一种载有复合佐剂的新型冠状病毒疫苗可溶性微针贴片的制作方法

1.本发明涉及新型冠状病毒疫苗的给药技术领域，具体涉及一种载有复合佐剂的新型冠状 病毒疫苗可溶性微针贴片。


背景技术：

2.2020年2月11日，世界卫生组织(who)将由新型冠状病毒感染引起的疫情命名为 covid-19，即2019冠状病毒病(coronavirus disease 2019)。2020年2月11日国际病毒分 类委员会将其命名为“sars-cov-2”(severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2)。
3.sars-cov-2和严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒 (mers-cov)同属于β属的冠状病毒。sars-cov-2具有冠状病毒的典型特征，病毒颗粒 呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140nm。其遗传物质是单股正链rna，接近3万个 碱基，基因特征与sars-cov和mers-cov有明显区别，目前研究显示与蝙蝠sars样冠 状病毒(bat-sl-covz45)最接近，有85％以上的同源性(陈静,李波,申硕,范亚飞.covid-19 疫苗的研究进展[j].病毒学报,2020:1-7.)。
[0004]
疫苗是防控sars-cov-2等一系列传染病最有效的手段.目前，包括中国在内的多个国 家已成功分离出sars-cov-2毒株，并开展疫苗的研发.当前全球共有20多种sars-cov-2 疫苗正在研发阶段，多个研发技术并行推进疫苗开发，包括灭活疫苗、核酸疫苗、重组蛋白 疫苗、重组病毒载体疫苗等。目前，国内5类疫苗(灭活疫苗、基因工程重组亚单位疫苗、 腺病毒载体疫苗、核酸疫苗、减毒流感病毒载体疫苗)的研发也正在同步开展。
[0005]
这五种疫苗中灭活疫苗是一种经典的疫苗，即对病原微生物进行培养、增值后，用理化 方法灭活后制成的疫苗，是一种易于快速研究和制备的有效疫苗，其优点是消除了病毒的感 染复制能力，具有较完整分子空间结构，抗原成分的空间比较接近原始状态。针对 sars-cov-2，研究者目前已完成病毒接种细胞、病毒细胞的适应性传代培养，并合作开展了 感染性动物模型的建立工作，同时并行开展了检测鉴定方法的建立工作，完成下游纯化方法 的建立，并初步建立病毒灭活疫苗的质量标准，一旦灭活疫苗筛选完成，就加速生产出合格 样品申报临床实验(宁文静,刘雪,罗文新.新型冠状病毒肺炎的治疗药物及疫苗研究进展[j]. 厦门大学学报(自然科学版),2020,59(3):317-324)。但灭活疫苗存在的技术不足也很明显，例如 免疫原性不足，需要通过添加佐剂或多剂次注射的方式来增强治疗效果；开发灭活疫苗时还 必须考虑病毒的抗体依赖性增强(antibody dependent enhancement，ade)的作用机制影响。
[0006]
重组蛋白疫苗属于基因工程疫苗，是将病毒的目的抗原基因构建在表达载体上，转化到 细菌、酵母、哺乳动物或昆虫细胞中，诱导其大量表达，经过纯化后制备的疫苗。重组蛋白 疫苗的优点是安全性和稳定性较好；缺点是免疫原性相对较弱，需要添加佐剂。
[0007]
因此，在研发covid-19疫苗中，除了抗原设计外，选择合适的佐剂以增强covid-19 疫苗的治疗效果，也至关重要。
[0008]
绝大多数rna病毒会编码一些具有干扰素拮抗活性的病毒蛋白来阻断宿主先天性免疫 系统的激活，这些蛋白中有许多会通过影响免疫路径的不同分子来发挥拮抗效应。这种对抗 在sars-cov-2这些高致病性rna病毒中尤为明显，研究表明，这些病毒感染所引发的病变 和死亡与i型干扰素的异常表达存在着重要的关联(王国庆,朱紫祥,曹伟军,刘磊,郑海学. rna病毒阻断rig-i样受体识别dsrna机制研究进展[j].病毒学报,2014,30(6):704-712.)。 因此，不难理解，能够抑制i型干扰素正常表达的病毒蛋白，绝大多数都是这些病毒影响免 疫应答能力强弱的决定性分子。
[0009]
