玛咖外泌体的提取方法及由其提取的玛咖外泌体和应用

1.本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及一种玛咖外泌体的提取方法及由其提取的玛咖外泌体和应用。
背景技术：
：：2.抑郁症是一种常见的心理疾病，也是一类以情绪低落、兴趣丧失、悲观、消极、缺乏主观能动性、自责或者自罪等为主要临床表现的一种精神疾病，严重者可能出现自杀等偏激行为。在我国，目前已经确诊的抑郁症患者为3000万人左右，发病率高达达到6％，wto组织预测，近几年抑郁症将成为继高血压之后的第二大临床慢性疾病。传统的抗抑郁药物虽然有一定的疗效，但由于大多起效速度慢、药效强度弱、作用持续时间短的弊端。目前仅一半患者对抗抑郁药有较好反应，超过半数的抑郁症患者病情无法得到完全缓解。因此，积极寻求有效的抗抑郁药物及探究作用机制具有重要的意义。3.慢性、不能解决的应激是临床上抑郁症发展的主要危险因素。在此基础上，willner等于1987年提出了“慢性温和性不可预知的应激模型”(chronicunpredictablemildstress，cums)，其中应激刺激的多变性和不可预测性是模型制造成功的关键。cums后，在啮齿类动物中呈现与临床抑郁相关的行为症状，如快感缺乏、梳理行为改变、获得性无助，以及其他重型抑郁障碍的症状表现，如运动能力、社会交往能力下降、侵犯攻击能力缺陷等。通常，cums引发的行为异常可保持几个月，而这些诱导所产生的抑郁样症状可被慢性而非急性治疗所改善，如传统的5羟色胺再摄取抑制剂ssris。此模型可以模拟抑郁症发生的环境诱因，致使动物的行为特征改变、血浆皮质激素升高等均与内源性抑郁症状相似，且经典的抗抑郁治疗对之有效，故作为抑郁模型具有较高的价值，是目前广泛使用的抑郁模型之一。4.玛咖（lepidiummeyenii，maca）是一种南美十字花科的药食两用植物，原产于秘鲁安第斯山脉4000～4500米海拔处，又名“秘鲁人参”。玛咖具有丰富的成分，主要包括：初生代谢产物和次生代谢产物，初生代谢产物主要有多糖、蛋白质、氨基酸等营养成分；次生代谢产物包括玛咖酰胺、芥子油苷、异硫氰酸苄酯、咔啉生物碱、吡啶生物碱、咪唑生物碱、玛咖烯等，次生代谢产物是玛咖药效作用的主要化学物质。玛咖具有多种活性功能，包括降血脂、抗疲劳、抗肿瘤等，然而玛咖外泌体在抗抑郁方面的研究鲜有报道。外泌体是指细胞分泌的包含了复杂微小rna（mirna）和蛋白质的小膜泡(30-150nm)。许多植物中发现含蛋白质和mirna的外泌体样纳米粒子，这些植物外泌体由于缺乏毒性，有大规模生产的可能性，其内在特性具有携带药物或mirna分子等其他化合物的可能性。植物外泌体的直径约40～150nm，具有磷脂双分子层结构，呈茶托状或杯状，由大量脂质、包括mirna和蛋白质组成。研究表明，植物外泌体具有抗炎、抗病毒、抗纤维化、抗肿瘤等作用，还能参与病原体侵袭的防御反应。然而，目前还未见有利用植物外泌体，尤其是玛咖外泌体来预防抑郁或治疗抑郁的报道。技术实现要素：5.为了解决现有抗抑郁药物普遍存在起效慢、药效弱、作用时间短的弊端，本发明提供一种玛咖外泌体的提取方法及由其提取的玛咖外泌体和应用。6.为了达到上述目的，本发明技术方案如下：一种玛咖外泌体的提取方法，包括以下步骤：s1、取一定数量的玛咖鲜果，去除根须，先用自来水冲洗干净，再用去离子水洗三次，每次1-3min；最后用超纯水洗三次，每次1-3min；s2、将洗净的玛咖鲜果切成块状，榨汁机混合粉碎，连续榨三次后，过滤，取汁液，连续离心，1000g，10min；3000g，20min；10000g，40min；差速离心后取上清液，弃沉淀，将上清液继续进行超高速离心，于150000g下超高速离心120min后，取沉淀，悬浮于冰pbs溶液中，得沉淀悬液；s3、在离心管中依梯度加好蔗糖溶液，在最上层加入步骤s2所得沉淀悬液，然后于150000g下超高速离心120min；s4、离心结束后分别收集各分层到清洗后的离心管中，加入冰pbs溶液后混合均匀，然后于150000g下超高速离心90min，去蔗糖；s5、取沉淀分装，用1-3mlpbs重悬沉淀后，用0.22um滤膜过滤，过滤后分装，-80℃保存。