱图；
[0022]
图3示出了与红细胞作用的化合物1的量与时间的关系图；
[0023]
图4示出了2d下单个红细胞与化合物2的结合情况图；
[0024]
图5示出了3d下单个红细胞与化合物2结合后的红细胞正面图；以及
[0025]
图6示出了3d下单个红细胞与化合物2结合后的红细胞侧面图。
具体实施方式
[0026]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0027]
正如背景技术部分所描述的，现有技术中的红细胞载药存在的局限性问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物在制备靶向红细胞的药物载体中的应用。
[0028]
在本技术的一种典型的实施方式中，提供了一种厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物在制备靶向红细胞的药物载体中的应用，该厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物为通式i所示化合物或其药学上可接受的盐：
[0029][0030]
通式i中，r1和r4分别独立地选自c1～c8的烃基，且c1～c8的烃基中的碳原子可选地被n、o、s取代；r2和r3分别独立地选自氢或羟基，且r2和r3不同时为氢或羟基；r5为h、c1～c8的酰基、氨基酸在羧基发生缩合后的剩余酰基部分、或多肽在羧基发生缩合后的剩余酰基部分。
[0031]
由于通式i所示结构的厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物能够作为靶头被血红细胞识别、结合，因此本技术利用厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物作为载体并利用其对红细胞的靶向作用将药物负载到红细胞上。具体地，药物活性分子可以与通式i所示结构中的氨基、羟基等官能团直接或间接的化学结合，从而利用厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物作为靶向红细胞的药物载体，伴随着红细胞在血液中运输带动药物活性成分到达病灶实现靶向施药，为红细胞载药提供了一种新的手段。
[0032]
为进一步地提高厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物的合成效率，从而进一步地开拓其在制备靶向红细胞的药物或药物载体的用途，优选上述c1～c8的烃基为烷基或烯基，且c1～c8的烷基或烯基中的碳原子可选地被n、o、s取代。
[0033]
r1和r4为c1～c8的烃基，位于各苯环羟基的邻位或对位，其电子效应和空间效应会影响苯环上各位点的反应活性，为尽可能使各苯环上的羟基及羟基邻位等位点具有较高的反应活性，以便更容易得到靶向红细胞的药物或药物载体，优选上述c1～c8的烃基选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3烯基、戊-1-烯基、戊-2-烯基、戊-3-烯基、戊-4-烯基、己-1-烯基、己-2-烯基、己-3-烯基、己-4-烯基、己-5-烯基、庚-1-烯基、庚-2-烯基、庚-3-烯基、庚-4-烯基、庚-5-烯基、庚-6-烯基、辛-1-烯基、辛-2-烯基、辛-3-烯基、辛-4-烯基、辛-5-烯基、辛-6-烯基和辛-7-烯基中的任意一种。
[0034]
为进一步地提高厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物的合成便利性，优选上述r1和r4分别独立地为烯丙基。
[0035]
在本技术的一种实施例中，上述c1～c8的酰基选自甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基或辛酰基中的任一种；氨基酸选自赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、6-羟基正亮氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸苏氨酸、酪氨酸、胱氨酸和半胱氨酸中的任一种；多肽为多个氨基酸形成的肽，且其分子量≤2500da。
[0036]
上述种类的酰基、氨基酸以及多肽相对容易获得，且氨基酸多为人体所需种类，经济型和安全性更好。
[0037]
为进一步地提高上述药物载体靶向红细胞后对人体的有益效果，优选上述氨基酸为赖氨酸。
[0038]
在本技术的一种实施例中，当上述厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物为通式i所示化合物的药学上可接受的盐时，药学上可接受的盐选自盐酸盐、草酸盐或富马酸盐形式中的任意一种。
[0039]
当上述厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物为通式i所示化合物的药学上可接受的盐时，其水溶性好，有利于体内环境中红细胞负载药物，从而提高载药效率。
[0040]
