茶黄素类用于预防或治疗冠状病毒感染的用途的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及所述茶黄素类和/或含有它们的茶叶或其提取物在制备预防或治疗冠状病毒感染性疾病的药物、饮料或食品中的用途。本发明也涉及红茶及其提取物的新用途，具体涉及红茶及其有效成分在治疗冠状病毒感染的用途。


背景技术：

2.红茶，(英文：black tea)，红茶属全发酵茶，是以适宜的茶树新牙叶为原料，经萎凋、揉捻(切)、发酵、干燥等一系列工艺过程精制而成的茶。红茶在加工过程中发生以茶多酚酶促氧化为中心的化学反应，鲜叶成分变化较大，茶多酚减少90％以上，产生了茶黄素、茶红素等新成分和香气物质。
3.红茶水浸出物中，主要为多酚类、茶红素、茶褐素、茶黄素类、氨基酸、可溶性糖、水溶性果胶、有机酸和芳香油类等成分。其中，茶黄色素以多酚类物质、儿茶素为主要成分，还含有氨基酸、维生索c、维生素e、维生素a原、黄酮及黄酮醇等。茶黄素类是茶色素的主要成分，共有12种组分，其中茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯和茶黄素-3
’‑
没食子酸酯是4种最主要的茶黄素。
4.红茶可以帮助胃肠消化、促进食欲，可利尿、消除水肿，并强壮心脏功能。红茶中“富含的黄酮类化合物能消除自由基，具有抗酸化作用，降低心肌梗塞的发病率。


技术实现要素：

5.本发明发明人经过广泛深入的研究，首次发现，茶黄素类可以治疗冠状病毒感染，茶黄素类活性成分可以来源于发酵茶，特别是红茶。
6.红茶提取物中茶黄素类可以结合冠状病毒受体ace2,从而阻断病毒进入细胞，其中效果最好的是茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯tf3，tf3在细胞水平抑制新冠假病毒进入细胞的ec
50
＝5.585μm,抑制新冠突变株b.1.1.7假病毒进入细胞的ec
50
＝3.993μm。此外茶黄素类还可以同时抑制新型冠状病毒sars-cov-2 和中东呼吸综合征mers病毒的主蛋白酶(3clpro)、木瓜蛋白酶样蛋白酶(plp), 效果最好的是茶黄素-3-双没食子酸酯tf2a；茶黄素类也可以抑制新型冠状病毒的rdrp聚合酶。鉴于冠状病毒主蛋白酶(3clpro)、木瓜蛋白酶样蛋白酶(plp) 和rdrp聚合酶都高度保守，因此，茶黄素类抑制冠状病毒具有广谱性。
7.鉴于此，本发明的目的在于提供可以预防和治疗冠状病毒感染的有效广谱抑制剂，可以预防和治疗冠状病毒引起的肺炎感染或普通感冒。
8.本发明具体地是通过以下技术方案实现的：
9.一方面，本发明提供了茶黄素类和/或含有它们的茶叶或其提取物在制备预防或治疗冠状病毒感染性疾病的药物、饮料或食品中的用途。本发明还提供了茶黄素类、含有它们的茶叶或其提取物的新用途，用于预防和治疗冠状病毒感染性疾病。本发明也提供了一种预防和治疗冠状病毒感染性疾病的方法，包括向受试者施用预防和治疗有效量的茶黄素类、含有它们的茶叶或其提取物。
没食子酸酯的结构式如下：
[0027][0028]
中文名称：茶黄素-3-没食子酸酯
[0029]
英文名称：theaflavin-3-gallate
[0030]
分子式：c
36h28o16
[0031]
分子量：716.60
[0032]
cas号：30462-34-1
[0033]
用途：茶黄素-3-没食子酸酯，是一种红茶茶黄素单体，被认为是红茶生物学上重要的活性成分，有益健康。茶黄素-3-没食子酸酯充当促氧化剂并在癌细胞中诱导氧化应激。茶黄素-3-没食子酸酯可以以时间和浓度依赖性方式与还原型谷胱甘肽(gsh)直接反应。
[0034]
茶黄素-3
’‑
没食子酸酯购买于奇松生物科技有限公司,货号(qs30654)；茶黄素-3
’‑
没食子酸酯的结构式如下：
[0035][0036]
中文名称：茶黄素-3
’‑
没食子酸酯
[0037]
英文名称：theaflavin-3
’‑
gallate
[0038]
分子式：c
36h28o16
[0039]
分子量：716.60
[0040]
cas号：28543-07-9
[0041]
用途：茶黄素-3
’‑
没食子酸酯，是一种红茶茶黄素单体，被认为是红茶生物学上重要的活性成分,茶黄素-3
’‑
没食子酸酯充当促氧化剂并在癌细胞中诱导氧化应激。茶黄素-3
’‑