7.进一步的，步骤s3中蔗糖浓度梯度为：8%、30%、45%、60%。8.进一步的，步骤s3中离心管采用用3mlpbs，能够保证沉淀悬液的浓度蔗糖梯度纯化。9.本发明还提供由上述提取方法获得的玛咖外泌体。10.进一步的，所述玛咖外泌体的纯度从50.1%提高到100%，得率提高近6倍。11.本发明还提供由上述提取方法获得的玛咖外泌体在制备预防抑郁、抗抑郁药物中的应用。12.有益效果：（1）本发明的提取方法利用蔗糖梯度纯化，能够大大提高玛咖外泌体的纯度与得率，纯度从50.1%提高到100%。得率提高提高近6倍；（2）本发明获得的玛咖外泌体在制备预防抑郁、治疗抑郁药物中的应用，通过慢性温和不可预知应激模型来建立小鼠抑郁模型，再将提取到的玛咖外泌体通过尾静脉注射的方式注入进抑郁小鼠体内，通过观察小鼠与氟西汀组阳性对照药和生理盐水阴性对照组的行为学特征差异从而判断出玛咖外泌体的具有抗抑郁作用。正常组加药后，有明显改善行为学的效果，说明具有预防抑郁的作用。附图说明13.图1证明蔗糖梯度离心提高外泌体的纯度与得率的结果图：图2-5证明ucms抑郁模型的成功建立：图2为通过糖水偏好评价ucms模型的结果对比图；图3为通过强迫游泳评价ucms模型的结果对比图；图4为通过悬尾实验评价ucms模型的结果对比图；图5为通过新奇抑制喂食实验评价ucms模型的结果对比图；图6-11证明玛咖外泌体的预防抑郁及抗抑郁效果：图6为玛咖外泌体在小鼠强迫游泳实验的结果对比图；图7为玛咖外泌体在小鼠悬尾实验的结果对比图；图8为玛咖外泌体在小鼠新奇抑制喂食实验的结果对比图；图9为玛卡外泌体影响ucms模型小鼠5-羟色胺(5-ht)水平研究结果图；图10为玛卡外泌体影响ucms模型小鼠去甲肾上腺素(ne)水平研究结果图；图11为玛卡外泌体影响ucms模型小鼠多巴胺(da)水平研究结果图；图12为参数设置图。具体实施方式14.以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。15.本发明实施例中未特别指明的组分均为市购产品，所用设备或仪器均是常规的。16.实施例1：玛咖外泌体以其提取方法一种玛咖外泌体的提取方法，包括以下步骤：s1、取1kg的玛咖鲜果，去除根须，先用自来水冲洗干净，再用去离子水洗三次，每次1-3min；最后用超纯水洗三次，每次1-3min；s2、将洗净的玛咖鲜果切成块状，榨汁机混合粉碎，连续榨三次后，过滤，取汁液，连续离心，1000g，10min；3000g，20min；10000g，40min；差速离心后取上清液，弃沉淀，将上清液继续进行超高速离心，于150000g下超高速离心120min后，取沉淀，悬浮于冰pbs溶液中，得沉淀悬液；s3、在离心管中依蔗糖浓度梯度为：8%、30%、45%、60%加好蔗糖溶液，在最上层加入步骤s2所得沉淀悬液，然后于150000g下超高速离心120min；同时离心管采用用3mlpbs，能够保证沉淀悬液的浓度蔗糖梯度纯化；s4、离心结束后分别收集各分层到清洗后的离心管中，加入冰pbs溶液后混合均匀，然后于150000g下超高速离心90min，去蔗糖；s5、取沉淀分装，用1-3mlpbs重悬沉淀后，用0.22um滤膜过滤，过滤后分装，-80℃保存；最终获得玛咖外泌体。17.对上述获得的玛咖外泌体进行纯度与得率检测：1.1工作原理：通过纳米颗粒跟踪分析仪（particlemetrixgmbh，德国），测定外泌体粒的粒径分布及密度，根据峰的分布初步判断其纯度，峰数量越少纯度越高；通过每ml外泌体的数量，判断外泌体粒的得率，数量越大得率越大。18.1.2检测方法：（1）蔗糖梯度纯化离心后，提高外泌体纯度与得率：采用20mmol/l、ph为7.2的tris-hcl溶液，分别配制蔗糖梯度溶液（8%、30%、45%、60%），加入初步提取的外泌体，梯度离心；（2）通过纳米颗粒跟踪分析仪（particlemetrixgmbh，德国），分析粒径分布及纯度：吸取5微升外泌体加入到仪器，利用激光光源照射纳米颗粒悬浮液，利用全黑背景可以观察到单个纳米颗粒的布朗运动和电泳现象，能够实现单个纳米颗粒的跟踪，粒度测量，zeta电位测量，浓度测量等。