一种抗猪流行性腹泻病病毒变异株shxx1902的免疫疫苗的制备方法与流程

1.本发明属于生物学领域，涉及一种菌株的培养方法，具体来说是一种抗猪流行性腹泻病病毒变异株shxx1902的免疫疫苗的制备方法。


背景技术：

2.猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒porcine epidemic diarrhea virus，pedv)引起的一种急性、高度接触性的肠道传染病。1971年英国首先报道该病，随后在比利时、英国、日本等多个国家暴发流行。1984年我国学者报道分离到了pedv；随后ped在我国各地陆续发生，并于1995年开始用经典疫苗毒株cv777灭活苗或弱毒苗进行防控，取得了较好的防控效果。自2010年以来，全国大部分猪场包括免疫过经典疫苗毒株(如cv777、dr13等)的猪场开始大规模暴发由pedv变异强毒株引起的猪群腹泻性疫病。其中以2
‑
10d的哺乳仔猪发病最为严重，引起水样腹泻、呕吐和脱水等症状，发病率可达100％，病死率达50％
‑
90％。目前该病仍然是危害养猪业的最为严重疫病，已经给我国乃至全球养猪业造成了巨大的损失。发明发现，pedv毒株基因变异是造成免疫失败和仔猪死亡率高的主要原因。因此，pedv流行变异强毒株的有效疫苗成为当前发明的热点。本实验室于2019年分离得到1株变异强毒株并制备了灭活疫苗，对小鼠进行免疫。
3.迄今为止，pedv的传播仍然具有挑战性。近年来，从临床样本中分离出的许多pedv毒株难以在vero细胞中培养。此外，另一项发明成功地利用猪小肠上皮细胞分离和繁殖了pedv株，并证明这些细胞比vero细胞更适合于pedv的分离。然而，这种细胞系在大多数实验室中都不可用。
4.另据报道，首次尝试对爱荷华州立大学兽医诊断实验室收到的68份临床样本进行病毒分离，这些样本对美国pedv s
‑
indel变异株呈阳性，但在细胞培养中分离病毒的尝试没有成功。随后用pedv s
‑
indel变异株阳性肠匀浆接种3只3周龄猪。从3头猪小肠匀浆和盲肠内容物中成功分离出美国pedv s
‑
indel变异株。这可能是由于多种因素造成的，例如样本中病毒浓度低，一些样本的细胞毒性，以及临床样本采集后储存条件的变化。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种抗猪流行性腹泻病病毒变异株shxx1902的免疫疫苗的制备方法，所述的这种抗猪流行性腹泻病病毒变异株shxx1902的免疫疫苗的制备方法要解决现有技术中的抗猪流行性腹泻病病毒变异株shxx1902的免疫疫苗的免疫效果不佳的技术问题。
6.本发明提供了一种抗猪流行性腹泻病病毒变异株shxx1902的免疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：
7.1)一个培养vero细胞的步骤，将vero细胞加入含质量百分比浓度为10％的胎牛血清的培养液中，于37℃，含有体积百分比浓度为5％的co2培养箱中培养，然后消化传代至细
胞摇瓶中，用无血清培养基稀释至细胞密度达6
×
106个/ml时备用；
8.2)一个培养病毒的步骤，在vero细胞培养至细胞密度达6
×
106个/ml时，加入0.1l猪流行性腹泻病病毒变异株shxx1902的细胞培养液，进行稀释传代，接种moi＝0.1，ph为7.4
±
0.1，摇床速度设为120r/min，培养温度为37℃，传代后细胞密度为3
×
106个/ml，培养72h，备用；
9.3)一个制备免疫原的步骤，将滴度为2
×
106tcid
50
/ml的猪流行性腹泻病病毒变异株shxx1902病毒液加入终质量百分比浓度为0.2％的甲醛，猪流行性腹泻病病毒变异株shxx1902的保藏号为cgmcc no.22380，37℃灭活病毒28h；然后加至铺有vero细胞的96孔板中，50μl/孔，37℃，在体积百分比浓度为5％的co2培养箱培养2d；收获细胞上清，冷丙酮固定细胞，收获的上清加至铺有vero细胞的96孔板中，继续培养2d；弃上清，用冷丙酮固定细胞，灭活验证合格后，加入铝胶佐剂，按抗原:佐剂的体积比为1:1的比例混合后使用。