没食子酸酯可以以时间和浓度依赖性方式与还原型谷胱甘肽 (gsh)直接反应。
[0042]
茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯粉末购买于targetmol公司,货号(t5429)；茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯的结构式如下：
[0043][0044]
中文名称：茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯
[0045]
英文名称：theaflavin-3,3
′‑
digallate
[0046]
别称：茶黄素双没食子酸酯；双没食子酸酯茶黄素
[0047]
分子式：c
43h32o20
[0048]
分子量：868.7
[0049]
cas号：30462-35-2
[0050]
用途：茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯又名茶黄素双没食子酸酯，是一种存在于红茶中的多酚类物质，具有很高的药用价值。茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯有抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗氧化、抗菌等功效。
[0051]
所述茶黄素类也可以从含有它们的茶叶中提取获得。
[0052]
合适的茶叶包括全发酵的红茶、部分发酵的乌龙茶、武夷岩茶、白茶、铁观音等青茶类和后发酵的黑茶类例如普洱茶。
[0053]
本发明的上述化合物可以配制成各种适合的药物制剂形式。可以单独使用，或者将其与药用辅料(例如赋形剂、稀释剂等)混合，配制成口服给药的片剂、胶囊剂、颗粒剂或糖浆剂等或注射给药的粉针剂、溶液剂。
[0054]
本发明提供了一种茶黄素类在制备预防或治疗冠状病毒感染性疾病的药物、饮料或食品中的用途。
[0055]
其中，茶黄素类可以单独使用，也可以结合使用，可以同时或分别给药，或顺序给药。茶黄素类可以按照本领域常规技术手段制备成常规给药制剂形式。
[0056]
在本发明一种具体的实施方案中，其中所述冠状病毒为2019新型冠状病毒 (2019-cov),严重急性呼吸综合症病毒(sars),中东呼吸综合症病毒 (mers)肺炎感染以及普通感冒病毒(hcov-oc43)
[0057]
在本发明一种具体的实施方案中，其中所述冠状病毒为人冠状病毒 nl63(hcov-nl63)、人冠状病毒229e(hcov-229e)或人冠状病毒 hku1(hcov-hku1)。
[0058]
在本发明一种具体的实施方案中，其中所述茶黄素类来源于红茶，包括红茶粉碎混合物、红茶提取物或者它们与茶黄素类的混合物。
[0059]
在本发明一种具体的实施方案中，其中所述茶黄素类来源于青茶类，包括青茶类的粉碎混合物、青茶类的提取物或者它们与茶黄素类的混合物。
[0060]
所述青茶类包括部分发酵的乌龙茶、武夷岩茶、白茶、铁观音等。
[0061]
在本发明一种具体的实施方案中，其中所述药物为口服制剂，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂；所述食品包括茶、汤、粥、菜、汁等各种形式的功能食品；优选地，所述的药物、饮料或食品还含有载体、稀释剂或赋形剂。
[0062]
在本发明一种具体的实施方案中，其中所述药物还含有载体、稀释剂或赋形剂。
[0063]
本发明的化合物可以配制成各种适合的药物制剂形式。
[0064]
另一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗冠状病毒感染的药物组合物、饮料或食品，其特征在于：含有治疗或预防有效量的茶黄素类有效成分和/ 或含有它们的茶叶或其提取物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0065]
在本发明一种具体的实施方案中，其中所述药物组合物为口服制剂或口腔或鼻吸入制剂，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂；所述饮料或食品包括茶、汤、粥、菜、汁等各种形式的功能食品。
[0066]
在本发明一种具体的实施方案中，其中所述茶黄素类为茶黄素、茶黄素-3