19.如图1所示，研究结果，纯化前，粒径出现3个峰，粒径大小分别为135.5、158.3、347.3nm，对应的纯度分别为50.1、46.6、3.2%，每ml囊泡数量分别为1.1e+6、1.0e+6、1.1e+6。根据粒径大小（40-150nm），在这次测定中玛咖外泌体径大小135.5nm，对应的纯度为50.1%，每ml外泌体数量分别为1.1e+6。蔗糖梯度离心纯化后，粒径出现1个峰，粒径大小分别为137.7nm，对应的纯度为100%，每ml外泌体数量分别为6.3e+6。所以纯度从50.1%提高到100%，外泌体数量由1.1e+6提高到6.3e+6，得率提高近6倍。20.实施例2：玛咖外泌体在制备预防抑郁、抗抑郁药物中的应用本发明实施例中采用c57bl/6j小鼠慢性应激抑郁模型（cums），使用抗抑郁药物（氟西汀，flu）作为阳性对照药物、pbs作为阴性对照组，静脉注射玛咖外泌体，即实验分组为：正常组（control）、control+maca(100ug/kg)、ucms+pbs、ucms+maca（50ug/kg），ucms+maca（100ug/kg），ucms+maca(200ug/kg)、flu(10mg/kg)，通过不同实验，观察并比较其预防抑郁及抑郁作用。21.2.1研究材料2.1.1动物：清洁级c57bl/6j小鼠，四周18-25g正常喂食常温常湿无菌饲养，所有实验均遵循徐州医科大学实验动物伦理规范；2.1.2试剂：玛咖外泌体（采用实施例1中方法获得）、氟西汀（10mg/kg）、pbs；2.1.3仪器：悬尾仪器、强迫游泳仪器、旷场仪器、50cm×50cm×ꢀ20cm白色塑料箱、50ml糖水瓶、14cm玻璃烧杯和摇床。22.2.2研究方法2.2.1慢性应激抑郁模型（cums）的建立ucms组小鼠每天随机遭受两种或三种不同性质的应激，连续8周，使动物不能预料刺激的发生，避免产生适应。按照以下方式随机应激：所有模型组小鼠单笼饲养；向每个标准笼喷洒干净的水使垫料潮湿，将动物放置在潮湿笼中24h。喷洒水的量可根据鼠笼的大小调整以使垫料完全潮湿但不引起积水；每笼移除垫料24h，在此之后动物被转移至另一个应激源所需的空笼12h；45°倾斜笼12h，鼠笼可斜靠在稳定的物体上，保证动物在笼中移动而不影响鼠笼的位置；改变正常的12h昼/12h夜循环为每30min一个连续周期，持续8h。随后，使动物恢复正常的昼夜循环；将每只动物从自己的鼠笼中转移至邻近动物的鼠笼中，然后再使其分离；移除所有垫料并加入~0.25英尺（小鼠）或~0.5英尺（大鼠）深度的水，持续时间4h。注意维持水温~30℃以最小化体温降低的可能，同时将动物放入新笼子之前用柔软的毛巾对其简单干燥；将动物暴露动物至含捕食者气味/声音的环境中24h，通过随便撒入源于天然的捕食物者的皮毛样本或尿液（10-20ml）至笼中，或者靠近鼠笼播放天然捕食者咆哮性或掠夺性的噪音24h；冰水游泳（4℃）5min，一天两次；禁食禁水24h；闪光灯12h；每天应激结束，将所有动物放至干净的笼子里并恢复其饲养状态。23.2.2.2小鼠抑郁模型评价实验（1）糖水偏好在测试前48h使动物习惯于饮用1%的蔗糖溶液，适应饲养后提供两个瓶子（1%的蔗糖溶液vs饮用水）24h，分别记录1%蔗糖水和饮用水的消耗体积，并按公式计算：[糖水消耗/(饮用水消耗+糖水消耗)]×100%；（2）强迫游泳实验提前24小时对小鼠进行游泳训练，将小鼠置于盛有1200ml，22-24℃的2l的大烧杯中，游泳10分钟。实验当天，将小鼠置于相同条件的大烧杯中，共观察6分钟，记录后5分钟的“不动”时间；（3）悬尾实验被悬尾的小鼠其尾巴粘附在一个稳固的棒子上（距离地面20cm，在距其尾尖部2cm处用胶布粘牢）；观察6分钟内实验动物的行为，记录后5分钟中内小鼠的“不动”时间的总和；（4）新奇抑制喂食实验提前24小时对小鼠进行禁食训练，第二天蒋小鼠放在准备好的大型空旷的没有顶的箱子里，在箱子中间放入一些瓜子或坚果和果冻之类的食物。