10.本发明的猪流行性腹泻病病毒变异株shxx1902的保藏号为cgmcc no.22380，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
11.全基因序列分析表明(seq id no.1所示)，shxx1902毒株属于gii(c)亚群，其中包括2015年以来我国流行的pedv毒株。自2010年末以来，高毒力pedv
‑
gii基因型毒株在全球范围内出现，给许多国家的猪肉行业造成了严重损失。系统发育发明表明，我们的分离株在spike基因(s))和其他基因之间表现出不一致的基因型。另外，已有报道证实了gii(c)亚群的嵌合性。这与我们的分离株一致，通过对simplot v.3.5.1的进一步分析，该分离毒属于gii
‑
c。目前中国主要使用的2种商品化疫苗毒株cv777和aj1102分别属于gⅰ群和gii
‑
b，和我们的分离株属于不同的基因群，作为疫苗备选株为我国猪流行性腹泻病毒的防控提供一个补充。
12.表1 cv777，aj1102与shxx1902的核苷酸(氨基酸)同源性比较
[0013][0014]
本发明的目的在于优化细胞摇瓶悬浮批次培养猪流行性腹泻病病毒(shxx1902)株，制备灭活免疫原，使其得到最大的免疫原性。本发明首先通过摇瓶培养vero细胞，优化shxx1902毒株病毒培养温度、接种moi及接毒时初始细胞密度等病毒培养条件，使病毒与细胞相互适应，提高病毒滴度。在500ml的细胞摇瓶中，无血清悬浮培养vero细胞，稀释传代并接毒，确定细胞培养阶段最适传代时间、病毒培养阶段最适收毒时间，利用优化后条件培养病毒，收获的病毒液经甲醛灭活后，分别加入铝胶佐剂，制备免疫原，间隔2周分2次免疫balb/c小鼠，使用大肠杆菌表达的n蛋白包被elisa板，检测小鼠血清抗体效价。
[0015]
通过实验发现，本发明的猪流行性腹泻病毒(shxx1902)株在摇瓶中的最适培养条件为温度37℃，接种moi＝0.1，接毒初始细胞密度3
×
106个/ml，接毒后48h，病毒滴度可达4.52
×
106tcid50/ml。病毒液灭活后混合铝胶佐剂免疫小鼠，设置商品化疫苗(cv777)免疫组以及空白对照组，2次免疫小鼠，间隔2周，一直监测到首免后49天，灭活病毒与商品化灭活疫苗引起的抗体水平相近。
[0016]
本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。应用细胞摇瓶培养灭活免
疫原的病毒滴度，免疫小鼠后能产生与商品化疫苗水平相近的抗体。本发明为规模化生产猪流行性腹泻病病毒及其灭活疫苗制备工艺的改进奠定了基础。
附图说明
[0017]
图1显示了12h,24h,36h,48h,60h和72h悬浮vero细胞中shxx1902(p35)的病毒滴度。
[0018]
图2显示了24h shxx1902,shxx1912和sh1302免疫荧光分析。
[0019]
图3显示了pedv shxx1902,cv777和pbs(对照)组pedv n蛋白特异性抗体反应。
[0020]
图4显示了猪流行性腹泻病毒株(shxx1902)全基因的进化树。
[0021]
图5显示了猪流行性腹泻病毒株(shxx1902)s基因的进化树。
具体实施方式
[0022]
1材料与方法
[0023]
1.1细胞及病毒 vero悬浮细胞购自商城北纳创联生物科技有限公司，猪流行性腹泻病毒株(shxx1902)由本实验室分离并保存，猪流行性腹泻病病毒变异株shxx1902的保藏号为cgmcc no.22380。
[0024]
1.2病毒全基因序列分析 shxx1902(第5代)的全基因序列的genbank mn841671。
[0025]
1.3实验动物 spf级balb/c小鼠，雌性，6周龄，24只，体重18～22g，购自上海普路腾生物科技有限公司。
[0026]
1.4主要试剂及仪器 fitc标记的抗鼠单克隆抗体，胎牛血清购自sigma公司；dmem培养基，胰酶购自gibco公司；铝胶佐剂购自创智生物科技有限公司；猪流行性腹泻病毒s1d12单抗购自veterinary medical research&development corporation；500ml细胞摇瓶购自corning公司。
[0027]
