一种鱼胶原肽-光敏剂纳米复合物及制备方法与流程

一种鱼胶原肽
‑
光敏剂纳米复合物及制备方法
技术领域
1.本发明涉及一种可用于生物医学成像及抗癌领域的纳米复合物制备方 法，具体为一种鱼皮胶原蛋白肽
‑
光敏剂纳米复合物的制备方法。
技术背景
2.光动力疗法是是由美国食品和药物管理局批准的一种非手术性的治疗 方式[ca.cancer.j.clin.2011,61,250
‑
81]。这种治疗方法是通过产生单线态氧的 方式，经过细胞坏死和凋亡的通路来破坏肿瘤细胞。光动力疗法由于光敏剂对非 特异性组织的最小程度的生物系统的毒性以及用外界光激活的无害性得到了很 大关注。一些pss(如photofrin、chlorin e6、visudyne和foscan)已被证明可 用于临床，但高疏水性、低生物利用度和窄治疗范围限制了其最大疗效[angew. chem.int.ed.engl.2020,59,61
‑
73]。
[0003]
鉴于上述问题，开发了多种纳米制剂以提高光敏剂的生物利用度，然而 增强通透性和滞留效应(epr效应)的纳米粒子(30～200nm)不能穿透肿瘤组 织的深层，而小于20nm的纳米粒子可以穿透肿瘤组织的深层，但可以被人体迅 速清除[biomaterials 2018,156:217
‑
237；adv.drug deliv.rev.2016,97,41
‑
55.]， 这导致纳米制剂在肿瘤微环境(tme)中没有小分子药物的优势[nat.biotechnol. 2015,33,941
‑
951；adv.drug deliv.rev.2018,130,3
‑
11]，因此，如何构建既有利 于在肿瘤部位聚集又能在到达肿瘤部位后变小能够穿透肿瘤组织的纳米结构是 目前的一个技术屏障。
[0004]
在当前以癌症为中心的治疗模式中，癌症无法根除，其复发无法控制， 而癌相关成纤维细胞(cafs)清除有望超越以癌症为中心的治疗方法。[nat.rev. cancer 2020,20,174
‑
186]，并根除恶性肿瘤。癌相关成纤维细胞(cafs)合成和 重构的大量细胞外基质(ecm)使实体瘤(如乳腺癌、黑色素瘤)变硬[cancercell,2020,37,754
‑
755；dev.cell 2019,49,332
‑
346]，caf是非恶性细胞，但通过释 放调节因子和重塑ecm来调节肿瘤细胞和其他间质细胞，在癌症进展和复发中 发挥关键作用[nat.rev.cancer 2020,20,174
‑
186]。胶原蛋白作为ecm的重要组 成部分，可以被tme中的细胞外或膜结合蛋白酶分解成碎片，包括组织蛋白酶 和基质金属蛋白酶，随后，胶原片段特异性地结合到cafs，并被细胞内蛋白酶 内吞和水解成氨基酸，作为cafs中胶原合成的来源[[nat.commun.2017, 8,16031]，抑制cafs中i型胶原的合成可延缓实体瘤的进展[dev.cell 2019,49,332
‑
346]。鱼胶原蛋白肽(fcps)，也称为鱼胶原蛋白水解物或片段，由 主要来自i型胶原蛋白的“gly
‑
x
‑
y”重复单元组成，(x和y主要是脯氨酸和 羟脯氨酸)[molecules 2019,24,4031]。类似于肿瘤中的胶原蛋白片段，oligo
‑
fcps (m.w.<1000da)能够与成纤维细胞膜上的受体结合，并被成纤维细胞重新利用 以支持组织构建[adv.drug deliv.rev.2020,156,133
‑
187.15,16]，天然胶原三肽不 能被降解并有效地分布到体内结缔组织(靶组织)中，主要由胶原及其产生者成 纤维细胞组成，[mater.sci.eng.c.mater.biol.appl.2020,113,110963；biol pharmbull,2016,39,428
‑
34.]在实体瘤中也大量存在[biosci.biotechnol.biochem.2015, 79,2026
‑
33；biopolymers 2008,89,345
‑
53]。与人工胶原模拟肽(cmps)和哺乳 动物胶原肽不