之后将禁食24小时的小鼠沿着箱子边缘放入并开始计时，记录小鼠在十分钟内开始进食的时间（超过10分钟还未进食的按照10分钟记录）。进食一定要以小鼠开始咬食瓜子才算进食，抓起舔一或者着闻都不算在内；记录完后将小鼠放在单独的饲养笼内，放入称重好的饲料并记录五分钟内饲料的消耗量。[0024]2.2.3行为学检测（1）旷场实验旷场实验是一种常用的行为学测试实验，用于测定动物一般运动能力、焦虑水平和探索欲望。底部面积为96cm×96cm×96cm，四壁木板高为50cm。等动物在测试房间适应1h后，将小鼠从鼠笼中取出放在旷场底部中心位置，允许小鼠自由探索矿场5分钟，并记录探索的距离。每只大鼠实验结束后，用75%的酒精清理整个旷场，等酒精气味完全消散后之后，进行下一只大鼠的测试。用anymaze视频跟踪系统记录和视频跟踪系统记录和分析大鼠旷场实验运动的距离；（2）水迷宫morris水迷宫（morriswatermaze，mwm）是一种强迫实验动物游泳，观察和记录动物入水后寻找隐藏在水中平台的时间、轨迹，分析后推断动物的学习、记忆和空间认知等方面能力的实验。在本研究中于缺血/再灌注后第14d各实验组通过morris水迷宫实验测定大鼠的记忆能力。在缺血后第10-13天进行获得性训练，每天上午9:00开始，每天4次，每次间隔约1h，连续训练4天。在水中，任取一象限将大鼠面向池壁放入水中，其寻找水下的平台。第14天移走平台，将所有大鼠从第三象限的入水点面向池壁放入水中，监视系统自动追踪记录其90s内的运动情况；（3）高架十字迷宫高架十字迷宫是在离地面约70cm，迷宫由两个反向14厘米高的不透明封闭臂和两个反向的开放臂组成（30cm×5cm）。在实验开始的时候，将小鼠放在迷宫中心，面朝一个开放的臂，实验记录时长为3分钟。每次测试后用50%乙醇溶液，以消除以前受试者留下的异味。利用秒表记录小鼠在3分钟内在封闭臂和开放臂中的时间。[0025]2.2.4组织样本检测分组方法同上，采用小鼠的眼球取血进行化学成分分析，使用超高效液相色谱仪（uplc-ms/ms），通过液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。分别测定比较各组和抑郁密切相关的5-ht、ne、da的含量。[0026]2.2.4.1实验步骤（1）代谢物的提取：将10μl血清样本用40μl甲醇沉淀，2000rpm涡旋3min后，于4℃13000rpm离心5min，取上清40μl于进样小瓶上机；（2）标准溶液配置：将标准品储备液用甲醇稀释一定倍数倍，制备标准品母液，用标准品母液配置标准品工作曲线，浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、300，单位ng/ml。[0027]2.2.4.2uplc-ms/ms参数设置（1）uplc参数，见图12（a）液相梯度为图12（b）（2）ms参数，见图12（c）。[0028]2.3研究结果2.3.1小鼠抑郁模型评价结果（1）糖水偏好对ucms模型的评价通过糖水偏好实验，验证小鼠cums造模成功。如图2所示，control组（即未应激组）表现为对糖水的偏好率较高，而ucms组（模型组）对糖水的偏好率较降低，但存在个体差异较大，不同个体对糖水的表现不同，分布不均匀。[0029]（2）强迫游泳对ucms模型的评价通过强迫游泳实验，验证小鼠cums造模成功。如图3所示，control组和ucms组的强迫游泳时间对比，表现为模型组的小鼠不动时间长，而对照组的较短。[0030]（3）悬尾实验对ucms模型的评价通过悬尾实验实验，验证小鼠cums造模成功。如图4所示，control组和ucms组的小鼠悬尾实验对比，表现为整体上模型组不动时间较长，而对照组小鼠不动时间较短。[0031]（4）新奇抑制喂食实验对ucms模型的评价通过新奇抑制喂食实验，验证小鼠cums造模的成功。如图5所示，control组和ucms组的小鼠新奇抑制喂食实验对比，表现为模型组在十分钟内进食潜伏期长于对照组进食的时间。