一种糖苷类化合物在制备预防或/和治疗肝损伤药物中的应用

1.本发明涉及一种糖苷类化合物在制备预防或/和治疗肝损伤药物中的应用，属于医药技术领域。


背景技术：

2.对乙酰氨基酚(acetaminophen，apap)被认为是临床上治疗剂量下最常见的解热镇痛药，但许多治疗感冒的复方制剂中都含有apap，这导致公众在购买感冒药治疗疾病时不知不觉地过度使用apap，药物过量很容易引发肝损伤，如果肝损伤得不到及时合理的控制，就会导致肝纤维化、肝硬化，甚至肝功能衰竭等严重疾病。据调查，目前apap仍是临床药物性肝损伤的主要来源。通常apap给药后，大部分apap将被代谢成无毒的葡萄糖醛酸加合物，并被肝脏ⅱ相代谢酶硫酸化，然后通过尿液和粪便排泄。一小部分apap(约5
‑
15%)还被细胞色素p450酶代谢成活性代谢物n
‑
乙酰
‑
对苯醌亚胺(napqi)，napqi可与肝细胞内的谷胱甘肽(gsh)结合而转化为无毒产物。虽然在正常情况下，肝细胞内还原型gsh可以中和napqi，但过量的apap会产生过多的napqi，导致细胞内和线粒体gsh储备的耗竭，导致活性氧(ros)的过量产生，从而导致氧化应激和线粒体功能障碍，导致肝细胞坏死和凋亡。
3.现在临床上常用的预防或治疗apap肝损伤的可行方法是给药n
‑
乙酰
‑
l
‑
半胱氨酸(nac)或维生素c。但是，其治疗效果不尽人意，nac可通过直接与gsh结合或增加gsh的合成来提高napqi的中和能力，从而降低apap的肝毒性。但是，nac治疗过程中所引发的副作用明显，对胃肠道、中枢神经系统和呼吸道都有刺激，易出现恶心、呕吐，头晕，支气管痉挛、咯血等不良反应。
4.天然植物中常见的抗氧化剂有黄酮、木脂素等。特别是含有多酚羟基的黄酮类化合物，在体内可通过抗脂质过氧化、清除活性自由基和作用于酶而发挥抗氧化活性，实验和临床实践证明，黄酮类化合物具有较强的保肝作用。临床上用于治疗急、慢性肝炎、肝硬化和多种中毒性肝损伤。
5.目前尚未见本发明糖苷类化合物在药源性肝损伤保护中的应用报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种来源于红香树（annesleafragrans wall.）的糖苷类化合物的新用途，即结构式如下式所示的糖苷类化合物在制备预防或/和治疗肝损伤药物中的用途：
；本发明预防或/和治疗肝损伤药物是以糖苷类化合物为活性成分，用于制备治疗肝损伤药物，还可以加入一种或多种药物制剂上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等；或者与其他活性成分复配发挥协同预治肝损伤的作用；可以制成药剂学上适宜的使用剂型，例如胶囊、丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。
7.本发明所述糖苷类化合物confusoside是以红香树树叶为原料，通过自然干燥粉碎，采用超声辅助提取的方法制得乙醇提取物，定量分析其含量达111.84
±
9.53mg/g乙醇提取物，将乙醇提取物经硅胶柱分离纯化得到的糖苷类化合物confusoside。
8.本发明致力于该糖苷类化合物confusoside对apap造成的药源性肝损伤的预防和缓解作用的实验研究，经过对小鼠灌胃给药糖苷类化合物confusoside后，腹腔注射apap测试，可见肝损伤症状得到明显改善。
9.细胞毒性实验结果表明，人肝癌细胞（hepg2细胞）单次给药12.5、25、50、100和200μg/ml confusoside，100μg/ml内未见细胞存活率降低；对小鼠20mg/kg、60mg/kg confusoside给药，未见小鼠有包括抽搐、震颤、腹泻、嗜睡、呼吸困难和昏迷等行为；confusoside在低浓度时不会对生物机体及细胞健康造成危害。
10.本发明对糖苷类化合物confusoside预防和缓解apap造成的肝损伤进行了研究，证实了confusoside可以降低apap造成的肝损伤的程度，改善肝组织病变和肝细胞损伤，降低脏器指数及评价肝损伤的谷丙转氨酶（alt）、谷草转氨酶（ast）、乳酸脱氢酶（ldh）指标，可以促进抗氧化、抑制炎症反应抑制细胞凋亡，减少氧化应激和过度炎症造成的机体和细胞损伤，因此可作为一种新的预防和治疗药源性肝损伤的药品开发。