‑ꢀ
没食子酸酯、茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯和/或茶黄素-3
’‑
没食子酸酯。所述茶黄素类还可以为它们中任意两种或三种。
[0067]
在本发明一种具体的实施方案中，其中所述茶黄素类为茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯。
[0068]
本发明还提供了一种用于预防或治疗冠状病毒感染的口服制剂，其特征在于：含治疗有效量的茶黄素类和任选的其他抗冠状病毒感染的药物活性成分，以及药学上可接受的载体辅料。
[0069]
在本发明一种具体的实施方案中，其中所述茶黄素类来源于红茶。
[0070]
在本发明一种具体的实施方案中，其中所述红茶为红茶提取物，所述口服制剂是片剂、胶囊剂、颗粒剂，优选片剂。
[0071]
本发明的有益效果
[0072]
与现有技术相比，本发明的技术效果如下：
[0073]
茶黄素类在细胞水平能够结合受体ace2，阻止病毒进入细胞，其中效果最好的是茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯，抑制sars-cov-2假病毒的 ec
50
＝5.585um；抑制sars-cov-2突变株d614g假病毒的ec
50
＝3.993um。此外茶黄素类还可以同时抑制新型冠状病毒sars-cov-2和中东呼吸综合征 mers病毒的主蛋白酶(3clpro)、木瓜蛋白酶样蛋白酶(plp)；其中效果最好的是茶黄素-3-双没食子酸酯tf2a，茶黄素类也可以抑制新型冠状病毒的 rdrp聚合酶。茶黄素类可以抑制oc43病毒，其中效果最好的是茶黄素-3,3
’‑ꢀ
双没食子酸酯，抑制oc43病毒ec
50
《50nm。
[0074]
总之，茶黄素类可以同时抑制病毒入侵和复制，从而达到预防和治疗冠状病毒肺炎感染以及普通感冒。
附图说明
[0075]
图1显示荧光共振能量转移(fret)法检测100μm茶多酚和茶黄素对2019cov 和mers clpro细胞外蛋白酶切活性的影响；
[0076]
图2显示荧光共振能量转移(fret)法检测茶黄素，茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯，茶黄素-3-没食子酸酯，茶黄素-3
’‑
没食子酸酯对2019cov 3clpro细胞外蛋白酶切活性的影
响；
[0077]
图3显示荧光共振能量转移(fret)法检测茶黄素，茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯，茶黄素-3-没食子酸酯，茶黄素-3
’‑
没食子酸酯对mers 3clpro细胞外蛋白酶切活性的影响；
[0078]
图4显示荧光共振能量转移(fret)法检测茶黄素，茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯，茶黄素-3-没食子酸酯，茶黄素-3
’‑
没食子酸酯对2019cov plpro细胞外蛋白酶切活性的影响；
[0079]
图5显示荧光共振能量转移(fret)法检测茶黄素，茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯，茶黄素-3-没食子酸酯，茶黄素-3
’‑
没食子酸酯对mers plpro细胞外蛋白酶切活性的影响；
[0080]
图6显示10μm茶多酚和茶黄素，茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯，茶黄素-3-没食子酸酯，茶黄素-3
’‑
没食子酸酯抑制sars-cov-2假病毒的效果。
[0081]
图7显示茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯抑制sars-cov-2假病毒的ec
50
和cc
50
。
[0082]
图8显示茶黄素，茶黄素-3-没食子酸酯，茶黄素-3
’‑
没食子酸酯的cc
50
。
[0083]
图9显示100μm茶黄素，茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯，茶黄素-3-没食子酸酯，茶黄素-3
’‑
没食子酸酯抑制sars-cov-2假病毒突变株d614g的效果。