与此同时，佐剂不仅可以调节免疫反应强度，还可以将疫苗的反应类型微调为所需的反 应类型。随着天然免疫研究的不断深入，模式识别受体(prrs)的天然配体或合成激动剂逐 渐脱颖而出。初期研究发现当与铝佐剂或油乳佐剂结合使用时，它们能有效引导th1免疫应 答。已有部分佐剂在搭配sars和mers疫苗原型进行的动物试验中表现良好。在sars和 mers疫苗中添加经典佐剂(铝佐剂等)可以明显增加受试动物的血清抗体水平(tseng c t, sbrana e,iwata-yoshikawa n,et al.immunization with sars coronavirus vaccines leads topulmonary immunopathology on challenge with the sars virus[j].plos one,2012,7(4):1-13.)。 同时，蓝佳明、邓瑶、陈红等人研究不同种prrs激动剂与经典佐剂联用时发现，在mers 疫苗中加上铝佐剂与cpg odns(tlr9激动剂)的组合能导更强效的免疫应答和中和抗体 的产生(jiaming l,yao d,hong c,et al.tailoring subunit vaccine immunity with adjuvantcombinations and delivery routes using the middle east respiratory coronavirus(mers-cov) receptor-binding domain as an antigen[j].plos one,2014,9(11):1-9.)。
[0010]
因此，通过使用prrs激动剂促进i型干扰素正常表达来提高免疫效应是可行的，但不同 的prrs激动剂对sars疫苗或mers疫苗的免疫应答的诱导效果又不同，存在不确定性。 虽然sars-cov-2和sars-cov的受体结合域(rbd)具有较高的同源性，但有学者研究发 现，与sars-cov上的rbd特异性结合ace2的中和抗体，并非全部都适用与sars-cov-2 上的rbd特异性结合，例如抗体药物cr 3022既适用于sars-cov也适用于sars-cov-2， 但抗体药物cr 3014仅适用于sars-cov却不适用于sars-cov-2(xiaolong tian,cheng li, et al.potent binding of 2019novel coronavirus spike protein by a sars coronavirus-specifichuman monoclonal antibody[j].emerg microbesinfect,2020,9(1):382-385.)。这意味着，即使同 属于β属的冠状病毒，sars-cov-2病毒与以往发现的sars-cov病毒也存在差异，因此前 述文献中提到的能够增强sars疫苗或mers疫苗免疫应答效果的佐剂，能否也适用于 covid-19疫苗，存在不确定性。
[0011]
除此之外，目前疫苗的给药方式仍以注射为主，注射给药的缺点在于必须由专业的医护 人员操作，且会引起疼痛、出血，患者顺应性差，考虑到sars-cov-2病毒的流行病学特点， 注射疫苗的给药方式会增大接触几率，存在传播风险。因此，选择一种无须接触医护人员， 可自行给药的途径，势在必行。作为透明制剂的新宠儿“可溶性微针”，具有给药方便、安 全、无痛，有效透皮递送大分子药物等优势，可用于开发covid-19疫苗。
[0012]
目前尚未有covid-19疫苗可溶性微针的开发上市，究其原因在于，由于covid-19疫 苗的作用机制复杂，不同种类的佐剂或多个佐剂的组合方案都会对covid-19疫苗的免疫效 果产生差异，也会对加载疫苗的可溶性微针机械性能产生差异，而以往文献报道的
sars疫 苗或mers疫苗与佐剂的影响关系也不具有借鉴性，所以covid-19疫苗可溶性微针的研发 能否成功存在不确定性。
[0013]
如公开号cn 1569228a的中国专利，提供了一种含铝佐剂的sars疫苗。但该方案存在 的不足之处在于：该专利的实施例4-6仅表明载有铝佐剂的sars疫苗的安全、有效，并未 有别的效果实验数据来证明其它佐剂对于sars疫苗也有效，更无法知悉添加的铝佐剂是否 对covid-19疫苗有效。
[0014]
如公开号cn 111218459a中国专利，公开了一种以人5型复制缺陷腺病毒为载体的重组 新型冠状病毒疫苗；公开号cn 111217917a、cn 110951756a的中国专利，提供sars-cov-2 病毒疫苗及其制备方法。这些方案的不足之处在于：
①
制备的疫苗都为核酸疫苗，故而制备 工艺或所使用的佐剂在灭活疫苗中难以借鉴；
②
上述方案中着眼于保护疫苗的核酸序列，并 未涉及考察佐剂的选择与疫苗的免疫增强效果之间的关联性。
[0015]
如匹兹堡大学的eun kim等人提出用微针阵列的方式递送pittcovacc疫苗(pittsburghcoronavirus vaccine，匹兹堡新冠病毒疫苗)，小鼠实验表明会产生针对sars-cov-2的特异 性抗体，数量足以中和体内病毒(kim e,erdos g,huang s,et al.microneedle array deliveredrecombinant coronavirus vaccines:immunogenicity and rapid translational development[j]. ebiomedicine,2020,(55):1-12.)。但该方案存在的不足之处在于：
