佛手柑素在预防或治疗骨质疏松和/或骨丢失中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种佛手柑素在预防或治疗骨质疏松和/或骨丢失中的应用。


背景技术：

2.骨质疏松是以骨量减少，骨的微观结构退化为特征，致使骨脆性增加以及易于发生骨折的一种退行性骨骼疾病，是全身代谢性骨病。随着人类平均寿命的提高和人口老龄化的加剧，骨质疏松已成为全球性的公共健康问题，严重影响了老年人，特别是绝经后妇女的健康和生活质量。据估计，全世界有超过9000万人患有骨质疏松症，患者常面临周身疼痛、驼背、身高降低、呼吸功能下降、髋部及其他部位骨折等遭遇，其中以骨折较为常见。防治骨质疏松症已成为我国健康科学研究领域的重要基础问题之一，社会对骨质疏松有效的防治策略的需求也日益增加。
3.骨是一个动态的器官，不断地发生重塑。在骨重塑过程中，成骨细胞介导的骨形成对维持骨内环境稳态发挥重要作用。骨质疏松的发病机制复杂，其中成骨细胞分化能力降低及骨形成的减少是导致骨质疏松症发生的关键因素之一。因此，增强成骨细胞分化能力、促进骨形成是治疗骨质疏松症的潜在策略。
4.目前，现有西药在控制骨质疏松症方面具有较好的疗效，然而其弊端正频频显露，如价格高、治疗靶点单一、毒副作用大等。天然化合物与传统的治疗骨质疏松药物(如双膦酸盐和激素替代治疗)相比具有安全性高、价格低廉等优势。佛手柑素(bergamottin，bm)是来源于多种柑橘类水果中的天然化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种生物活性，其在治疗骨质疏松中的应用尚未见报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种佛手柑素在预防或治疗骨质疏松和/或骨丢失中的应用。
6.本发明采用的技术方案是：
7.一、本发明提供了佛手柑素或其药学上可接受的衍生物在制备用于治疗、预防、缓解骨质疏松和/或骨丢失的药物或药物组合物中的应用。
8.二、本发明提供了佛手柑素或其药学上可接受的衍生物在制备用于缓解骨质疏松和/或骨丢失的保健品中的应用。
9.三、本发明提供了佛手柑素或其药学上可接受的衍生物在制备用于缓解骨质疏松和/或骨丢失的功能食品中的应用。
10.四、本发明提供佛手柑素或其药学上可接受的衍生物在制备成骨细胞分化和/或成骨细胞骨形成激动剂中的应用。
11.本发明提供佛手柑素或其药学上可接受的衍生物在制备成骨细胞相关蛋白表达激动剂中的应用，所述成骨细胞相关蛋白选自wnt3a、lrp6、β
‑
catenin中的至少一种。
12.上述的佛手柑素为佛手柑素单体，其化学结构如下：
[0013][0014]
上述其药学上可接受的衍生物为其药学上可接受的盐或酯或醚或其立体异构体或其前药分子。
[0015]
本发明还提供了一种治疗、预防、缓解骨质疏松和/或骨丢失的试剂、药物、保健品或功能食品，包含佛手柑素或其药学上可接受的衍生物。
[0016]
本发明所述的佛手柑素作用为如下(1)和/或(2)和/或(3)和/或(4)：
[0017]
(1)促进成骨细胞分化；
[0018]
(2)促进成骨细胞标志基因alp，runx2，col
‑
1，ocn的表达；
[0019]
(3)促进成骨细胞相关蛋白wnt3a、lrp6、β
‑
catenin的表达；
[0020]
(4)治疗骨质疏松和/或骨丢失。
[0021]
与现有技术相比，本发明所产生的有益效果是：
[0022]
1、佛手柑素在体外能显著促进成骨细胞分化，并能上调成骨细胞标志基因alp，runx2，col
‑
1，ocn及成骨细胞相关蛋白wnt3a、lrp6、β
‑
catenin的表达。
[0023]
2、佛手柑素能够显著增加骨质疏松模型小鼠的骨密度，恢复骨微结构，增加骨量，可以有效治疗骨质疏松症、预防卵巢切除或雌激素不足引起的骨丢失。