11.与现有技术相比，本发明具有如下优点：1、本发明为传统天然植物红香树提供了新的药用途径；2、本发明糖苷类化合物confusoside在较低浓度时不会对生物体和细胞造成明显损伤，可显著降低肝损伤，安全性高；3、本发明糖苷类化合物制备工艺简单，化合物在天然植物中含量丰富，适于工业化生产和市场推广应用。
附图说明
12.图1为不同浓度confusoside化合物给药hepg2细胞毒性实验的细胞存活率结果；图2为不同浓度confusoside抑制apap诱导的细胞凋亡，通过av/pi和流式细胞仪检测hepg2细胞凋亡的control组（正常对照组）结果；
图3为不同浓度confusoside抑制apap诱导的细胞凋亡，通过av/pi和流式细胞仪检测hepg2细胞凋亡的apap组（apap给药）结果；图4为不同浓度confusoside抑制apap诱导的细胞凋亡，通过av/pi和流式细胞仪检测hepg2细胞凋亡的nac+apap组（对乙酰半胱氨酸（nac，100μg/ml）与apap（50μg/ml）联合给药）结果；图5为不同浓度confusoside抑制apap诱导的细胞凋亡，通过av/pi和流式细胞仪检测hepg2细胞凋亡的cf
‑
l+apap组（低浓度confusoside（50μg/ml）与apap联合给药（50μg/ml））结果；图6为不同浓度confusoside抑制apap诱导的细胞凋亡，通过av/pi和流式细胞仪检测hepg2细胞凋亡的cf
‑
h+apap组（高浓度confusoside（100μg/ml）与apap（50μg/ml）联合给药）结果；图7为不同浓度confusoside抑制apap诱导的细胞凋亡，不同组hepg2细胞的凋亡率统计结果；图中nc为对照组，nac为nac+apap组，cf
‑
l为cf
‑
l+apap组，cf
‑
h为cf
‑
h+apap组；图2
‑
7中数据以平均数
±
平均标准差(sem)表示(每组5个)，
#
p<0.01 表示与 control组相比；
*
p<0.05 ，
**
p<0.01 表示与apap组相比；图8为不同浓度confusoside对apap肝损伤小鼠肝脏形态学观察、h&e染色组织病理学观察结果示意图；图9为不同浓度confusoside对apap肝损伤小鼠实验中肝脏脏器指数结果；图10为不同浓度confusoside对apap肝损伤小鼠实验中生化指标alt结果；图11为不同浓度confusoside对apap肝损伤小鼠实验中生化指标ast结果；图12为不同浓度confusoside对apap肝损伤小鼠实验中生化指标ldh结果；图8
‑
12中数据以sem表示(每组6个)。
#
p<0.0 1 表示与 c组相比；
*
p<0.05 ，
**
p<0.01 表示与m组相比；c：正常对照组，m：apap（400mg/kg）给药，y：nac（60mg/kg）与apap（400 mg/kg）联合给药，cf
‑
l：低浓度confusoside（20mg/kg）与apap（400mg/kg）联合给药，cf：高浓度confusoside（60mg/kg）与apap（400mg/kg）联合给药；图13为不同浓度confusoside减轻apap给药小鼠氧化应激损伤实验中gsh含量结果；图14为不同浓度confusoside减轻apap给药小鼠氧化应激损伤实验中超氧化物歧化酶（sod）含量结果；图15为不同浓度confusoside减轻apap给药小鼠氧化应激损伤实验中过氧化氢酶（cat）含量结果；图16为不同浓度confusoside减轻apap给药小鼠氧化应激损伤实验中丙二醛（mda）含量结果；图13
‑
16中数据以sem表示(每组6个)。
#
p<0.0 1 表示与 c组相比；
*
p<0.05 ，
**
p<0.01 表示与m组相比；c：正常对照组，m：apap（400mg/kg）给药，y：nac（60mg/kg）与apap（400mg/kg）联合给药，cf
‑
l：低浓度confusoside（20mg/kg）与apap（400mg/kg）联合给药，cf：高浓度confusoside（60mg/kg）与apap（400mg/kg）联合给药；图17为不同浓度confusoside减轻apap给药小鼠炎症损伤实验中炎症因子tnf
‑
α
含量结果；图18为不同浓度confusoside减轻apap给药小鼠炎症损伤实验中炎症因子il