同，fcps具有高度的生物相容性和无污染的生物活性[molecules 2019,24,4031]。
[0005]
利用具有低免疫原性的天然短肽作为靶向肽构建粒径大小可变的纳米粒, 易于穿透肿瘤，靶向多样的肿瘤及其微环境细胞，且制备工艺简单，质量可控， 材料廉价易得，绿色环保，适合大批量生产的纳米光敏剂制备方法是目前研究的 热点。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于
[0007]
本发明的目的是这样实现的：
[0008]
一种鱼胶原肽与光敏剂复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于低分子量 天然鱼胶原蛋白肽与疏水性光敏剂分子内交联形成内部含5～20nm纳米粒的 70～100纳米的纳米复合物。该纳米粒的制备包括以下具体步骤：将光敏剂与交 联剂溶于有机溶剂，光敏剂与1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺(edcl)、 n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)nhs按摩尔比0.1～40(μmol):0.3～10(μmol):0.7～20 (μmol)于15～37℃混合反应10～120分钟制备光敏剂活性酯。将所述光敏剂活 性酯与低分子量鱼胶原肽水溶液，按质量比：0.1～20(mg)：10～200(mg)充分 混合。光敏剂活性酯和鱼胶原蛋白肽室温充分混合后，置4℃反应过夜后，经离 心纯化，得到鱼胶原蛋白肽
‑
光敏剂纳米复合物。
[0009]
本发明所述低分子量鱼胶原肽选自各类海鱼、淡水鱼等的鱼鳞、鱼骨、 鱼皮等富含胶原蛋白部位一种或多种的水解所得到的鱼胶原蛋白肽分子量低于 2000da。
[0010]
本发明所述有机溶剂包括乙醇、二甲基亚砜、丙酮等。
[0011]
本发明所述光敏剂为含羧基的各类疏水性光敏剂包括血卟啉、原卟啉、 二氢卟吩e6，焦脱镁叶绿酸a，维替泊芬等。
[0012]
本发明制备的鱼胶原肽
‑
光敏剂纳米复合物内部均有小于20nm的纳米粒 既可满足高通透性和滞留效应的条件聚集于实体瘤部位，又可通过实体瘤内蛋白 酶降解释放内部纳米粒增加药物穿透力。该纳米复合物内光敏剂吸收峰位大幅度 红移药物对较高穿透力的光吸收效率增加。易于实现高效肿瘤治疗和荧光成像， 具有广泛的应用前景。此方法工艺简单、绿色环保，适合大规模生产。
附图说明
[0013]
图1为制备实例1的鱼胶原蛋白肽
‑
光敏剂纳米复合物透射电子显微镜 (tem)测试图；
[0014]
图2为制备实例1的鱼胶原蛋白肽
‑
光敏剂纳米复合物粒径分布图；
[0015]
图3为制备实例1的鱼胶原蛋白肽
‑
光敏剂纳米复合物的紫外
‑
可见光 (uv
‑
vis)光谱图；
[0016]
图4为应用实例1的鱼胶原蛋白肽
‑
光敏剂纳米复合物的细胞内吞效率；
[0017]
图5为应用实例1的鱼胶原蛋白肽
‑
光敏剂纳米复合物体外抗肿瘤效果。
具体实施方式
[0019]
以下结合实例进一步详细阐述本发明，但实例不是对本发明的限制，本 发明能够在不同实施方式上能够具有各种变化，均不脱离本发明范围。其中发明 及附图当作说明之
用，而非限制本发明。
[0020]
制备实例1本发明的优选实施方式是：
[0021]
称取一定量的二氢卟吩e6、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺和 n
‑
羟基琥珀酰亚胺用二甲基亚砜配成10mg/ml，54mg/ml和58mg/ml，将1ml的 1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺和1ml n
‑
羟基琥珀酰亚胺加入到98ml二 氢卟吩e6溶液，室温搅拌，活化15min，得到二氢卟吩e6活性酯溶液。称取一 定量的鱼胶原蛋白肽(m.w.≤2000da)配成50mg/ml的鱼胶原蛋白肽水溶液。 取10ml二氢卟吩e6活性酯溶液加入到90ml鱼胶原蛋白肽水溶液，充分混合， 置4℃反应过夜。采用离心纯化样品，在13000rpm下离心洗涤3次，每次10min， 得到鱼胶原蛋白肽
