1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种植物提取物制备方法。
背景技术：
2.玫瑰是蔷薇目、蔷薇科、蔷薇属的落叶灌木。枝杆多针刺，奇数羽状复叶，小叶5
‑
9片，椭圆形，有边刺。花瓣倒卵形，重瓣至半重瓣，花有紫红色、白色，果期8
‑
9月，扁球形。玫瑰是所有花卉中最著名和最受欢迎的一种，除了有着芳香气息之外，还具有确切的护肤功效，因此玫瑰提取物在护肤品中应用非常广泛。
3.玫瑰护肤是利用玫瑰进行皮肤保养的一种方式，含有玫瑰成分的美容产品，依靠玫瑰香气达到舒缓、放松、愉悦等作用，同时，玫瑰花中含有300多种化学成份，如芳香的醇、醛、脂肪酸、酚和含香精的油和脂，对皮肤具有滋养、抗衰老等功效。然而，近年来应用表明，天然玫瑰提取物的功效性仍有待提高。
技术实现要素：
4.本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种植物提取物制备方法，以解决常规玫瑰提取物的护肤功效有待提高的技术问题。
5.为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
6.一种植物提取物制备方法，包括以下步骤：
7.利用鲜花乳杆菌对玫瑰花进行发酵，对所得的发酵液进行浓缩，而后二次发酵、纯化，得到鲜花素精提液，经冷冻干燥后得到活细胞素；
8.第一天：预先接种10μl原种于3
‑
4ml lb试管中，37℃震荡培养过夜；8:00am取复苏的原种，转接到50lb，37℃放大培养；2:00pm将放大培养的菌种分别按1ml一瓶接种到6
×
120ml lb的500ml三角瓶，30
‑
32℃培养到对数期，事先将水浴摇床温度调整到42℃，将培养到对数期细菌放置在42℃水浴摇床，振荡培养诱导18小时；
9.第二天：8:00am收集发酵液，离心收集细菌沉淀，并合并在一个离心管中；离心前留取1ml菌液4℃放置备用；用50mlpb悬菌，冰浴超声破碎，离心收集包涵体沉淀；1m nacl洗包涵体1次，pb洗1次，每次洗涤包含体时要充分吹打，形成均一悬液，离心收集包涵体沉淀；40ml h7.4pbp悬起包涵体，并添加1％的巯基乙醇，逐渐添加尿素粉末，边加边搅，直到澄清，离心，取上清用于进一步的蛋白纯化，保留1ml溶解的包涵体4℃保存备用；准备镍柱，装柱8ml
‑
10ml镍柱，上样，根据样品中的目的蛋白含量上样，本实验全部上柱；上样后流出的为非特异性洗脱的穿过峰约60ml；用20mm咪唑6m尿的pb洗40ml体积，为20mm咪唑浓度特异性洗脱组分约40ml；不同浓度特异性洗脱，每个浓度咪唑至少洗5个柱体积；电泳检测，各组分4℃保存，电泳检测后确定目的蛋白组分，进行透析；将所有样品组分进行sds
‑
page电泳检测，12％分离胶，4％浓缩胶，14v预电泳5min，160v电泳，约45
‑
60min，结束，染色过夜，第二天脱色看结果；
10.第三天：根据电泳结果，对目的蛋白组分进行透析和复性，每4小时换次透析液；继
续透析，透析过夜；
11.第四天：测定蛋白浓度，用pb和甘油调整到1mg/ml；分装成液体或将液体冷冻干燥。
12.其中，第一天所述的37℃放大培养，其接种量1:100，放大体积至少是发酵体积的1％。
13.第一天所述的500ml三角瓶，其装液量为120ml。
14.第二天所述的冰浴超声破碎，处理条件为：15s超声，30s停止，超声40min。
15.第四天对蛋白浓度的测定是利用紫外法实现的。
16.本发明提供了一种植物提取物制备方法。该技术方案根据目标成分的物性特点设计了全新的工艺流程。具体来看，本发明首先采用两次发酵的方法制备植物活细胞素，二次发酵促进有效成分转化，同时以添加了植物活细胞素的蛋白胨发酵液强化工程菌发酵。本发明使目的蛋白得到有效纯化和充分富集，通过发酵方法使玫瑰成分的护肤功效得到显著提升，而且，本发明工艺合理，收率较高，适合规模化生产，具有突出的技术优势。
具体实施方式
17.以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
18.一种植物提取物制备方法，包括以下步骤：
19.第一阶段：植物活性成分提取
20.玫瑰花利用鲜花乳杆菌发酵，得到鲜花发酵液，再浓缩，得到鲜花浓缩液，进行二次发酵，纯化，得到鲜花素精提液，冷冻干燥，得到植物活细胞素。
21.第二阶段：二次发酵促进有效成分转化(附表)以600毫升添加了植物活细胞素的蛋白胨发酵液强化工程菌发酵：
22.第一天am：
23.1、(预先接种10ul原种于3
‑
4mllb试管中，37℃震荡培养过夜)。
24.2、8:00am取复苏的原种，转接到50lb(amp+)37℃放大培养(接种量1:100；放大体积至少是发酵体积的1％的体积或更大些)。
25.其中，提前1天配置并灭菌好lb(1l：蛋白胨10g，酵母抽提物5g，nacl5g，分装灭菌，约120mllb/500ml三角瓶和1瓶50ml/250ml三角瓶。
26.氨苄西林钠(或氨苄青霉素)保存液100mg/ml，工作液终浓度50ug/ml(用灭菌蒸馏水配制)。
27.注：提前复苏菌种和准备好少量1lb培养基，可以节省1天时间。一旦进入常规生产，就不用预先准备了。