‑
1β含量结果；图19为不同浓度confusoside减轻apap给药小鼠炎症损伤实验中炎症因子il
‑
6含量结果；图20为不同浓度confusoside减轻apap给药小鼠炎症损伤实验中no含量结果；图17
‑
20中数据以sem表示(每组6个)，
#
p<0.0 1 表示与 c组相比；
*
p<0.05 ，
**
p<0.01 表示与m组相比；c：正常对照组，m：apap（400mg/kg）给药，y：nac（60mg/kg）与apap（400mg/kg）联合给药，cf
‑
l：低浓度confusoside（20mg/kg）与apap（400mg/kg）联合给药，cf：高浓度confusoside（60mg/kg）与apap（400mg/kg）联合给药。
具体实施方式
13.下面结合实验数据和附图来进一步的阐述本发明。这些实验的事例仅用于说明本发明，不用于限制本发明的应用范围。在阅读了本发明的记载以后，本领域的科技人员对其等效的各种改动、修改和修饰，都属于本发明权利要求所限定的范围，实施例中使用的试剂，如无特殊说明，均为常规市售产品或按常规方法配制的试剂，实施例中方法如无特殊说明，均为常规实验方法。
14.实施例1：糖苷类化合物confusoside的分离纯化1）将从中国云南省临沧市永德县采集的红香树树叶自然干燥并粉碎；2）按料液比g:ml为1:10的比例，将红香树叶粉末样品与用80% 乙醇水溶液混合后超声提取30min，过滤得提取液，滤渣重复提取3次后合并提取液，4000rpm下离心10min后取上清液，使用旋转蒸发仪进行减压蒸发浓缩，得浸膏状红香树叶提取物；3）提取物浸膏进行预冻后经冷冻浓缩干燥机进行低温冻干，得到红香树叶乙醇提取物，置于样品干燥器内保存；4）称取红香树叶乙醇提取物使用硅胶柱分离纯化，chcl3‑
meoh（体积比30:1）洗脱，收集洗脱液，浓缩后80%甲醇水溶解，结晶，即得到化合物confusoside；5）利用核磁共振（nmr）对化合物结构进行鉴定，鉴定结果如下：confusoside : 黄色无定型粉末；1h (dmso
‑
d6, 400 mhz) δ: 12.50 (1h, s, oh
‑2′
), 9.16 (1h, s, oh
‑
4), 7.05 (2h, d, j = 8.3 hz, h
‑
2/h
‑
6), 6.66 (2h, d, j = 8.3 hz, h
‑
3/h
‑
5), 6.55 (1h, d, j = 1.8 hz, h
‑3′
), 6.58 (1h, dd, j = 1.8, 8.9 hz, h
‑5′
), 7.90 (1h, d, j = 8.9 hz, h
‑6′
). 13
c nmr (dmso
‑
d6, 100 mhz) δ: 130.9 (s, c
‑
1), 129.2 (d, c
‑
2/c
‑
6), 115.0 (d, c
‑
3/c
‑
5), 155.5 (s, c
‑
4), 114.4 (s, c
‑1′
), 163.3 (s, c
‑2′
), 103.4 (d, c
‑3′
), 163.5 (s, c
‑4′
), 108.3 (d, c
‑5′
), 132.6 (d, c
‑6′
), 40.0 (t, c
‑
α), 28.9 (t, c
‑
β), 99.6 (d, c
‑1″
), 73.1 (d, c
‑2″
), 76.4 (d, c
‑3″
), 69.5 (d, c
‑4″
), 77.1 (d, c
‑5″
), 60.5 (t, c
‑6″
), 204.4 (s, co). hresims （m/z）419.1363 [m
ꢀ‑ꢀ
h]
‑ (calcd. for c
21
h
23
o9, 419.1348)；
。
[0015]
实施例2：糖苷类化合物confusoside的细胞毒性实验使用人肝癌细胞（hepg2）通过mtt法测细胞活率来对化合物confusoside进行细胞毒性评价，开展糖苷类化合物confusoside对hepg2细胞的存活率的研究，具体方法如下：从液氮罐中取出冻存的hepg2细胞，对细胞进行复苏后培养三代，进行mtt实验；hepg2细胞以3
×
