1.本发明涉及黄酮提取技术领域。更具体地说，本发明涉及一种牛膝菊黄酮的提取方法。
背景技术：
2.牛膝菊(galinsoga parviflora gav.)是菊科牛膝菊属，是一年生草木植物，又有向阳花、辣子草、珍珠草等称呼，原产地是南美洲，在我国四川、云南、广西、贵州、西藏等省(区)普遍分布。牛膝菊生命力顽强，可在各种环境下生长。
3.黄酮类化合物是存在于自然界的一大类化合物，它是植物在长期自然选择过程中产生的次级代谢产物，广泛存在于自然界中，1814年欧洲一位科学家发现了第1个黄酮类化合物——白杨素，截止到2000年，全世界发现的黄酮类化合物多达8000个，他们存在于各类植物中，在芸香科、唇形科与菊科等植物都发现了它们的存在，据估计约有20％的中草药含有黄酮类物质，在食品和医药工业上都有广泛的应用。黄酮类化合物具有消炎止血、抗癌、抗氧化、延长衰老等作用。因此，国内外都十分重视对黄酮类化合物的研究开发，通过国内保健市场调查，了解到国内开发了银杏黄酮、山楂黄酮、茶叶黄酮等诸多产品。由于合成黄酮等抗氧化剂对人体存在着一定的潜在风险，故人们对黄酮等天然抗氧化剂越来越重视，需求量也逐年增大目前。
4.目前用来提取黄酮的植物主要是豆科、伞形科等，关于牛膝菊黄酮提取相关的研究较少。
技术实现要素：
5.本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供一种牛膝菊黄酮的提取方法，其通过表面活性剂和乙醇溶液对牛膝菊中的黄酮进行提取，操作简便且黄酮提取率高。
6.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种牛膝菊黄酮的提取方法，包括：向牛膝菊粉中依次加入乙醇溶液、表面活性剂，于75
‑
80℃水浴下提取1
‑
1.5h；其中，提取过程中，所述乙醇溶液中乙醇的体积分数为40％，所述表面活性剂的添加量为2
‑
5g/l，提取过程中乙醇溶液与牛膝菊粉的液料比为30
‑
50ml/g。
7.优选的是，所述表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、硬脂酰乳酸钠、亚硝酸钠中的一种。
8.优选的是，所述表面活性剂为吐温20。
9.优选的是，所述牛膝菊粉的制备过程为，将牛膝菊粉碎过60
‑
80目筛后，置于体积分数为70％的乙醇溶液中浸泡20
‑
24h后抽滤，得抽滤渣，将所述抽滤渣置于90
‑
95℃下干燥18
‑
24h，得到牛膝菊粉。
10.优选的是，在依次加入乙醇溶液、表面活性剂进行提取操作之前，先对牛膝菊粉进行酶解处理，酶解处理过程为：向所述牛膝菊粉中依次加入溶剂、处理酶，搅拌均匀，于35
‑
40℃下反应30
‑
40min后进行提取操作；其中，所述牛膝菊粉、所述处理酶、所述溶剂的重量
比为100：0.2
‑
0.5:500
‑
600，所述溶剂为体积分数为40％的乙醇溶液，所述处理酶为纤维素酶、果胶酶中的一种或两种。
11.优选的是，所述处理酶为纤维素酶。
12.优选的是，还包括3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱，所述3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱分成两份，一份酶解用，一份提取用；其中，酶解过程中，酶解用的3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱的添加量为0.1
‑
0.5g/l，提取过程中，提取用的3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱的添加量为1.5g/l且吐温20的添加量为2.5g/l。
13.本发明至少包括以下有益效果：
14.第一、本发明通过向牛膝菊粉中添加乙醇溶液、表面活性剂，提供了一种牛膝菊中黄酮的提取方法，操作方便，黄酮提取率高。
15.第二、本发明通过预先对牛膝菊进行粉碎过筛，然后置于70％的乙醇溶液中浸泡，可去除牛膝菊中油脂等杂质，得到脱脂后的牛膝菊，方便进行后续的提取操作。
16.第三、本发明通过对牛膝菊粉进行酶解处理，酶作用于牛膝菊，可破坏牛膝菊的细胞壁，使黄酮逸出更多，进一步提高黄酮的提取率。
17.第四、本发明通过添加3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱，3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱作为两性离子表面活性剂，毒性低、生物相容性好，用于酶解过程，可增加酶的活性，用于提取过程，可与吐温20形成复配的表面活性剂，大大增强表面活性剂对牛膝菊底物的润湿和增溶作用；整体上可大大提高牛膝菊中黄酮的提取率。