‑
二氢卟吩e6纳米复合物溶液。对上述样品进行表征：采用透 射电镜测量了该复合物形貌及粒径。如图(1)所示，该鱼胶原蛋白肽
‑
光敏剂 纳米复合物粒径在70～100nm之间，内含平均粒径10nm的纳米粒。采用动态散 射光测量了鱼胶原蛋白肽
‑
光敏剂纳米复合物的水合粒径。如图(2)所示鱼胶原 蛋白肽
‑
光敏剂纳米复合物平均水合粒径为90nm。通过uv
‑
vis光谱法鉴定了纳 米复合物形成，结果如图(3)该鱼胶原蛋白肽
‑
光敏剂纳米复合物吸收峰出现在 403nm和672nm。
[0022]
制备实例2
[0023]
称取一定量的二氢卟吩e6、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺和 n
‑
羟基琥珀酰亚胺用乙醇配成10mg/ml,54mg/ml和58mg/ml，将1ml的1
‑
乙基
‑3‑ꢀ
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺和1ml n
‑
羟基琥珀酰亚胺加入到98ml二氢卟吩 e6溶液，室温搅拌，活化15min，得到二氢卟吩e6活性酯溶液。称取一定量的 鱼胶原蛋白肽(m.w.≤2000da)配成50mg/ml的鱼胶原蛋白肽水溶液。取10ml 二氢卟吩e6活性酯溶液加入到90ml鱼胶原蛋白肽水溶液，充分混合，置4℃反 应过夜。采用离心纯化样品，在13000rpm下离心洗涤3次，每次10min，得到 鱼胶原蛋白肽
‑
二氢卟吩e6纳米复合物溶液。
[0024]
制备实例3
[0025]
称取一定量的二氢卟吩e6、n
‑
羟基琥珀酰亚胺和1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基 丙基)碳二亚胺用丙酮配成10mg/ml、54mg/ml和58mg/ml，将1ml的1
‑
乙基
‑3‑ꢀ
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺溶液和1ml n
‑
羟基琥珀酰亚胺溶液加入到98mlce6溶液，室温搅拌，活化15min，得到二氢卟吩e6活性酯溶液。称取一定量的 鱼胶原蛋白肽(m.w.≤2000da)配成50mg/ml的鱼胶原蛋白肽水溶液。取10ml 二氢卟吩e6活性酯溶液加入到90ml鱼胶原蛋白肽水溶液，充分混合，置4℃反 应过夜。采用离心纯化样品，在13000rpm下离心，洗涤3次，每次10min，得 到ctp
‑
ce6纳米复合物(cce
‑
ns)溶液。
[0026]
制备实例4
[0027]
将称取一定量的焦脱镁叶绿酸a、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚 胺和n
‑
羟基琥珀酰亚胺用二甲基亚砜配成6mg/ml，45mg/ml,48mg/ml,将1ml 的1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺和1ml n
‑
羟基琥珀酰亚胺加入到98mlppa溶液，活化15～30min，得到焦脱镁叶绿酸a活性酯溶液。称取一定量的鱼 胶原蛋白肽(m.w.≤2000da)配成50mg/ml的鱼胶原蛋白肽水溶液。取10ml 焦脱镁叶绿酸a活性酯溶液加入到90ml鱼胶原蛋白肽水溶液，充分混匀，置4℃ 反应过夜。采用离心纯化样品，在13000rpm下离心，洗涤3次，每次10min， 得到鱼胶原蛋白肽
‑
焦脱镁叶绿酸a纳米复合物溶液。
[0028]
制备实例5
[0029]
将维替泊芬、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺和n
‑
羟基琥珀酰亚 胺分别溶解于二甲基亚砜中配成8mg/ml,45mg/ml,48mg/ml,将1ml的1
‑
乙基
‑3‑ꢀ
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺和1ml n
