一种具有益生元功能的党参果聚糖的应用

1.本发明涉及中药多糖成分的应用技术领域，具体为一种具有益生元功能的党参果聚糖的应用，应用于药品、保健品、功能食品及饲料添加剂领域中。


背景技术：

2.党参（codonopsis radix）为临床中应用非常广泛的补益类中药，具有补中益气、健脾益肺的功效，临床上主要用于脾肺虚弱、气短心悸、食少便溏、虚喘咳嗽等症。党参含有多种化学成分，其中多糖是其重要生物活性物质之一。


技术实现要素：

3.本发明主要目的是通过人粪便菌群体外培养实验阐明一种党参均一果聚糖的益生元功能及其应用。
4.本发明是采用如下技术方案实现的：一种具有益生元功能的党参果聚糖的应用，其中党参果聚糖的结构通式如下：该党参果聚糖主链为β
‑
d
‑
呋喃果糖基
‑
（2
→
1）
‑
连接、侧链为α
‑
d
‑
呋喃果糖基
‑
（2
→
3）连接而成，分子量约为1.7
×
103kda。
5.本发明对该党参果聚糖的益生元功能检测的实验步骤如下：（1）500ml烧杯，加入150~180ml基础培养基，高压灭菌后放入厌氧工作站内；次日，分别采集三名健康年轻受试者新鲜的粪便10~20g，分装后
‑
80℃厌氧保存（最好新鲜），50ml离心管内加无菌过滤袋，加入粪便后按照0.1~0.5g/ml的比例无菌pbs稀释，加入陶瓷珠均质混匀后，取出过滤；（2）分正常组、菊粉型果聚糖25mg/ml、菊粉型果聚糖50mg/ml、党参果聚糖25mg/ml、党参果聚糖50mg/ml，且设5个平行实验；（3）加入20~30ml粪便混悬液，在厌氧工作站体外发酵；
（4）24h后取5ml混悬液，离心，沉淀加入2ml灭菌后甘油pbs（1:1），
‑
80℃或
‑
20℃保存，提取dna做16s二代测序；（5）另取5ml混悬液，离心，取上清测定ph值。
6.人粪便菌群体外培养实验表明：所述党参果聚糖具有显著促进prevotella、faecalibacterium、phascolarctobacterium、acidaminococcus、bifidobacterium等益生菌的生长作用。
7.进一步优选的，所述党参果聚糖的培养浓度在25mg/ml~50mg/ml。
8.进一步优选的，所述党参果聚糖在25mg/ml培养浓度下均具有显著促进phascolarctobacterium和faecalibacterium益生菌的生长作用。
9.进一步优选的，所述党参果聚糖在50mg/ml培养浓度下均具有显著促进phascolarctobacterium益生菌的生长作用。
10.phascolarctobacterium属细菌在溃疡性结肠炎患者肠道菌群中丰度明显降低，那么通过益生元的摄入增加溃疡性结肠炎患者肠道中phascolarctobacterium属细菌丰度，可以某种程度上改善溃疡性结肠炎患者症状。因此，本发明在溃疡性结肠炎的治疗中具有一定应用价值。进一步优选的，所述党参果聚糖在治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
11.进一步优选的，所述党参果聚糖具有促进prevotella、faecalibacterium和parabacteroides细菌产生短链脂肪酸的作用。短链脂肪酸为乙酸、丙酸、丁酸或者乳酸。
12.该党参果聚糖通过肠道菌群发酵产生短链脂肪酸，而短链脂肪酸是一种重要生理信号分子，对包括肥胖、糖尿病在内的多种代谢疾病和神经退行性疾病具有一定的治疗作用，因此，本发明在相关代谢性疾病和神经退行性疾病的治疗中具有一定应用价值。进一步优选的，所述党参果聚糖在治疗代谢疾病和神经退行性疾病的药物中的应用。
13.进一步优选的，所述党参果聚糖在制备保健品、功能食品及饲料添加剂中的应用。
14.phascolarctobacterium属细菌对人体的有益功能还没有完全被认识，随着微生物技术和肠道菌群研究的不断深入，phascolarctobacterium属细菌的有益功能将不断被阐明，因此，本发明还具有潜在的不可预料的价值。
附图说明
15.图1表示菊粉和果聚糖对培养体系ph值的影响。
16.图2表示果聚糖25mg/ml浓度下与对照组的lefse比较结果。
17.图3表示果聚糖50mg/ml浓度下与对照组的lefse比较结果。
18.图4表示果聚糖与菊粉25mg/ml浓度下的lefse比较结果。
19.图5表示果聚糖与菊粉50mg/ml浓度下的lefse比较结果。
具体实施方式
20.下面对本发明的具体实施例进行详细说明。
21.1、本发明中党参果聚糖的制备过程如下：党参用10~20倍蒸馏水浸泡30分钟，然后加热回流提取2~3次，每次1.5~2小时，合并提取液，减压浓缩至1/6~1/3体积，60%~80%乙醇沉淀。取沉淀加入10~20倍蒸馏水溶解、离心，上清液采用10万级和5万级超滤膜进行膜分离，获得党参果聚糖。通过核磁共振谱鉴定
其结构。
22.该党参果聚糖主链为β
‑
d
‑
呋喃果糖基
‑
（2
→
1）
‑
连接、侧链为α
‑
d
‑
呋喃果糖基
‑
（2
→
3）连接而成，分子量约为1.7
×
103kda。
23.2、本发明对该果聚糖的益生元功能检测的实验步骤如下：（1）500ml烧杯，加入150~180ml基础培养基，高压灭菌后放入厌氧工作站内；次日，分别采集三名健康年轻受试者新鲜的粪便10~20g，分装后
‑
80℃厌氧保存（最好新鲜），50ml离心管内加无菌过滤袋，加入粪便后按照0.1~0.5g/ml的比例无菌pbs稀释，加入陶瓷珠均质混匀后，取出过滤；（2）分正常组、菊粉型果聚糖25mg/ml、菊粉型果聚糖50mg/ml、党参果聚糖25mg/ml、党参果聚糖50mg/ml，且设5个平行实验；（3）加入20~30ml粪便混悬液，在厌氧工作站体外发酵；（4）24h后取5ml混悬液，离心，沉淀加入2ml灭菌后甘油pbs（1:1），
‑
80℃或
‑
20℃保存，提取dna做16s二代测序；
①
样本dna的提取与测序：实验组样本10000rpm、10分钟，离心后去掉上清，留沉淀物进行样本dna的提取。