[0024]
3、本发明所述佛手柑素原料来自于食物，是一种疗效显著、成本低廉、毒副作用小的治疗骨质疏松的天然化合物，有潜力开发为治疗骨质疏松和/或骨丢失的试剂、药物、保健品或食品。
[0025]
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
[0026]
图1为本发明实施例1中采用不同浓度佛手柑素处理mc3t3
‑
e1细胞后碱性磷酸酶染色结果示意图；
[0027]
图2为本发明实施例1中采用不同浓度佛手柑素处理mc3t3
‑
e1细胞后茜素红染色结果示意图；
[0028]
图3为本发明实施例1中采用不同浓度佛手柑素处理mc3t3
‑
e1细胞后，采用rt
‑
pcr检测方法对成骨分化标志基因alp，runx2，col
‑
1，ocn进行检测的结果示意图；
[0029]
图4为本发明实施例2中采用不同浓度佛手柑素处理mc3t3
‑
e1细胞后，采用western
‑
blot检测方法对成骨细胞相关蛋白wnt3a、lrp6、β
‑
catenin进行检测的结果示意图；
[0030]
图5为本发明实施例3中小鼠灌服不同剂量佛手柑素后，股骨micro ct扫描图；
[0031]
图6为本发明实施例3中图5的股骨micro ct扫描后的软件定量分析结果示意图；
[0032]
图7为本发明实施例3中小鼠灌服不同剂量佛手柑素后，股骨切片组织学检测结果示意图；
[0033]
图8为本发明实施例4中小鼠灌服不同剂量佛手柑素后，肝肾功能指标检测结果示意图。
具体实施方式
[0034]
本发明的佛手柑素为佛手柑素单体，其化学结构如下：
[0035][0036]
其药学上可接受的衍生物为其药学上可接受的盐或酯或醚或其立体异构体或其前药分子。
[0037]
实施例1：佛手柑素对成骨细胞分化的影响
[0038]
a.小鼠前成骨细胞系mc3t3
‑
e1细胞的培养
[0039]
mc3t3
‑
e1细胞由完全培养基(α
‑
mem溶液，添加10％胎牛血清、10mm l
‑
谷氨酰胺、100μg/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素)培养，细胞放置于37℃，5％co2的培养箱中培养。
[0040]
b.mc3t3
‑
e1细胞的成骨分化诱导
[0041]
mc3t3
‑
e1前成骨细胞在培养至细胞融合度达100％后，对照组细胞使用成骨分化培养基(α
‑
mem溶液，添加10％胎牛血清、10mm l
‑
谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、0.005％维生素c、10mmβ
‑
甘油磷酸钠)进行成骨分化诱导培养，实验组细胞采用添加有不同浓度佛手柑素的成骨分化培养基(α
‑
mem溶液，添加10％胎牛血清、10mm l
‑
谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、0.005％维生素c、10mmβ
‑
甘油磷酸钠、不同终浓度的佛手柑素)，培养基中佛手柑素的终浓度分别为5μm，10μm，20μm，诱导培养过程中每两天换一次液，培养基需现用现配。
[0042]
c.碱性磷酸酶(alp)染色检测方法
[0043]
细胞成骨分化诱导培养48h后，采用碱性磷酸酶染色检测细胞成骨分化水平，具体操作如下：
[0044]
倒掉培养基，使用pbs洗3次，5min/次；加入0.5ml 4％多聚甲醛溶液，室温固定20min；使用pbs洗3次，5min/次；使用bcip/nbt碱性磷酸酶染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)对细胞进行染色，37℃孵育30min；使用去离子水清洗细胞2次，5min/次；常温晾干，使用扫描仪扫描保存。
[0045]