[0084]
图9. 100μm茶黄素，茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯，茶黄素-3-没食子酸酯，茶黄素
ꢀ‑3’‑
没食子酸酯抑制sars-cov-2假病毒突变株d614g的效果。
[0085]
图10显示茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯抑制sars-cov-2假病毒突变株d614g的 ec
50
。
[0086]
图11.茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯和茶黄素-3-没食子酸酯抑制oc43-cov病毒效果。
[0087]
下面结合具体实验操作及数据，进一步说明本方面的技术方案。
[0088]
以下通过试验说明茶黄素对各个亚型冠状病毒的抑制作用。
具体实施方式
[0089]
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，这些实施例仅是对本发明的举例说明而已，无论如何不能解释为对本发明范围的限制。
[0090]
实施例1荧光共振能量转移(fret)法检测化合物对3clpro细胞外蛋白酶切活性的影响
[0091]
实验材料与仪器
[0092]
3cl蛋白酶荧光底物dabcyl-knstlqsglrke-edans:由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
[0093]
pl蛋白酶荧光底物dabcyl-krlkggapikge-edans:由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；
[0094]
荧光底物母液：用高压灭菌的缓冲液(20mm tris-hcl,ph7.4,120mm nacl) 配制，终浓度为100μm。分装成小份，冻存于-20℃备用；
[0095]
化合物母液：用100％dmso配制，终浓度为100mm,4℃保存备用；
[0096]
hbs-ep工作缓冲液(10mm hepes,150mm nacl,3mm edta和0.005％(v/v) surfactant p20,ph7.4)；
[0097]
酶标仪(md公司)
luciferase)水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，vsv)的假病毒包装系统由反向遗传学质粒拯救(rescue)获得，相关质粒均从karafast购得。其中pvsv-δg-luciferase用于转录复制缺陷型的重组vsv基因组，其中vsv 的糖蛋白(g)被荧火虫荧光素酶(firefly luciferase，fluc)所替代，而pbs-n, pbs-p,pbs-l,pbs-g作为辅助载体用于帮助第一轮的病毒拯救。
[0120]
拯救与扩增含vsvg外膜的vsv-dg-fluc复制缺陷型病毒
[0121]
将bhk21-ace2细胞贴壁于3.5cm dish,第二天待细胞达到90％密度时，并用重组表达t7 rna聚合酶的痘病毒(vaccinia virus-t7,vv-t7)以moi＝5的滴度(dmem，无血清)在37℃感染45分钟。用pbs漂洗细胞一遍后，用lipo3000 转染已混合好的反向遗传学质粒(pvsv-δg-luciferase：pbs-n:pbs-p:pbs-g: pbs-l＝5:3:5:8:1)转染已被vv-t7感染过的细胞，12小时后换液，48小时后收取含有初代vsv-dg-fluc病毒的上清,用0.22μm滤膜过滤上清除去残留的vv-t7。为进一步扩增病毒，用过表达vsv g蛋白的pmd2.g(atcc：plasmid#12259) 转染hek293t细胞，24小时后，初代上清与dmem+10％血清1：1混合用于感染，24-48小时后收取上清，12000转离心2分钟后保留上清并分装，用噬斑法测定病毒滴度，并保存于-80℃。
[0122]
包装含新型冠状病毒(sars-cov-2)外膜的vsv-dg-fluc的复制缺陷型假病毒
[0123]