在一些实施例中，上述厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物包括并不限于以下化合物中的一种或多种：3'，5-二烯丙基-3-乙酰胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯、3'，5-二烯丙基-3-[(s)-2,6-二氨基-1-己酰]胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯及其盐酸盐、3'，5-二烯丙基-3-[(s)-3-苯基-2-氨基-1-丙酰]胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯及其盐酸盐、3'，5-二烯丙基-3-[(r)-2,6-二氨基-1-己酰]胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯及其盐酸盐、3'，5-二烯丙基-3-[(s)-2-氨基-6-羟基-1-己酰]胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯及其盐酸盐、3'，5-二烯丙基-3-[(s)-2-氨基-4-甲硫基-1-丁酰]胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯及其盐酸盐、3'，5-二烯丙基-3-[(s)-3-甲基-2-氨基-1-丁酰]胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯及其盐酸盐、3'，5-二丙基-3-[(s)-2,6-二氨基-1-己酰]胺基-2，4'-二羟基-1，1'-联苯及其盐酸盐。
[0041]
以下将结合具体实施例，对本技术的有益效果进行说明。
[0042]
实施例1
[0043]
3',5-二烯丙基-3-[(s)-2,6-二氨基-1-己酰]胺基-2,4'-二羟基-1,1'-联苯
·
盐酸盐(英文名：(s)-2,6-diamino-n-(3',5-diallyl-2,4'-dihydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)hexanamide dihydrochloride，化合物1)的红细胞的亲和性实验：
[0044][0045]
步骤1，高效液相色谱(hplc)标准曲线法中化合物1浓度-紫外吸收线性范围测定实验。
[0046]
配制1mg/ml的化合物1的溶液(溶液中的溶剂包括的生理盐水和甲醇的体积比为1:5)作为对照品储备液，再使用逐级稀释法配制2μg/ml、4μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml的对照品溶液。
[0047]
高效液相色谱条件为：agilent zorbax sb-c18(5μm，4.6
×
250nm色谱柱)、agilent technologics紫外检测器、流动相a(20mmol/l的磷酸二氢钠)、流动相b(乙腈)、流速1ml/min、柱温35℃、检测波长212nm和进样量40μl。
[0048]
将上述6个浓度的对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，按照表1所示的梯度洗脱
1，1'-联苯
·
盐酸盐(英文名：(s)-2-amino-n-(3',5-diallyl-2,4'-dihydroxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl)-6-(5-((3as,4s,6ar)-2-oxohexahydro-1h-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)hexanamide hydrochloride，化合物2)的制备及红细胞靶向负载研究：
[0064][0065]
1)化合物2的制备：
[0066][0067]
将d-(+)-生物素(100mg，0.41mmol)、dcc(110mg，053mmol)和nhs(47mg，0.41mmol)溶于5ml的n,n-二甲基甲酰胺于室温搅拌3h。加入化合物1(200mg，0.41mmol)和三乙胺(140mg，1.38mmol)，室温搅拌过夜。浓缩，残留盐酸酸化、c18柱纯化得化合物2(31mg，纯度95.18％)。
[0068]
上述化合物2的分子式为c
34h46
cln5o5s，ms：636.3[m+h]
+
(游离态)；1h-nmr(400mhz,meod)δ7.48(1h,s),δ7.22-7.18(2h,m),δ6.91-6.84(2h,m),δ6.05-5.98(2h,m),5.11-5.01(4h,m),4.48(1h,t),4.28(1h,q),4.18(1h,t),3.40(2h,d),3.36(2h,d),3.25-3.15(3h,m),2.94-2.89(1h,dd),2.72(1h,d),2.16(2h,t),2.00(2h,m),1.67-1.51(8h,m),1.40-1.36(2h,m)。
[0069]
2)化合物2对靶向红细胞的靶向载体研究：
[0070]
步骤1，试剂准备：
[0071]