①
使用的疫苗为重组蛋白 疫苗，故其筛选出的佐剂在灭活疫苗中是否仍有效不可知；
②
该方案使用tlr4、tlr5激动 剂为佐剂，然效果甚微且作者也不确定能否增强疫苗的免疫应答效果。
[0016]
综上所述，在新型冠状病毒疫苗可溶性微针贴片中载入何种佐剂或复合佐剂，使开发的 covid-19疫苗可溶性微针贴片机械强度适宜、免疫效果好、安全性佳，是本领域技术人员 急需解决的技术难题。


技术实现要素：

[0017]
本发明要解决的技术问题在于，提供了一种新型冠状病毒疫苗可溶性微针贴片，通过选 择适合的佐剂种类与含量、基质材料的质量占比等技术手段，解决了上述现有技术存在的不 足之处。
[0018]
为此，本发明采取了以下技术方案：
[0019]
一种载有复合佐剂的新型冠状病毒疫苗可溶性微针贴片，包括一针体，针体中含有复合 佐剂、covid-19疫苗和基质材料，复合佐剂由rig-i样受体激动剂和铝佐剂组成。
[0020]
优选的，rig-i样受体激动剂选自trim25。
[0021]
更优选的，复合佐剂中trim25与铝佐剂的含量比为(2:1)～(1:4)。
[0022]
更优选的，复合佐剂中trim25与铝佐剂的含量比为1:1。
[0023]
优选的，复合佐剂与covid-19疫苗的含量比为(1:1)～(4:5)。
[0024]
更优选的，复合佐剂与covid-19疫苗的含量比为4:5。
[0025]
优选的，基质材料在针体中的质量占比为50～60％。
[0026]
优选的，covid-19疫苗选自灭活疫苗、重组疫苗或腺病毒载体疫苗等。
[0027]
需要说明的是，本发明涉及的covid-19疫苗系目前在研或上市的公知疫苗技术，包括 但不限于灭活病毒疫苗、蛋白亚单位疫苗、腺病毒载体疫苗，只要能满足本发明所构
建的微 针给药递送系统的机械性能和复合佐剂能增强covid-19疫苗产生免疫应答效果的，皆可。
[0028]
本发明还提供了一种最佳的载有复合佐剂的新型冠状病毒疫苗可溶性微针贴片，其针体 中各成分及其含量为：基质材料质量占比55％，covid-19疫苗质量占比25％，trim25佐 剂质量占比10％，铝佐剂质量占比10％。
[0029]
与现有技术相比，本发明提供的载有复合佐剂的新型冠状病毒疫苗可溶性微针贴片，有 益效果如下：
[0030]
本发明通过筛选适合的佐剂种类与含量(trim25佐剂+铝佐剂)、基质材料在针体中的 质量占比(50～60％)等技术手段，使制得的covid-19疫苗可溶性微针贴片机械强度适宜、 免疫效果好、安全性佳。
具体实施方式
[0031]
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护 范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护 范围之内。
[0032]
实施例1新型冠状病毒疫苗可溶性微针贴片的制备
[0033]
采用倒模法制备covid-19疫苗可溶性微针所需的聚二甲氧基硅氧烷阴模具。
[0034]
采用两步法离心入模进行制备covid-19疫苗可溶性微针，恒温干燥，脱模，即得成品。
[0035]
如前所述，本发明涉及的covid-19疫苗系目前在研或上市的公知疫苗技术，包括但不 限于灭活病毒疫苗、蛋白亚单位疫苗、腺病毒载体疫苗，优选已上市的灭活疫苗。
[0036]
实施例2佐剂种类的筛选
[0037]
设定佐剂在针体总质量中的占比为一定值25％，covid-19疫苗原液的含量为25％，微 针基质材料gantrez an的含量为50％。仅改疫佐剂的种类，选择聚肌胞(pic，tlr3激动 剂)、mf59(tlr4受体激动剂)、泛素连接酶(trim25，rig-i样受体激动剂)、铝佐剂 (al(oh)3)、弗氏佐剂(fca)，考察如表1所示的不同种类组合的佐剂对可溶性微针的机 械强度和免疫效果的影响。
[0038]
本实施例涉及的可溶性微针，其制备方法参照本发明的实施例1。
[0039]
表1.含有不同种类佐剂的可溶性微针处方
[0040]
免疫效果。
[0055]
实施例3复合佐剂中各组分的含量比的筛选
[0056]
在实施例2的基础上，进一步考察复合佐剂中各组分的含量比对可溶性微针的机械强度 和免疫效果的影响。
[0057]
设定免疫佐剂在针体总质量中的占比为一定值为25％，复合佐剂的组分固定为trim25 和al(oh)3的组合，疫苗原液的含量为25％；微针基质材料的含量为50％。仅改变trim25 和al(oh)3的含量比，考察如表3所示不同含量比的复合佐剂对可溶性微针的机械强度和免 疫效果的影响。