104个/孔的密度接种于96孔板，孵育24h，孵育结束后对实验进行分组；空白组（nc）：200μl完全培养基处理hepg2细胞24h；样品组：分别选用浓度12.5、25、50、100、200μg/ml的confusoside溶液200μl处理hepg2细胞24h。处理结束后，用0.5mg/ml的mtt溶液（150μl/孔）与细胞孵育4h，然后用150μl二甲基亚砜（dmso）溶解，用spectramax m5微板仪在570nm处记录每孔的吸光度，并通过以下公式计算得到细胞存活率：结果如图1所示，随着糖苷类化合物confusoside浓度的增加，细胞存活率呈现剂量依赖性降低，且在浓度为200μg/ml时细胞活率低于90％，这说明confusoside在200μg/ml时会抑制hepg2细胞的增殖，表现出一定的毒性作用，而confusoside在100μg/ml以下浓度时不存在明显细胞毒性。
[0016]
实施例3：糖苷类化合物confusoside对乙酰氨基酚诱导的细胞凋亡的保护作用用annexin v
‑
fitc (av)/pi凋亡试剂盒检测化合物confusoside对apap诱导hepg2细胞凋亡的影响。
[0017]
hepg2细胞在12孔板（细胞数量1.5
×
105个/孔）中预孵育12h，待细胞接近长满孔板时，对细胞进行给药，control组：1ml dmem完全培养液处理细胞；apap组：1ml dmem完全培养液处理细胞；nac+apap组：1ml 100μg/ml nac处理细胞；cf
‑
l+apap组：1ml 50μg/ml confusoside处理细胞；cf
‑
h+apap组：1ml 100μg/ml confusoside处理细胞；24h后，弃去之前培养液，对细胞再进行给药处理，control组：1ml dmem完全培养液处理细胞，其余组别用1ml 50mm apap处理细胞24h；处理结束后，将细胞收集于1.5ml离心管中，用冷的pbs洗涤3次细胞，加入100μl的结合缓冲液、5μl的annexin v
‑
fitc和碘化丙啶（pi）在室温下避光孵育10min，结束后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
[0018]
结果如图2
‑
7所示，通过流式细胞仪对细胞凋亡情况的检测，与control组相比，apap处理后显著诱导了细胞的凋亡（p<0.01），但是与apap组相比较，3个给药组均显著抑制了apap诱导的细胞凋亡（p<0.01），并且confusoside样品组以剂量依赖的方式显著抑制。
[0019]
实施例4：糖苷类化合物化合物confusoside对apap诱导的小鼠肝损伤的预防和治疗作用1、实验方法选取雄性昆明种小鼠30只，体重20~25g，所有小鼠在正式实验前适应性饲养7d，饲
养环境为室温24
±
1℃，相对湿度50
±
10%，每12h进行一次明暗交替。用实验室标准饲料和双蒸水喂养小鼠。饲养适应实验环境7d后，将小鼠随机分为5组，每组6只：c组(对照组)、m组(apap模型组)、y组(nac组)、cf
‑
l组(confusoside低剂量组)、cf
‑
h组(confusoside高剂量组)。对小鼠正常饲养，并分别对不同组别小鼠连续7d每天一次灌胃给药，每次灌药剂量0.2ml；c组：蒸馏水；m组：apap（400mg/kg）给药；y组：60mg/kg（药物/鼠体重）nac（n
‑
乙酰
‑
l
‑
半胱氨酸）与apap（400 mg/kg）联合给药；cf
‑
l组：20mg/kg（药物/鼠体重）confusoside与apap（400mg/kg）联合给药；cf
‑
h组：60mg/kg（药物/鼠体重）confusoside与apap（400mg/kg）联合给药；连续给药7d后，小鼠禁食一夜，第8天早上，将apap溶解于pbs中，采取腹腔注射的方法，对c组小鼠注射一定体积的pbs，对m组、y组、cf
‑
l组、cf
‑
h组小鼠，注射溶有apap的pbs（400mg/kg ，apap/鼠体重）。
[0020]
6h之后，对小鼠进行眼球取血，并实施安乐死；对小鼠进行解剖，观察、收集肝组织，用于分析。
[0021]
观察肝脏的形态学变化、拍照，称每只小鼠的肝组织重量，计算肝脏脏器指数，随机将每组2份肝组织制作h&e染色切片。取小鼠血液，使用离心机1800
×
g、4℃离心10min，采集血浆；用相应试剂盒检测alt、ast、ldh、no、肿瘤坏死因子