28.第一天pm：
29.3、2:00pm将放大培养的菌种分别按1ml一瓶接种到6x120mllb(amp+)的500ml三角瓶(每瓶120ml左右的lb)，30
‑
32℃培养到对数期(约2
‑
3小时左右)，事先将水浴摇床温度调
整到42℃，将培养到对数期细菌放置在42℃水浴摇床，振荡培养(150rmp)诱导过夜，约18小时左右。
30.配制破碎细胞和蛋白纯化用试剂：
31.pb缓冲液(20mm ph7.4)，配制0.2mna2hpo4和0.2mnah2po4用时按照81.00ml+19.00ml混合后稀释10倍使用。
32.200ml 1mnacl(可用蒸馏水配制)。
33.6m尿的pb(pb配制200
‑
300ml)。
34.用6m尿的pb配制500mm浓度的咪唑200ml，用时用6m尿的pb缓冲液稀释到需要的浓度使用。
35.注：转速一般在200rmp左右。诱导时的水浴摇床在150rpm以上。
36.第二天am：
37.4、8:00am收集发酵液，离心(4℃，5000rmp，10min)收集细菌沉淀，并合并在一个离心管中。离心前留取1ml菌液4℃放置备用。
38.5、用约50mlpb悬菌，冰浴超声破碎(15s超声，30s停止，超声40min)，离心(4℃，12000rmp，20min)收集包涵体沉淀。
39.6、1mnacl洗包涵体1次，pb洗1次，每次洗涤包含体时要充分吹打，形成均一悬液，离心(4℃，12000rmp，20min)收集包涵体沉淀。加入适量的pb可放置
‑
20℃可长期保存。
40.7、适量40mlh7.4pbp悬起包涵体，并添加1％的巯基乙醇，逐渐添加尿素粉末，边加边搅，直到澄清(约放大三份之一体积至60ml)，离心(25℃，12000rmp，20min)，取上清用于进一步的蛋白纯化。保留1ml溶解的包涵体4℃保存备用。
41.其中：500ml4m尿pb透析液(pb中加尿素)；500ml2m尿pb透析液(pb中加尿素)。
42.注：冰浴超声条件，15s超声，30s停止，40个循环或40min。
43.第二天pm：
44.8、准备镍柱。装柱8ml
‑
10ml镍柱，注意不要出现上表面没有液体状态，(dw洗200ml体积，bp洗100ml，含20mm咪唑6m尿的pb洗50ml)
45.9、上样(因结合量不同而定，一般进口100mg/ml镍柱，可以将60ml包含体溶解上清全部上样)。根据样品中的目的蛋白含量上样，本实验全部上柱(60ml包涵体溶液)
46.10、上样后流出的为非特异性洗脱的穿过峰约60ml。
47.11、用20mm咪唑6m尿的pb洗40ml体积，为20mm咪唑浓度特异性洗脱组分约40ml。
48.12、不同浓度特异性洗脱，每个浓度咪唑至少洗5个柱体积(100mm、250mm、500mm咪唑pb洗)。本实验主要在100mm咪唑pb洗出目的蛋白组分，可直接用60ml 100mm咪唑洗量，其余用500mm咪唑洗40ml体积。电泳检测，基本在100mm组分中。有时20mm也有少量，其他组分没有。各组分4℃保存。电泳检测后确定目的蛋白组分。有蛋白的组分可最后合并，进行透析。
49.13、将所有样品组分进行sds
‑
page电泳检测。12％分离胶，4％浓缩胶，14v预电泳5min，160v电泳，约45
‑
60min，结束，染色过夜，第二天脱色看结果。
50.其中，sds
‑
page电泳要包括以下样品：标准蛋白、诱导全菌、未诱导菌、破碎上清、包涵体沉淀、穿过峰、20mm特洗组分、100mm特洗、500mm特洗组分。已纯化对照蛋白。(10个样)
51.第三天am：
52.14、根据电泳结果，对目的蛋白组分进行透析和复性(4m，2m尿pb透析，可加入可添加1％巯基乙醇或dtt)，每4小时换次透析液(可以直接用用过的2m尿pb透析，再用新配2m尿pb透析)，不适用4m尿pb也可。
53.注：透析袋室温或4度透析，用磁力搅拌搅拌。
54.第三天pm：
55.15、继续透析。4m透1
‑
2次室温或4度。
56.16、透析过夜。2m尿透3次。
57.第四天am：
58.17、测定蛋白浓度(紫外法)，用pb和甘油调整到1mg/ml，调整浓度时根据最后产品形式可添加保护剂10％的甘油。
59.其中，用2mph 7.4调零。
60.注：蛋白浓度mg/ml＝1.45*a280
‑
0.74*a260。
61.第四天pm：
62.18、分装成液体或将液体冷冻干燥。暂时保存可放4℃。
63.在以上技术方案中：
64.(1)如果有复壮的菌种，可以省去过夜复壮，直接放大培养3
‑
4小时，接种到发酵培养基上37℃培养3小时，直接42℃诱导表达培养过夜(一般12
‑
16小时)。
65.(2)6m尿的缓冲液4℃不会结晶。
66.(3)6m尿的样品sds
‑
page不会影响电泳效果。
67.(4)透析时透析袋要加入蒸馏水煮沸使用，反复使用的透析袋一定要检查是否漏液，如有漏液现象放弃，换新的透析袋。
68.(5)层析镍柱使用后，要用6m尿洗80ml体积，放置。如长期不用要把镍柱填料取出，在小烧杯内先用pb洗三次，再用蒸馏水反复
69.清洗，最后泡在20％的乙醇溶液中，4度放置。
70.以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。