一种NADH微胶囊制剂及其制备方法和应用与流程

一种nadh微胶囊制剂及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及化妆品和保健品技术领域，具体涉及一种nadh微胶囊制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.皮肤是覆盖在人体表面最大的器官，由于直接与外界环境接触，受到氧化，干燥和紫外线等种种紧张因素的刺激，故非常容易受到损伤。同时，又因为年龄，饮食和生活习惯等内部因素的影响，导致皮肤功能的衰退和遗传畸化，从而使得皮肤更加容易老化。由于皮肤是处于人体的最外侧，一目了然地表现了人体的美。所以，抗衰老化妆品成了广大女性消费者迫切需求的产品之一。抗衰老化妆品已占化妆品市场的50％以上，皮肤衰老的最主要的因素之一，是皮肤长期受紫外辐射引起的皮肤光老化。皮肤的光老化是由于皮肤中自由基增加，自由基可损伤生物膜，促进弹性硬蛋白纤维增加和无定形化，以及胶原蛋白纤维显著减少和葡萄氨聚糖增加等皮肤老化现象。对抗和消除自由基防止自由基的损伤作用，往往通过抗氧化实现。
3.另外线粒体功能的健康维持，是一切生命活动的基础。nadh是线粒体的关键“燃料
”‑‑‑‑
生命所需的能量，进而发挥身体各处细胞的各项功能。随着年龄的衰老，nadh不断被消耗而造成器官的老化与功能衰退。其中，心脏与大脑是所有器官中最需要nadh的，所以这些器官通过外源性补充nadh获得的收益更大，其他诸如肝、肾、肺等器官，也需要补充nadh从而获得较多能量。但该物质虽然在食物中存在，诸如鱼、肉、蔬菜，但烹饪过程中的高温高热，以及该物质直接暴露在空气中，均会直接被氧化而破坏，甚至nadh到达胃部，也会被胃酸分解，完全不能被肠道吸收，进而输送到全身的组织细胞中。因此，能够保护nadh不被快速降解，实现肠道缓释与吸收，才能充分利用nadh的生物学效应和实现真正意义上nadh口服保健品的开发。
4.nadh是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，又称还原型辅酶ⅰ，分子式为c
21
h
27
n7o
14
p2，是一类在氧气存在条件下能够催化nadh转化为nad
+
的氧化还原酶，它是细胞中重要的氧代谢酶，对于维持细胞内氧平衡具有十分重要意义。nadh参与人体内上千种生理代谢反应，在基因修复、提高免疫力、抗氧化以及改善睡眠等方面起到重要作用，因此将nadh用于制备护肤品，使其直接作用与面部皮肤，可以在很大程度上起到抗衰老、抗氧化功效；然而人体健康皮肤的“乳化膜”呈弱酸性，常用护肤品如爽肤水、乳液、睡眠面膜等为接近皮肤酸碱值多也设置为弱酸性，同时护肤品一般使用周期较长。而nadh是生物形式的氢，光照、酸性环境(如胃酸)或者空气中的氧气、水分都会破坏nadh的分子结构，导致其化学性质极不稳定。由此限制极大地限制了nadh在化妆品和保健品领域中的应用。


技术实现要素：

5.基于上述内容，本发明提供一种nadh微胶囊制剂及其制备方法和应用。通过使用透明质酸包覆nadh制备微胶囊，并以海藻酸钠为中间层，在避免nadh受外界环境影响的同
时达到缓释的作用，延长nadh作用时间，保证nadh本身抗氧化和抗衰老作用的充分发挥。
6.本发明的技术方案之一，一种nadh微胶囊制剂，以nadh纳米脂质体为囊芯材料，以海藻酸钠为中间层，以透明质酸为囊壁材料。
7.进一步地，质量份数计，原料包括：透明质酸50
‑
80份，磷脂5
‑
30份、胆固醇1
‑
10份，维生素e 3
‑
5份，nadh 10
‑
15份、海藻酸钠25
‑
40份。
8.本发明的技术方案之二，上述nadh微胶囊制剂的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)取海藻酸钠置于水中配制成海藻酸钠溶液，加入nadh脂质体充分混匀得到混合溶液，搅拌条件下将混合溶液逐滴滴入氯化钙溶液中，过滤、洗涤、干燥得到海藻酸钠包覆nadh脂质体微胶囊；