用过表达sars-cov-2wt或者突变株的s外膜蛋白(c端截短18个氨基酸，提高包装效率)的质粒(pcaggs-sars2-s-dc)转染hek293t细胞或vero-e6 细胞。24小时后，用moi＝10的含vsvg外膜的vsv-dg-fluc病毒(1:30稀释) 在37℃感染转染后的细胞1小时，然后加入含1：300稀释的大鼠抗vsvg抗血清(夏宁邵实验室)的dmem+10％fbs的培养基，用于完全中和残留的含 vsvg外膜的vsv-dg-fluc假病毒。24-48小时后收取含有病毒的上清，12000 转离心2分钟后保留上清并分装，用有限稀释法通过cpe测定病毒滴度 (infectious unit)，并保存于-80℃。
[0124]
用基于vsv的sars-cov-2假病毒感染确定药物半数有效深度(ec
50
)
[0125]
将bhk21-ace2细胞贴壁于96孔板。24小时后，细胞密度约达到90％，在dmem+10％fbs的培养基中将不同浓度的药物分别与不同的假病毒混合，如表达gfp或fluc的含vsvg外膜蛋白或sars-cov-2外膜蛋白的vsv-dg假病毒(moi＝0.1)，然后感染细胞。24小时后，通过荧光显微镜拍摄感染后表达gfp 的细胞；或要测定细胞内的荧光素酶强度，则除去培养上清，加入20μl 1x passivelysis缓冲液(promega)，室温放置10分钟后通过one-glo luciferase kit(promega) 和enspire多功能酶标仪(perkinelmer)进行测定。
[0126]
实施例4
[0127]
化合物半数细胞毒性cc
50
的确证
[0128]
hek293-ace2细胞接种到96孔板中，次日，细胞先分别加入0.137, 0.4111.1.233,3.7,11.1,33.3和100μm的化合物。药物对hek293-ace2的细胞毒性用celltiter-glo 2活性检测来测量。
[0129]
实验结果
[0130]
茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯抑制sars-cov-2假病毒的ec
50
和cc
50
的确证
[0131]
茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯抑制sars-cov-2假病毒的ec
50
＝5.585μm, cc
50
＝240.8μm,si＝43.12
[0132]
茶黄素cc
50
＝120.7μm,茶黄素-3-双没食子酸酯cc
50
＝98.86μm，茶黄素-3
’‑ꢀ
双没食子酸酯cc
50
＝105.4μm.
[0133]
茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯抑制sars-cov-2突变株假病毒d614g的ec
50
的确证
[0134]
茶黄素-3,3
’‑
双没食子酸酯抑制sars-cov-22突变株假病毒d614g的 ec
50
＝3.993μm,
[0135]
实施例5核蛋白免疫荧光染色检测茶黄素对冠状病毒oc43的抑制效果
[0136]
病毒的制备
[0137]
hcov-oc43(oc43)菌株购自美国典型培养物保藏中心(人类冠状病毒oc43 (atcc，vr-1558))，并通过rd细胞(atcc，ccl-136)进行繁殖；在rd 细胞培养条件是dmem+2％fbs。感染后72小时(hpi)后，通过噬斑法测定病毒滴度(pfu/ml)。
[0138]
病毒感染实验
[0139]
茶黄素稀释在补充有2％fbs的dmem中，rd细胞在感染复数(moi＝0.1)下被感染oc43。在37℃孵育48小时的过程中，化合物和病毒与细胞保持在一起。通过针对核蛋白的免疫荧光染色评估rd细胞中oc43的感染效率。通常，rd细胞在48hpi时用100％甲醇固定，在37℃时用1％bsa /pbs封闭1h，并在1时用抗 oc43 np mab(sigma，mab 9012，克隆541-8f)染色：1000在37℃下孵育1 小时，然后将二抗再孵育1小时。细胞核用hoechst 33342(thermo scientifich1399)在1：5000处染色15分钟。通过mshot荧光显微照片捕获图像。
[0140]
结果显示：0.137μm浓度下，茶黄素可以抑制99％以上的oc43-cov病毒复制。
[0141]
上述实施例和实验例对本发明对本发明做了具体说明。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。