[0058]
本实施例涉及的可溶性微针制备方法，参照本发明的实施例1。表3所示的处方所制备 出的微针机械强度和病毒疫苗免疫效果的检测方法及评价标准，参照本发明的实施例2。测 试结果见表3。
[0059]
表3.复合免疫佐剂各组分的含量比对微针机械性能和免疫效果的影响(mean
±
sd，n＝6)
[0060]
trim25:al(oh)3第六周中和抗体效价穿刺成功率(％)4:164076.2
±
0.72:1102481.9
±
0.31:1204885.6
±
2.11:2102488.1
±
2.01:4102490.2
±
0.51:525693.1
±
2.0
[0061]
由表3可知：
[0062]
①
在一定范围内，随着al(oh)3占比的增大，抗体水平呈先升高后下降的趋势，微针的 机械强度呈逐渐上升的趋势。
[0063]
②
综合考虑穿刺成功率、抗体水平值须均符合测试要求的，trim25和al(oh)3的含量比 值为(2:1)～(1:4)。
[0064]
③
抗体水平越高，免疫效果越好，因此仅当trim25:al(oh)3＝1:1时，免疫效果最佳，微 针的机械强度也符合测试要求。
[0065]
实施例4复合佐剂与病毒疫苗的含量比的筛选
[0066]
在实施例3的基础上，进一步考察复合佐剂和疫苗原液的含量比对可溶性微针的机械强 度和免疫效果的影响。
[0067]
设定微针基质材料的占比为50％，复合佐剂的组分和比例固定为trim25:al(oh)3＝1:1， 仅改变复合佐剂和疫苗原液的含量比，考察如表4所示复合佐剂和疫苗原液的不同含量比对 可溶性微针的机械强度和免疫效果的影响。
[0068]
本实施例涉及的可溶性微针制备方法，参照本发明的实施例1。表4所示的处方所制备 出的微针机械强度和免疫效果的检测方法及评价标准，参照本发明的实施例2。测试结果见 表4。
[0069]
表4.复合佐剂与疫苗原液的含量比对微针机械性能和免疫效果的影响(mean
±
sd，n＝6)
[0070]
复合佐剂:疫苗原液第六周中和抗体效价穿刺成功率(％)
7:664090.2
±
2.16:564085.6
±
1.71:1204885.6
±
2.14:5256080.2
±
1.13:5204878.8
±
1.4
[0071]
由表4可知，
[0072]
①
随着疫苗原液占比的增多，微针的机械强度呈下降趋势，疫苗的免疫效果先增后减。
[0073]
②
综合考虑穿刺成功率、抗体水平须均符合测试要求的，复合佐剂与疫苗原液的含量比 值为(1:1)～(4:5)。
[0074]
③
仅当复合佐剂:疫苗原液＝4:5时，免疫效果最佳，微针的机械强度也符合测试要求。
[0075]
实施例5基质材料的质量占比的筛选
[0076]
在实施例4的基础上，进一步考察基质材料在针体中的质量占比对可溶性微针的机械强 度和免疫效果的影响。
[0077]
设定复合佐剂的组分和比例固定为trim25:al(oh)3＝1:1，复合佐剂与疫苗原液的含量比 固定为4:5，仅改变基质材料的含量，考察如表5所示基质材料的不同含量对可溶性微针的机 械强度和免疫效果的影响。
[0078]
本实施例涉及的可溶性微针制备方法参照本发明的实施例1。表5所示的处方所制备出 的微针机械强度和免疫效果的检测方法及评价标准参照本发明的实施例2。测试结果见表5。
[0079]
表5.基质材料的质量占比对微针机械性能和免疫效果的影响(mean
±
sd，n＝6)
[0080][0081][0082]
由表5可知，
[0083]
①
当微针的基质材料含量为45％时，微针的机械强度较弱，不足以刺入小鼠皮肤中，导 致免疫效果较差。
[0084]
②
随着基质材料的质量占比从50％逐渐上升至65％，微针的机械强度随之上升，但使得 微针的载药量随之下降，导致免疫效果减弱。
[0085]
③
综合考虑穿刺成功率、抗体水平须均符合测试要求的，基质材料的质量占比为50～60％。
[0086]
④
仅当基质材料的质量占比为55％时，免疫效果最佳，微针的机械强度也符合测试要求。
[0087]
综上所述，本发明提供的covid-19疫苗可溶性微针中，针体的最佳处方为：基质材
料 质量占比55％，covid-19疫苗质量占比25％，trim25佐剂质量占比10％，铝佐剂质量占 比10％。
[0088]
本发明提供的covid-19疫苗可溶性微针中，针体的适宜处方为：基质材料质量占比为 50～60％，复合佐剂与covid-19疫苗的含量比为(1:1)～(4:5)，复合佐剂中trim25佐剂 与铝佐剂的含量比为(2:1)～(1:4)。