1.称约50mg化合物2加入50ml生理盐水，混匀溶解，得到1mg/ml化合物2储备液。吸取1mg/ml化合物2储备液200μl，分别加入800μl生理盐水，混匀得到浓度为200μg/ml的化合物2工作液。
[0072]
2.取100μl、4％的多聚甲醛溶液，加入300μl生理盐水，混合得到1％的多聚甲醛溶液，备用。
[0073]
3.取10ml聚乙二醇辛基苯基醚(triton x-100)溶液，加入90ml生理盐水，混匀得10wt％的triton x-100储备液，4℃保存，备用。取100μl、10wt％的上述triton x-100储备液，加入900μl的生理盐水混匀，得1wt％的triton x-100溶液，备用。取10μl的上述1wt％的triton x-100溶液，加入990μl的生理盐水混匀，得0.01wt％的triton x-100溶液，备用。
[0074]
4.取100μl monoclonal anti-biotin
–
fitc抗体溶液，加入900μl生理盐水混匀。将1ml上述稀释后的抗体溶液分装，每份100μl，再加入900μl生理盐水混匀，得抗体工作液。-20℃保存，备用。
[0075]
5.称取4mg的dir粉末，加入4ml的dmso溶解，得1mg/ml的dir储备液，取100μl、1mg/mldir储备液，加入900μl生理盐水混匀，得100μg/ml dir溶液。取400μl、100μg/ml dir溶液，加入600μl生理盐水混匀，得40μg/ml的dir工作液。
[0076]
步骤2，化合物2制备的靶向红细胞药物载体及激光共聚焦扫描显微镜观察：
[0077]
1.配制200μg/ml化合物2的生理盐水溶液，取1ml上述溶液加入100μl红细胞(rbc)，于37℃水浴中孵育10min。离心(4800rpm，4min，4℃)加入1ml生理盐水，洗涤三次。
[0078]
2.向1得到的上述rbc中加入100μl、1％的多聚甲醛溶液，固定15min，间或摇动，离心(4800rpm，4min，4℃)，去上清，用1ml生理盐水洗涤3次后去除上清液。
[0079]
3.向2得到的上述100μl rbc中加浓度为0.01％的triton x-100透膜液100μl，于室温下温和作用5min。用1ml生理盐水洗涤3次后，去除上清液。
[0080]
4.向3得到的上述100μl的rbc中加入400μl的5％bsa(牛血清白蛋白)封闭液，室温封闭1h，间或摇动，使细胞充分接触溶液，离心(4800rpm，4min，4℃)，用1ml生理盐水洗涤3次后，去除上清液。
[0081]
5.向4得到的上述100μl的rbc中加入200μl抗体溶液(对化合物2进行fitc标记(绿色荧光)、浓度稀释为1：100)，室温避光孵育1h，离心(4800rpm，4min，4℃)，去除上清液。用1ml生理盐水洗涤3次后，去除上清液。
[0082]
6.向5得到的上述100μl的rbc中加入100μl的浓度为40μg/ml的dir染液(将红细胞膜标记为红色荧光)，避光孵育20min，离心(4800rpm，4min，4℃)，去除上清液。用1ml生理盐水洗涤3次，去除上清液。滴2～3滴抗荧光淬灭剂对红细胞进行重悬，滴一滴至载玻片上，盖上盖玻片，采用激光共聚焦扫描显微镜观察荧光。
[0083]
在激光共聚焦扫描显微镜(lscm)下，采用490～495nm波长的激发光，激光共聚焦扫描显微镜能够观察到绿色荧光，发射光为520～530nm，采用590nm波长的激发光，激光共聚焦扫描显微镜能够观察到红色荧光，发射光为617nm。将两种颜色进行叠加，激光共聚焦扫描显微镜能够同时观察到红色荧光和绿色荧光，具体的，2d下与化合物2结合的单个红细胞的荧光如图4所示，3d下与化合物2结合的单个红细胞正面的荧光如图5所示，3d下与化合物2结合的单个红细胞侧面的荧光如图6所示，从红细胞正面图可观察到化合物2存在于红细胞的表面，从红细胞侧面图可观察到化合物2存在于红细胞的内部。由此可见，化合物1结合生物素(即维生素h)后形成的化合物2能够被红细胞识别和负载，体现了化合物1的载体用途。鉴于此，类似地和厚朴酚芳环氨基衍生物(化合物1)结合抗癌药甲氨蝶呤、桦木酸、长春新碱等药物活性分子，也可以作为药物载体靶向红细胞，从而伴随着红细胞在血液中运输带动药物活性成分到达病灶实现靶向施药，为红细胞载药提供了一种新的手段。
[0084]
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
[0085]
由于通式i所示结构的厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物能够作为靶头被血红细胞识别、结合，因此本技术利用厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物作为载体并利用其对红细胞的靶向作用将药物负载到红细胞上。具体地，药物活性分子可以与通式i所示结构中的氨基、羟基等官能团直接或间接的化学结合，从而利用厚朴酚芳环氨基或和厚朴酚芳环氨基类衍生物作为靶向红细胞的药物载体，伴随着红细胞在血液中运输带动药物活性成分到达病灶实现靶向施药，为红细胞载药提供了一种新的手段。
[0086]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。