10.(2)将透明质酸置于水中加热溶解后加入乳化剂得到混合溶液，搅拌条件下将海藻酸钠包覆nadh脂质体微胶囊加入混合溶液中搅拌混匀后喷雾干燥得到nadh微胶囊制剂。
11.进一步地，所述步骤(1)中海藻酸钠溶液中海藻酸钠的质量分数为2
‑
3％，所述氯化钙溶液中氯化钙的质量分数为2
‑
3％，所述氯化钙溶液和混合溶液的体积比为(1
‑
3)：1。
12.进一步地，所述nadh脂质体的制备方法包括以下步骤：
13.将磷脂、胆固醇、维生素e溶于无水乙醇中搅拌溶解得到脂质体溶液；
14.将nadh溶解于磷酸缓冲溶液得到nadh溶液；
15.加热搅拌条件下将nadh溶液注入脂质体溶液中，继续搅拌至乙醇完全挥发，均质、超声、过滤得到nadh脂质体。
16.进一步地，所述脂质体溶液中，磷脂的浓度为1.2
‑
2.0mg/ml，所述磷酸缓冲溶液的ph值为7.0
‑
7.5；所述脂质体溶液和nadh溶液的体积比为1:1。
17.进一步地，所述加热搅拌具体为80
‑
100rmp/min，40
‑
60℃水浴加热，均质时间10min，超声时间10
‑
15min，所述过滤为用0.45μm微孔滤膜过滤。
18.进一步地，所述步骤(2)中透明质酸在水中的质量分数为4
‑
8％，所述加热溶解温度为50
‑
80℃，所述喷雾干燥进口温度为120
‑
150℃，蠕动泵转速为300
‑
500ml/h。
19.本发明的技术方案之三，上述nadh微胶囊制剂在护肤品或保健品中的应用。
20.进一步地，所述护肤品为面膜、预防和/或修复妊娠纹产品或护手霜或面霜，更进一步地，所述面膜为睡眠面膜。
21.进一步地，所述保健品为胶囊、片剂、颗粒、粉末、固体饮料形式，更进一步地，所述胶囊为喷雾干燥后的颗粒，装载到0
‑
5号不等的空心胶囊，充以氮气的铝塑片进行包封。实现长期保存及对氧气的多重阻隔，该胶囊可通过胃酸，达到nadh在肠道的缓释。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果：
23.在本发明技术方案中，使用透明质酸包覆nadh纳米脂质体制备微胶囊，将nadh和外界环境隔绝，避免了nadh受外界光照、热、氧气等环境因素导致的nadh活性下降，以及内部胃酸的直接降解，从而提高了nadh的储存稳定性和肠道缓释与高效吸收之效果；囊壁材料透明质酸又称玻尿酸，在外能起到独特的皮肤保护作用，可保持皮肤滋润光滑、细腻柔嫩、富有弹性，具有防皱、抗皱、美容保健和恢复皮肤生理功能的作用；在内透明质酸是构成人体细胞间基质的主要成分，其可以直接参与细胞内外电解质交流的调控，以透明质酸为囊壁材料可促进nadh囊芯材料能够被皮肤或胃肠黏膜很好的吸收利用，充分发挥nadh的抗氧化、抗衰老以及抗炎能力，同时，nadh还能通过与自由基作用起到抑制脂质的过氧化反
应，达到保护线粒体膜和线粒体的目的，而线粒体是细胞中制造能量的结构以及细胞进行有氧呼吸的主要场所，因此线粒体除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力，而基于nadh对线粒体的保护作用又提高了细胞活力，促进细胞内外电解质互换速率，进一步促进皮肤或胃肠黏膜对透明质酸的吸收能力，二者同时作用于皮肤，起到协同作用，能够充分发挥二者功效。同时本发明是以nadh脂质体为囊芯材料，脂质体与皮肤与胃肠黏膜结构高度相似，从而显著提高nadh的透皮或黏膜吸收能力，使nadh向nad
+
转化的生物利用度增加，增强nadh和透明质酸之间的协同作用效果。
24.基于nadh在酸性环境下的不稳定因素，在本发明的技术方案中进一步地在透明质酸囊壁材料和nadh囊芯材料中间设置有海藻酸钠构成的中间层材料，一方面，避免透明质酸和nadh直接接触影响nadh活性，另一方面提高nadh的缓释作用，使其具有更高的缓释效果和稳定性。
25.将本发明nadh微胶囊制剂用于护肤品中，尤其是面膜、护手霜以及防止和/或修复妊娠纹产品中，或用于保健品中，尤其是胶囊、颗粒、片剂以及固体饮料产品中，可以起到明显的抗氧化、抗衰老、提高皮肤光泽的技术效果，同时具有较高的储存稳定性，nadh的胃肠缓释和靶向控释及nadh向nad