[0032]2.3.2给药后各组行为学检测（1）玛咖外泌体在小鼠强迫游泳实验中的表现实验分为5组，分组方法同上，进行小鼠强迫游泳实验，如图6所示，control+maca组与control组相比，不动时间明显变少，说明玛咖外泌体具有预防抑郁作用；ucms+maca（50、100、200μg/kg）与ucms相比，不动时间明显变短，表明玛咖外泌体有治疗抑郁作用；ucms+maca（50、100、200μg/kg）与阳性对照药flu组相比，时间明显变少，表明玛咖外泌体治疗抑郁效果优于flu。因此，玛咖外泌体在小鼠强迫游泳实验中小鼠不动时间变少，具有预防抑郁及抗抑郁的明显优势。[0033]（2）玛咖外泌体在小鼠悬尾实验中的表现实验分组同上，进行小鼠悬尾实验，如图7所示，control+maca组与control组相比，悬尾时间明显变少，说明玛咖外泌体具有预防抑郁作用；ucms+maca（50、100、200μg/kg）与ucms相比，时间明显变短，并具有剂量依赖性，表明玛咖外泌体有治疗抑郁作用；ucms+maca（200μg/kg）与阳性对照药flu组相比，小鼠不动时间变少，表明玛咖外泌体治疗抑郁效果优于flu。因此，玛咖外泌体在小鼠悬尾实验中小鼠不动时间变少，具有预防抑郁及抗抑郁的明显优势。[0034]（3）玛咖外泌体在小鼠新奇抑制喂食实验中的表现实验分组同上，进行小鼠新奇抑制喂食实验，如图8所示，control+maca组与control组相比，进食潜伏期明显变少，说明玛咖外泌体具有预防抑郁作用；ucms+maca（50、100、200μg/kg）与ucms相比，进食潜伏期，并具有剂量依赖性，表明玛咖外泌体有治疗抑郁作用；ucms+maca（100、200μg/kg）与阳性对照药flu组相比，进食潜伏期明显变少，表明玛咖外泌体治疗抑郁效果优于flu。因此，玛咖外泌体在小鼠新奇抑制喂食实验中，具有预防抑郁及抗抑郁的明显优势。[0035]本发明通过慢性温和不可预知应激来建立小鼠抑郁模型，通过糖水偏好、强迫游泳、悬尾试验、新奇抑制喂食实验等行为学检测中，验证造模是否成功；采用正常组或模型组静脉注射玛咖外泌体，并通过强迫游泳、悬尾试验、新奇抑制喂食实验等行为学检测，观察其预防抑郁及抗抑郁作用。本实验造模结果与前期预期的研究结果是一致的。[0036]2.3.3对5-羟色胺(5-ht)、去甲肾上腺素(ne)、多巴胺(da)进行靶向代谢组学检测已知研究表明，5-ht、ne、da在抑郁症患者中的表达较少，含量较低，低于正常人，且研究发现，含量越低，临床症状越严重，5-ht、ne、da在抑郁症患者中的表达及意义反应，具有较好的临床参考价值，可以进一步地研究其价值，更好地为临床治疗提供研究佐证，实验结果如下。[0037]（1）玛卡外泌体能够提高ucms模型小鼠5-羟色胺(5-ht)水平如图9所示，在正常情况下，control+maca(100ug/kg)组与control组比较，略有提高小鼠5-ht水平；与ucms模型组相比，尾静脉注射50ug/kg，100ug/kg，200ug/kg玛卡外泌体，均明显提高5-ht水平，并具有统计学意义。[0038]（2）玛卡外泌体能够提高ucms模型小鼠去甲肾上腺素(ne)水平如图10所示，在正常情况下，control+maca(100ug/kg)与control组比较，小鼠ne水平差别不大；与ucms模型组相比，尾静脉注射100ug/kg，200ug/kg玛卡外泌体能够显著提高模型小鼠ne水平，并具有统计学意义。[0039]（3）玛卡外泌体能够提高ucms模型小鼠多巴胺(da)水平如图11所示，在正常情况下，control+maca(100ug/kg)与control组比较，小鼠da水平差别不明显；与ucms模型组相比，尾静脉注射玛卡外泌体均不同程度提高模型小鼠da水平，200ug/kg效果更明显，并具有统计学意义。[0040]以上结果表明，模型加外泌体后5-ht、ne、da明显降低，说明具有较好的抗抑郁效果。当前第1页12当前第1页12