1.5摇瓶培养条件优化 复苏vero细胞，用含10％胎牛血清的培养液，于37℃，5％co2培养箱中，随后消化传代至细胞摇瓶中，用无血清培养基稀释至细胞密度达6
×
106个/ml。
[0028]
1.6病毒培养阶段最适收毒时间 参照摇瓶培养病毒时最适条件。培养至细胞密度达6
×
106个/ml时，加入0.1l细胞培养液，进行稀释传代，传代后细胞密度为3
×
106个/ml。接种moi＝0.1，ph为7.4
±
0.1，摇床速度设为120r/min，培养温度为(37
±
0.1)℃。重复3次。每隔12h取样，0,12,24,36,48,60,and 72小时检测病毒滴度，绘制病毒一步生长曲线，确定最佳收毒时间。收获的病毒液1600
×
g离心去细胞碎片，上清分装，于
‑
80℃冻存。
[0029]
病毒生长动力学曲线见图1显示，在37℃培养条件下，此株病毒在12,24,36,48,60,和72h,病毒滴度分别如下：1.28
×
105,8.78
×
105,2.01
×
106,4.52
×
106,5.41
×
106,和8.20
×
106tcid50/ml。
[0030]
1.7病毒tcid
50
检测 采用间接免疫荧光染色法，取5
×
104个/孔vero细胞加至96孔板中，病毒经dmem 10倍系列稀释(10
‑1～10
‑8)后，依次加至96孔板中，50μl/孔，37℃，5％co2温箱中培育48h；弃上清，加入80％冷丙酮固定细胞，
‑
20℃过夜，pbst洗涤细胞3次，每次5min；加入s1d12单抗37℃温育2h，pbst洗涤细胞3次，每次5min；fitc标记的山羊抗鼠二抗的工作液，50μl/孔，避光，37℃温箱平放1h，用pbst洗涤3次，每次5min，加入dapi温育5min，
pbst洗涤细胞3次，每次5min；使用倒置荧光显微镜观察绿色荧光(病毒)，蓝色荧光(细胞核)有1个或更多荧光标记的孔记“+”，无绿色斑点的孔记：
“‑”
。
[0031]
1.8免疫原制备 将滴度为2
×
109tcid
50
/ml的病毒液加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃灭活病毒28h；加至铺有vero细胞的96孔板中，50μl/孔，37℃，5％co2培养箱培养2d；收获细胞上清，冷丙酮固定细胞，收获的上清加至铺有vero细胞的96孔板中，继续培养2d；弃上清，用冷丙酮固定细胞，经1.7项方法灭活验证合格后，与铝胶佐剂按抗原:佐剂＝1:1的比例使用；与疫苗cv777同时以105tcid50/只小鼠进行配制。
[0032]
1.9小鼠分组及免疫 将babl/c小鼠随机分为3组，每组8只，分别为2次免疫铝胶佐剂pedv变异株组、2次免疫cv777疫苗组、2次pbs对照组。免疫组每只小鼠后肢肌肉注射对应的0.1ml免疫原，对照组免疫0.1mlpbs。2次免疫组间隔14d后再次免疫。0,7,14,21,28,35,42和49天采血，离心后收集血清，使用间接elisa检测抗体效价，使用大肠杆菌表达的n蛋白包被elisa板。
[0033]
如图3所示，一直监测到免疫后第49天，shxx1902和cv777疫苗组均能产生相接近的elisa抗体滴度。3周龄小鼠多点皮下接种灭活pedv shxx1902，cv777疫苗以及pbs。在0，7，14，21，28，35，42和49天收集血清样本，用间接elisa检测，数据表示成平均od450
±
sd。
[0034]
1.10免疫荧光分析 shxx1902使用s蛋白单抗进行检测，随后孵育fitc标记的羊抗鼠二抗，核染色使用dapi。shxx1902感染的vero细胞免疫荧光染色阳性。mock为阴性(图2)。
[0035]
1.11统计学分析 利用统计学软件graphpad prism8.0.1进行统计学分析，实验数据使用one
‑
way anova方法进行分析，用平均值依标准偏差(mean
±
sd)表示。
[0036]
综上所述，pedv shxx1902和cv777株在第一次免疫后(共进行了2次免疫)的第49天诱导了较高且相近的猪流行性腹泻病毒n蛋白特异性抗体应答。因此，本发明的发现将有助于开发新的分离方法和疫苗策略，有望成为改善pedv大流行预防的重要步骤。