+
的高效转化，使产品效果更佳突出。
具体实施方式
26.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
27.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
28.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
29.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
30.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
31.本发明以下实施例中，所使用的乳化剂为单硬脂酸甘油酯，磷酸缓冲溶液为由磷酸氢二钠和磷酸二氢钾混合配制而成的ph值为7.2的磷酸盐溶液。
32.实施例1
33.(1)制备nadh脂质体：将卵磷脂25份、胆固醇4份、维生素e 3份溶于无水乙醇中搅
拌溶解得到脂质体溶液(卵磷脂浓度为1.8mg/ml)；
34.将nadh 10份溶解于磷酸缓冲溶液(体积和乙醇等量)得到nadh溶液；
35.60℃水浴加热，100rmp/min搅拌条件下将nadh溶液注入脂质体溶液中，继续搅拌至乙醇完全挥发，均质10min、超声10min、0.45μm微孔滤膜过滤得到nadh脂质体；
36.tem显示器粒径为58.45
±
12.74nm，双分子层架构，nadh被包裹其中。
37.(2)海藻酸钠35份加水配制成质量分数为3％的海藻酸钠溶液，加入步骤(1)制得的nadh脂质体得到混合溶液，500rmp/min搅拌条件下将混合溶液逐滴滴入3倍量的质量分数为2.5％的氯化钙溶液中，滴加完成后，过滤、洗涤、80℃干燥得海藻酸钠包覆nadh脂质体微胶囊。
38.tem显示器粒径为74.68
±
15.81nm，nadh脂质体被包裹其中。
39.(3)取分子量为300
‑
500kda的透明质酸50份加水制备质量分数为5％的透明质酸水溶液，60℃水浴加热溶解，加入乳化剂3份搅拌混匀后，400rmp/min搅拌条件下加入步骤(2)制备的海藻酸钠包覆nadh脂质体微胶囊，继续搅拌5min后喷雾干燥，喷雾干燥进口温度为120℃，蠕动泵转速为300ml/h，得到nadh微胶囊制剂。
40.tem显示器粒径为86.71
±
16.44nm，海藻酸钠包覆nadh脂质体微胶囊被包裹其中。
41.实施例2
42.(1)制备nadh脂质体：将卵磷脂30份、胆固醇5份、维生素e 4份溶于无水乙醇中搅拌溶解得到脂质体溶液(卵磷脂浓度为1.8mg/ml)；
43.将nadh 15份溶解于磷酸缓冲溶液(体积和乙醇等量)得到nadh溶液；
44.60℃水浴加热，80rmp/min搅拌条件下将nadh溶液注入脂质体溶液中，继续搅拌至乙醇完全挥发，均质10min、超声10min、0.45μm微孔滤膜过滤得到nadh脂质体；
45.tem显示器粒径为56.11
±
13.84nm，双分子层架构，nadh被包裹其中。
46.(2)海藻酸钠35份加水配制成质量分数为3％的海藻酸钠溶液，加入步骤(1)制得的nadh脂质体得到混合溶液，500rmp/min搅拌条件下将混合溶液逐滴滴入3倍量的质量分数为2.5％的氯化钙溶液中，滴加完成后，过滤、洗涤、80℃干燥得海藻酸钠包覆nadh脂质体微胶囊。
47.tem显示器粒径为75.43
±
14.15nm，nadh脂质体被包裹其中。
48.(3)取分子量为300
‑
500kda的透明质酸80份加水制备质量分数为5％的透明质酸水溶液，60℃水浴加热溶解，加入乳化剂3份搅拌混匀后，400rmp/min搅拌条件下加入步骤(2)制备的海藻酸钠包覆nadh脂质体微胶囊，继续搅拌5min后喷雾干燥，喷雾干燥进口温度为150℃，蠕动泵转速为500ml/h，得到nadh微胶囊制剂。
49.tem显示器粒径为88.24