‑
α(tnf
‑
α)、白细胞介素
‑
6(il
‑
6)、白细胞介素
‑
1β(il
‑
1β)等生化指标。
[0022]
取剩余小鼠肝组织与0.9%氯化钠溶液混合，超声细胞破碎机匀浆；组织匀浆在10000rpm和4℃下离心10min，收集上清液并储存在
‑
80℃以备进一步使用；制备肝组织匀浆进行mda、cat、sod、gsh等生化指标的测定。
[0023]
观察h&e染色切片，对小鼠肝脏进行组织病理学评价。
[0024]
2、结果（1）不同浓度化合物confusoside对apap给药小鼠肝损伤的预防和治疗情况由图8可知，c组正常小鼠肝脏呈红色，包膜光滑、有光泽、有弹性。反之，观察小鼠肝脏的形态学变化。m组肝脏颜色加深，出现灰黄色点状坏死，肝表面暗淡，质地硬化，个别肝脏可见明显的斑片状充血。与m组相比，y组、cf
‑
l组和cf
‑
h组小鼠肝损伤明显改善，肝组织形态接近c组。
[0025]
病理组织学评价与形态学观察结果一致。c组肝小叶结构清晰，肝细胞无坏死变性，无炎性细胞浸润，细胞核大而清晰，中心静脉周围肝索呈放射性排列，肝窦正常；m组小鼠肝小叶中心静脉周围均有不同程度的肝细胞变性坏死，坏死表现为凝固性、核固缩或溶解，并伴有中性粒细胞和单核细胞等炎性细胞浸润。细胞索形态正常，中间带可见细胞空泡变性；与m组相比，y组、cf
‑
l组和cf
‑
h组肝小叶结构更加完整，肝索排列趋于整齐，肝细胞形态明显改善，中心静脉附近的炎性浸润和变性坏死细胞明显减少；表明对过量apap诱导的肝损伤有明显的改善作用。
[0026]
由图9
‑
12可知，直观评价肝损伤情况的肝脏脏器指数以及生化指标ast、alt、ldh，与c组相比，m组水平均有显著增加（p<0.01）；与m组相比，y组和cf
‑
l、cf
‑
h组指标水平均有
明显下降；cf
‑
h组与y组水平接近，与cf
‑
l组相比效果更加明显。
[0027]
以上结果表明化合物confusoside对apap诱导的肝损伤有明显的预防和治疗作用。
[0028]
（2）不同浓度化合物confusoside减轻apap给药小鼠氧化应激损伤情况从图13
‑
16可知，与c组相比，m组大鼠肝组织中sod、cat活性显著降低(p<0.01)，gsh含量也显著降低(p<0.01)；与m组相比，y组、cf
‑
l组、cf
‑
h组sod、cat、gsh活性均升高，其中cf
‑
h组升高最为明显，接近y组(p<0.01)，说明cf能有效治疗apap所致的肝组织氧化损伤，且剂量与作用呈正相关；此外，m组mda水平显著升高(p<0.01)。与c组比较，提示肝组织存在脂质过氧化；cf
‑
l组与m组比较，cf
‑
l组降低mda水平(p<0.05)，cf
‑
h组作用更明显，接近y组(p<0.01)；cat、sod、gsh和mda的活性是评价生物体内氧化应激情况的重要指标，由以上结果表明confusoside对apap诱导的氧化应激损伤有明显的预防和治疗作用。
[0029]
（3）不同浓度confusoside减轻apap给药小鼠炎症损伤情况由图17
‑
20可知，与c组比较，m组大鼠肝组织中炎症因子tnf
‑
α、il
‑
1β、il
‑
6、no含量明显升高(p<0.01)。与m组比较，y组、cf
‑
l组、cf
‑
h组炎症因子tnf
‑
α、il
‑
1β、il
‑
6、no含量均低于m组，cf
‑
l组tnf
‑
α含量下降，但变化不明显，cf
‑
h组显著降低(p<0.01)，与m组比较，y组、cf
‑
l组、cf
‑
h组均有显著降低p<0.01)，cf
‑
l组与m组比较差异无显著性(p>0.05)。同样，y组和cf
‑
h组il
‑
1β含量明显低于m组(p<0.01)，cf
‑
l组il
‑
6含量明显低于m组(p<0.0 5)，而cf
‑
h组与y组接近(p<0.01)。cf组no含量明显低于m组(p<0.01)，cf
‑
l组和cf
‑
h组no含量均显著低于m组(p<0.01)，cf
‑
l组和cf
‑
h组no含量均显著低于m组(p<0.01)，cf
‑
l组和cf
‑
h组no含量明显低于m组(p<0.01)。tnf
‑
α、il
‑
1β、il
‑
6、no的活性是评价生物内炎症水平的关键性指标，因此，以上结果表明confusoside对apap诱导的炎症损伤有明显的预防和治疗作用。