图1为本实施例中采用不同浓度佛手柑素处理mc3t3
‑
e1细胞后碱性磷酸酶染色结果示意图，染色的深度反映成骨细胞的分化水平。不同浓度的佛手柑素(图中bm)处理后，
alp染色强度随佛手柑素浓度的增高而加深，说明佛手柑素可剂量依赖性地增强alp活性，促进成骨细胞分化。
[0046]
d.茜素红染色检测方法
[0047]
细胞成骨分化诱导培养7天后，采用茜素红染色检测细胞成骨分化水平，具体操作如下：
[0048]
倒掉培养基，使用pbs洗3次，5min/次；加入0.5ml 4％多聚甲醛溶液，室温固定20min；使用pbs洗3次，5min/次；使用0.5％的茜素红溶液(ph＝4.2)对细胞进行染色，室温染色30min；使用蒸馏水洗3次，10min/次；常温晾干，使用扫描仪扫描并保存。
[0049]
图2为本实施例中采用不同浓度佛手柑素处理mc3t3
‑
e1细胞后茜素红染色结果示意图，茜素红染色旨在检测成骨细胞分化过程中，沉积在细胞表面的钙化结节形成情况。已钙化的结节能与茜素红螯合形成红色复合物。而未钙化的结节则不会被着色。因此，红色结节的多少即可反映成骨细胞分化过程中沉积的钙的多少，沉积的钙越多，成骨细胞分化程度就越高。采用不同浓度佛手柑素(图中bm)处理细胞后，红色钙化结节数量显著随佛手柑素浓度增高而增多，说明佛手柑素可剂量依赖性地促进成骨细胞分化。
[0050]
e.成骨分化相关基因的rt
‑
pcr检测方法
[0051]
mc3t3
‑
e1前成骨细胞经成骨分化诱导培养48h后，使用trizol法提取总rna并使用微量紫外分光光度计进行浓度检测。使用one step primescript rt reagent kit进行反转录，并使用thermal cycler c
‑
1000荧光定量pcr仪进行rt
‑
pcr检测，每组的样品实验设置三个复孔，所有的加样过程均在冰上进行。
[0052]
表1反转录反应体系
[0053][0054]
反转录程序为：反转录37℃，15min，反转录酶失活85℃，5s。
[0055]
对诱导后的mc3t3
‑
e1成骨细胞中的alp，runx2，col
‑
1，ocn表达水平进行检测。
[0056]
pcr引物序列如表2所示：
[0057]
表2pcr引物序列
[0058][0059]
图3为本实施例中采用不同浓度佛手柑素处理mc3t3
‑
e1细胞后，采用rt
‑
pcr检测方法对成骨分化标志基因alp，runx2，col
‑
1，ocn进行检测的结果示意图。不同浓度的佛手柑素处理后，mc3t3
‑
e1细胞中成骨分化标志基因alp，runx2，col
‑
1，ocn表达水平相比对照组显著升高(*：p<0.05；**:p<0.01；***:p<0.001)。进一步说明佛手柑素促进成骨细胞分化。
[0060]
实施例2：佛手柑素对成骨细胞相关蛋白表达的影响
[0061]
mc3t3
‑
e1前成骨细胞经成骨分化诱导培养48h后，经含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀(ripa)裂解缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司)裂解细胞并提取细胞总蛋白，采用bca法测定蛋白浓度。通过免疫沉淀法(western
‑
blot)检测蛋白表达情况。
[0062]
图4为本实施例中采用不同浓度佛手柑素处理mc3t3
‑
e1细胞后，采用western
‑
blot检测方法对成骨细胞相关蛋白wnt3a、lrp6、β
‑
catenin进行检测的结果示意图。相比对照组，不同浓度的佛手柑素处理后，mc3t3
‑
e1细胞中成骨细胞相关蛋白wnt3a、lrp6、β
‑
catenin的表达均剂量依赖性地显著上调。wnt3a、lrp6、β
‑
catenin的表达与成骨细胞分化正相关。进一步说明佛手柑素作为wnt3a、lrp6、β