24.采用ctab方法对样本的基因组dna进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测dna的纯度和浓度，取适量的样本dna于离心管中，使用无菌水稀释样本至1ng/μl。以稀释后的基因组dna为模板，根据测序区域的选择，使用带barcode的特异引物，new england biolabs公司的phusion
®ꢀ
high
‑
fidelity pcr master mix with gc buffer，和高效高保真酶进行pcr，确保扩增效率和准确性。pcr产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据pcr产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。使用truseq
®ꢀ
dna pcr
‑
free sample preparation kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过qubit和q
‑
pcr定量，文库合格后，使用novaseq6000进行上机测序。根据barcode序列和pcr扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去barcode和引物序列后得到初始的双端测序数据。
25.②
微生物的鉴定：先用fastp（v0.19.7）对初始fastq数据进行过滤处理，然后运行qiime2（v2019.7）分析流程。在qiime2中，借助dada2对序列进行去噪、去嵌合体处理，得到扩增序列变体（asvs）。用基于silva_138.1 16s rrna训练的朴素贝叶斯分类器对asvs进行注释，获取分类学信息。调用phylogeny插件，用mafft对asvs进行多序列比对，然后通过fasttree获得asvs的系统发生关系。最后对各样本的数据进行均一化处理，以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的物种相对丰度是基于均一化处理后的数据。
26.③
统计分析方法：主要用r软件（http://www.r
‑
project.org/）对上述数据进行统计分析及绘图。两组之间的差异检验用的是wilcoxon 秩和检验，多组间的差异检验用的是kruskal
‑
wallis秩和检验。用多元方差分析adonis评估分组对样本差异的解释度，并使用置换检验permutation对其统计学意义进行显著性分析。
27.（5）另取5ml混悬液，10000rpm离心10分钟，取上清测定ph值。
28.图1结果表明菊粉和该党参果聚糖分别在25mg/ml和50mg/ml浓度下均以剂量依赖关系显著降低培养体系ph值（p<0.001），表明菊粉和该果聚糖使体系ph值下降，说明可以促进产短链脂肪酸菌产生了短链脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等），而短链脂肪酸是益生元
产生重要生物学功能的重要信号分子。
29.图2结果表示该党参果聚糖在25 mg/ml的培养浓度下具有显著促进faecalibacterium、parabacteroides、phascolarctobacterium （lda>4）、acidaminococcus、bifidobacterium（lda>2）等多种益生菌的生长作用，说明faecalibacterium、parabacteroides、phascolarctobacterium、acidaminococcus、bifidobacterium等益生菌可以发酵该果聚糖而进行生长。
30.图3结果表示该党参果聚糖在50mg/ml的培养浓度下具有显著促进prevotella、faecalibacterium、phascolarctobacterium、acidaminococcus（lda>4）、bifidobacterium（lda>2）等多种益生菌的生长作用，说明prevotella、faecalibacterium、phascolarctobacterium、acidaminococcus、bifidobacterium等益生菌可以发酵该果聚糖而进行生长。
31.图4结果表明与相同浓度（25mg/ml）菊粉比较，该党参果聚糖具有显著促进phascolarctobacterium、faecalibacterium（lda>4）等益生菌生长的作用，说明phascolarctobacterium和faecalibacterium在25mg/ml浓度发酵下对该党参果聚糖敏感，而对菊粉不敏感，可以发酵该党参果聚糖，而不能发酵菊粉。
32.图5结果表明与相同浓度（50mg/ml）菊粉比较，该党参果聚糖具有显著促进phascolarctobacterium（lda>3.5）等益生菌生长的作用，说明phascolarctobacterium在50mg/ml浓度发酵下对该党参果聚糖敏感，而对菊粉不敏感，可以发酵该党参果聚糖，而不能发酵菊粉。
33.本发明所述党参果聚糖为从党参药材中分离获得，在人粪便菌群体外培养实验中具有显著促进prevotella、faecalibacterium、phascolarctobacterium、acidaminococcus（lda>4）、bifidobacterium（lda>2）等多种益生菌的生长作用，且能够降低培养体系的ph值（p<0.05），即具有产生短链脂肪酸的作用。与菊粉型果聚糖比较，在25mg/ml和50mg/ml两个培养浓度下均具有显著促进phascolarctobacterium属细菌生长作用（lda>4）。目前有关该党参果聚糖的益生元功能未见报道。
34.最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖权利要求保护范围中。