±
17.18nm，海藻酸钠包覆nadh脂质体微胶囊被包裹其中。
50.实施例3
51.同实施例1，区别在于，省略步骤(1)nadh脂质体的制备过程，直接以nadh为原料进行步骤(2)。制得粒径为52.47
±
13.85nm的nadh微胶囊制剂。
52.实施例4
53.同实施例1，区别在于，省略步骤(2)海藻酸钠包覆过程，直接以步骤(1)nadh脂质体为原料进行步骤(3)。制得粒径为71.46
±
13.46nm的nadh微胶囊制剂。
54.实施例5
55.同实施例1，区别在于，省略步骤(1)和步骤(2)，以nadh为原料直接进行步骤(3)透明质酸包覆。制得粒径为42.71
±
11.35nm的nadh微胶囊制剂。
56.效果验证例1
57.对实施例1
‑
5制备的nadh微胶囊制剂以及常温环境状态下储存1个月、3个月后的nadh微胶囊制剂分别加40％的乙醇水溶液制备中浓度为0.5g/ml的溶液，进行超氧银离子自由基清除、abts自由基清除和dpph自由基清除测试实验，具体方法为常规技术手段，在此不进行赘述，结果见表1；
58.表1
[0059][0060]
由表1数据可以得出，实施例1
‑
5新制备的产品对于超氧银离子自由基、abts自由基和dpph自由基均具有很好的清除效果，但是，储存一定时间后其抗氧化性能均存在一定程度的下降，且储存时间越长，抗氧化性能下降越多。而相比之下，本发明实施例1
‑
2制备nadh微胶囊制剂则在储存3个月后仍然保持了较高的自由基清除率，说明本发明将制备nadh制备成微胶囊形式，可以极大的提高nadh的稳定性。
[0061]
效果验证例2
[0062]
分别将实施例1
‑
5制备的nadh微胶囊制剂用于制备护肤品，并对其进行效果验证，具体过程如下：
[0063]
(1)称取原料：实施例1
‑
5任一nadh微胶囊制剂10份、甘油10份、聚乙二醇peg
‑
400 8份、聚乙烯吡咯烷酮3份，羧甲基纤维素钠3份，石榴提取液5份、金银花提取液5份、橄榄油3份、水40份；
[0064]
(2)聚乙二醇peg
‑
400加入20份水中超声混匀后加入聚乙烯吡咯烷和羧甲基纤维素钠，搅拌混匀得溶液a；
[0065]
(3)金银花提取液、石榴提取液加入20份水中混匀后依次加入nadh微胶囊制剂、甘油、橄榄油，继续搅拌混匀的溶液b；
[0066]
(4)将溶液a和溶液b搅拌混匀得睡眠面膜；
[0067]
(5)选择50名年龄在28
‑
33岁之间、对化妆品物过敏史、皮肤健康的志愿者对制备的护肤品进行效果验证；所有受试者在彻底清洁皮肤后使用visia仪器进行皮肤检测，具体项目有全脸皱纹、色斑指数；然后受试者分为5组，每组10人，分别每隔一日使用实施例1
‑
5nadh微胶囊制剂制备的护肤品，使用10次后，对受试者皮肤进行再次检测，计算实验前后差值，求取10名受试者平均值，结果见表2。
[0068]
表2
[0069]
名称全脸皱纹色斑指数实施例14.256.57实施例24.136.28实施例33.114.38实施例43.254.61实施例52.843.57
[0070]
由表2数据可以得出，使用本发明实施例1
‑
2的nadh微胶囊制剂制备的护肤品的抗衰老效果更好。
[0071]
(6)选取生育后产生妊娠纹的受试者50名(受试者距离生产时间均为1年内，且每名受试者身上均有严重的妊娠纹)，分为5组，每组10人，分别每日使用实施例1
‑
5nadh微胶囊制剂制备的护肤品涂抹妊娠纹部位，具体的，以腹中线为分割线，于左边分别涂抹实施例1
‑
5nadh微胶囊制剂制备的护肤品涂抹妊娠纹部位，右边作为对照不进行涂抹，每天1次，每次涂抹时间30min；连续使用3个月后，对比左右两边妊娠纹情况，具体结果见表3。
[0072]
表3
[0073]
名称显著改善轻微改善无改善实施例11000实施例21000实施例3820实施例4730实施例5550
[0074]
显著改善：妊娠纹基本消除。轻微改善：妊娠纹有部分程度地得到消除。无改善：妊娠纹基本没有减少。
[0075]