‑
catenin的激动剂，促进成骨细胞分化。
[0063]
实施例3：佛手柑素对骨质疏松小鼠的治疗效果
[0064]
a.小鼠绝经后骨质疏松模型构建及佛手柑素治疗
[0065]
将8周龄的c57bl/6雌性小鼠随机分为4组，6只/组：假手术组(sham)、卵巢摘除术组(ovx)、卵巢摘除术后佛手柑素低剂量治疗组(ovx+bm l，15mg/kg)、卵巢摘除术后佛手柑素高剂量治疗组(ovx+bm h，30mg/kg)。以戊巴比妥钠麻醉小鼠后，进行卵巢切除术(假手术组切除与卵巢等体积的脂肪组织)。手术恢复一周后，高低剂量的佛手柑素以灌胃的方式给予小鼠，每日一次，持续给药8周，检测佛手柑素对骨质疏松小鼠的治疗效果。b.小鼠股骨形态学显微ct检测
[0066]
脱颈处死小鼠，剥离取出股骨，去除骨表面的软组织，用4％多聚甲醛固定后，采用micro ct扫描仪进行扫描，重构后用专用骨骼ct分析软件分析以下参数：骨密度(bmd)，骨体积分数(bv/tv％)，骨小梁厚度(tb.th)，骨小梁数量(tb.n)，骨小梁分离度(tb.sp)等。
[0067]
图5为本实施例中小鼠灌服不同剂量佛手柑素后，股骨micro ct扫描图，图6为股骨micro ct扫描后的软件定量分析结果示意图。与sham组小鼠相比，ovx组小鼠的骨密度，骨体积分数，骨小梁厚度，骨小梁数量均显著降低，骨小梁分离度显著增加；而灌服佛手柑素后，小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量和骨小梁分离度均有显著的恢复(*:p<0.05；**:p<0.01；***:p<0.001)，说明佛手柑素治疗可以增加小鼠的股骨骨密度并改善骨微结构，佛手柑素可以被用于治疗卵巢切除术所致的骨质疏松。
[0068]
c.小鼠股骨组织学病理检测
[0069]
脱颈处死小鼠，剥离取出股骨，4％多聚甲醛固定后，采用edta溶液脱钙28天并制备成石蜡切片，进行h&e染色，显微镜下观察骨组织形态变化。
[0070]
图7为本实施例中小鼠灌服不同剂量佛手柑素后，股骨切片组织学检测结果示意图。股骨切片结果显示，与sham组小鼠比较，ovx组小鼠骨小梁数目明显减少，稀疏断裂，大部分不能连接成网状，骨小梁结构出现较大的空白区域，且可见大量脂肪细胞。而经佛手柑素(图中bm)治疗后，股骨骨小梁厚度显著增加，数目显著增多，骨小梁断裂与脂肪细胞少见。
[0071]
实施例4：佛手柑素对小鼠肝肾毒性的检测
[0072]
心脏穿刺抽取上述小鼠血液，离心分离血清，检测血清中谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、γ
‑
谷氨酰转肽酶(γ
‑
gt)和尿素氮(bun)水平。
[0073]
图8为本实施例中小鼠灌服不同剂量佛手柑素后，肝肾功能指标检测结果示意图。与sham组相比，经佛手柑素治疗后，小鼠肝肾功能指标alt、ast、r
‑
gt和bun水平均无明显变化。说明小鼠连续较长时间(8周)应用佛手柑素治疗未呈现出显著的肝肾毒性，佛手柑素应用于治疗骨质疏松的安全性较佳。
[0074]
综上所述，佛手柑素疗效显著、成本低廉且对肝肾毒副作用低，可应用于骨质疏松症和/或骨丢失的治疗。本发明体外实验证明佛手柑素能促进成骨细胞分化，并能上调成骨细胞特异性基因alp，runx2，col
‑
1，ocn及成骨细胞相关蛋白wnt3a、lrp6、β
‑
catenin的表达。另外本发明体内动物实验证明了佛手柑素显著增加绝经后骨质疏松模型动物的骨密度，恢复骨微结构，增加骨量，可以有效治疗骨质疏松症、预防卵巢切除或雌激素不足引起的骨丢失，有潜力开发为治疗骨质疏松的试剂、药物、保健品或功能食品。
[0075]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。