‑
羟基琥珀酰亚胺加入到98ml vt溶液， 室温搅拌，活化15～30min，得到维替泊芬活性酯溶液。称取一定量的鱼胶原蛋 白肽(m.w.≤2000da)配成50mg/ml的水溶液，取维替泊芬活性酯溶液10ml 加入到90ml鱼胶原蛋白肽水溶液，充分混合后在4℃下，老化过夜。采用离心 纯化样品，在13000rpm下离心，洗涤3次，每次10min，得到鱼胶原蛋白肽
‑ꢀ
维替泊芬纳米复合物溶液。
[0030]
制备实例5
[0031]
称取一定量的原卟啉、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺和n
‑
羟基 琥珀酰亚胺用二甲基亚砜分别配成10mg/ml、45mg/ml和48mg/ml的溶液，将 1ml的1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺和1ml n
‑
羟基琥珀酰亚胺加入到 98ml原卟啉溶液，室温搅拌，活化15～30min，得到原卟啉活性酯溶液。称取 一定量的鱼胶原蛋白肽(m.w.≤2000da)配成50mg/ml的水溶液，取10ml原 卟啉活性酯溶液加入到90ml鱼胶原蛋白肽水溶液，充分混合后，4℃下反应过夜。 采用离心纯化样品，在13000rpm下离心，洗涤3次，每次10min，得到鱼胶原 蛋白肽
‑
维替泊芬纳米复合物溶液。
[0032]
制备实例5
[0033]
将称取一定量的血卟啉、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺和n
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺用乙醇配成10mg/ml、45mg/ml和48mg/ml的溶液。将1ml的 1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺和1ml n
‑
羟基琥珀酰亚胺加入到98ml血 卟啉溶液，室温搅拌,活化30min，得到血卟啉活性酯溶液。称取一定量的鱼胶原 蛋白肽(m.w.≤2000da)配成50mg/ml的水溶液，取10ml血卟啉活性酯溶液加 入到90ml鱼胶原蛋白肽水溶液，置4℃下反应过夜。采用离心纯化样品，在 13000rpm下离心，洗涤3次，每次10min，得到鱼胶原蛋白肽
‑
血卟啉纳米复合 物溶液。
[0034]
应用实例1
[0035]
用共聚焦显微镜(clsm)检测4t1细胞游离二氢卟吩e6(ce6) 和鱼胶原蛋白肽
‑
二氢卟吩e6纳米复合物(cce
‑
ns)的细胞内吞率。简而言之， 将细胞每孔2
×
105个接种到共聚焦培养皿中，37℃过夜。然后，更换新鲜培养 基并加入终浓度为含4μm ce6的游离ce6、和cce
‑
nsc 37℃下与细胞孵育12h 后，用剥离缓冲液(14.6gnacl，500ml ddh2o中2.5mm乳酸)将细胞在冰上酸 剥离1min，去除表面结合的纳米颗粒。4％(wt/vol)的多聚甲醛固定，室温下 用pbs冲洗10min，dapi染色至细胞核。细胞用clsm观察。ce6在633nm激 发，而dapi激发405nm激光。如图(4)所示，在等剂量下，细胞对cce
‑
ns 摄取率远高于游离ce6。
[0036]
应用实例2
[0037]
将小鼠乳腺癌细胞4t1细胞接种于96孔板中每孔10000个细胞过夜贴 壁。以完全培养基处理的细胞作为对照，将不同浓度的游离ce6和cce
‑
ns分别 与在96孔板中的肿瘤细胞孵育，12h后，换液，用300mw
·
cm
‑2的635nm激光 照射30秒后，孵育过夜。对于暗毒性，除去照光步骤其他都操作都相同在用 培养基短暂洗涤后，添加最终浓度为0.5mg/ml的噻唑兰，并在37℃下培养℃ 孵育4小时。然后向每个孔中加入100ul二甲基亚砜。用分光光度计在570nm处 检测吸光度。如图(5)所示，cce
‑
ns在2ug/ml即可达到最大抗癌效果，而游 离药物在10ug/ml仅有40％左右的抑制率。