由表3数据可以得出，本发明产品可以有效去除妊娠纹，效果较实施例3
‑
5更为明显。
[0076]
效果验证例3
[0077]
对实施例1
‑
5制备的nadh微胶囊制剂放置于等体积的人工胃液(取稀盐酸1mol/ml，加水稀释，调节ph至1.5，再根据每100ml加入1g的胃蛋白酶混匀，最后进行0.2um无菌滤头过滤使用)环境下消化3小时(模拟胃排空时间)后检测nadh剩余含量。通过碧云天的nad
+
/nadh检测试剂盒(wst
‑
8法)，一种基于wst
‑
8的显色反应，通过比色法来检测上述样品中nad
+
(氧化型辅酶i)和nadh(还原型辅酶i)各自的量、比值和总量的检测试剂盒。
[0078]
单独测定nadh的量：60℃水浴加热30分钟后，样品中nad
+
会分解而只保留nadh。nadh将wst
‑
8还原成formazan，通过比色法确定反应生成的formazan的量，最终可以确定样品中nadh的量，结果见表4。
[0079]
表4
[0080][0081]
由表4数据可以得出，本发明可以实现nadh在胃酸条件下不被降解，实现nadh最大限度的生物利用度。
[0082]
效果验证例4
[0083]
对实施例1
‑
5制备的nadh微胶囊制剂放置于细胞数量为300万的ges1(永生化胃黏膜上皮细胞系)培养皿中，将培养皿放在细胞培养箱孵育24小时后，检测细胞中的nadh浓度和nad
+
的转化含量，结果见表5。
[0084]
nad(nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)是所有细胞中都存在的一种辅酶，包括nad
+
(氧化型)和nadh(还原型)两种形式。nad
+
既是氧化还原反应过程中传递电子的辅酶，又可以作为很多酶的底物来参与细胞内反应。nad
+
在细胞和体内发挥着重要的功能，其合成和降解及其产物参与细胞凋亡、代谢调控和基因表达的调控等，并且nad
+
的减少是细胞死亡的主要因素之一。
[0085]
参照wst
‑
8方法，测定nad
+
和nadh的总量：乙醇(ethanol)在乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,adh)的作用下氧化生成乙醛(acetaldehyde)，在这一反应过程中nad
+
被还原为nadh；生成的nadh在电子耦合试剂1
‑
mpms(1
‑
methoxy
‑5‑
methylphenazinium methyl sulfate)的作用下将wst
‑
8还原生成橙黄色的formazan，在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的formazan与样品中nad
+
和nadh的总量呈比例关系。
[0086]
单独测定nadh的量：60℃水浴加热30分钟后，样品中nad
+
会分解而只保留nadh。nadh将wst
‑
8还原成formazan，通过比色法确定反应生成的formazan的量，最终可以确定样品中nadh的量。
[0087]
测定nad
+
以及nad
+
/nadh比值：根据前两步检测获得的nad
+
和nadh的总量以及nadh
的量，即可计算得到上述样品中nad+的量以及nad
+
/nadh的比值。
[0088]
表5
[0089]
名称nadh(pmol/million cell)nad
+
(pmol/million cell)nad+/nadh实施例194.63421.636.2实施例2133.22313.817.4实施例3252.71596.56.3实施例4464.11121.92.4实施例5657.3893.21.4
[0090]
由表5数据可以得出，本发明可以实现nadh进入细胞后最大程度的利用转化成nad
+
，减少总nad不必要的损失，提高nadh最大限度的细胞利用度和nad
+
活性维持度。
[0091]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。