18.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
19.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
20.<实施例1>
21.本发明提供一种牛膝菊黄酮的提取方法，包括：
22.向牛膝菊粉中依次加入乙醇溶液、表面活性剂，于75℃水浴下提取1h，过滤，取滤液得提取液；其中，提取过程中，所述乙醇溶液中乙醇的体积分数为40％，所述表面活性剂的添加量为4g/l，提取过程中乙醇溶液与牛膝菊粉的液料比为40ml/g；所述表面活性剂为吐温20；具体地，所述牛膝菊粉、所述乙醇溶液、所述表面活性剂置于具塞锥形瓶中，于水浴锅中进行浸提；牛膝菊选择生长完好，新鲜的牛膝菊，清洗干净后干燥，用小型高速粉碎机粉碎，过60目筛，得到牛膝菊粉；吐温20购自无锡市亚泰联合化工有限公司。
23.<实施例2>
24.本发明提供一种牛膝菊黄酮的提取方法，包括：
25.向牛膝菊粉中依次加入乙醇溶液、表面活性剂，于80℃水浴下提取1h，过滤，取滤液得提取液；其中，提取过程中，所述乙醇溶液中乙醇的体积分数为40％，所述表面活性剂的添加量为2g/l，提取过程中乙醇溶液与牛膝菊粉的液料比为40ml/g；所述表面活性剂为吐温80；具体地，所述牛膝菊粉、所述乙醇溶液、所述表面活性剂置于具塞锥形瓶中，于水浴锅中进行浸提；牛膝菊选择生长完好，新鲜的牛膝菊，清洗干净后干燥，用小型高速粉碎机
粉碎，过60目筛，得到牛膝菊粉；吐温80购自无锡市亚泰联合化工有限公司。
26.<实施例3>
27.本发明提供一种牛膝菊黄酮的提取方法，包括：
28.向牛膝菊粉中依次加入乙醇溶液、表面活性剂，于75℃水浴下提取1.5h，过滤，取滤液得提取液；其中，提取过程中，所述乙醇溶液中乙醇的体积分数为40％，所述表面活性剂的添加量为5g/l，提取过程中乙醇溶液与牛膝菊粉的液料比为40ml/g；所述表面活性剂为吐温20；吐温20购自无锡市亚泰联合化工有限公司；具体地，所述牛膝菊粉、所述乙醇溶液、所述表面活性剂置于具塞锥形瓶中，于水浴锅中进行浸提；
29.其中，所述牛膝菊粉的制备过程为，选择生长完好，新鲜的牛膝菊，清洗干净后干燥，用小型高速粉碎机粉碎，过80目筛后置于体积分数为70％的乙醇溶液中浸泡24h后抽滤，得抽滤渣，将所述抽滤渣置于90℃下干燥24h，得到牛膝菊粉。
30.<实施例4>
31.本发明提供一种牛膝菊黄酮的提取方法，包括：
32.向牛膝菊粉中依次加入乙醇溶液、表面活性剂，于75℃水浴下提取1h，过滤，取滤液得提取液；其中，提取过程中，所述乙醇溶液中乙醇的体积分数为40％，所述表面活性剂的添加量为4g/l，提取过程中乙醇溶液与牛膝菊粉的液料比为40ml/g；所述表面活性剂为吐温20；具体地，所述牛膝菊粉、所述乙醇溶液、所述表面活性剂置于具塞锥形瓶中，于水浴锅中进行浸提；吐温20购自无锡市亚泰联合化工有限公司；
33.其中，所述牛膝菊粉的制备过程为，选择生长完好，新鲜的牛膝菊，清洗干净后干燥，用小型高速粉碎机粉碎，过80目筛后置于体积分数为70％的乙醇溶液中浸泡24h后抽滤，得抽滤渣，将所述抽滤渣置于90℃下干燥24h，得到牛膝菊粉；
34.在依次加入乙醇溶液、表面活性剂进行提取操作之前，先对牛膝菊粉进行酶解处理，酶解处理过程为：向所述牛膝菊粉中依次加入溶剂、处理酶，搅拌均匀，于40℃下反应35min后进行提取操作；其中，所述牛膝菊粉、所述处理酶、所述溶剂的重量比为100：0.3:500，所述溶剂为体积分数为40％的乙醇溶液，所述处理酶为纤维素酶。
35.<实施例5>
36.本发明提供一种牛膝菊黄酮的提取方法，包括：
37.向牛膝菊粉中依次加入乙醇溶液、表面活性剂，于75℃水浴下提取1h，过滤，取滤液得提取液；其中，提取过程中，所述乙醇溶液中乙醇的体积分数为40％，所述表面活性剂的添加量为2.5g/l，提取过程中乙醇溶液与牛膝菊粉的液料比为40ml/g；所述表面活性剂为吐温20；具体地，所述牛膝菊粉、所述乙醇溶液、所述表面活性剂置于具塞锥形瓶中，于水浴锅中进行浸提；吐温20购自无锡市亚泰联合化工有限公司；
38.其中，所述牛膝菊粉的制备过程为，选择生长完好，新鲜的牛膝菊，清洗干净后干燥，用小型高速粉碎机粉碎，过80目筛后置于体积分数为70％的乙醇溶液中浸泡24h后抽滤，得抽滤渣，将所述抽滤渣置于90℃下干燥24h，得到牛膝菊粉；
39.在依次加入乙醇溶液、表面活性剂进行提取操作之前，先对牛膝菊粉进行酶解处理，酶解处理过程为：向所述牛膝菊粉中依次加入溶剂、处理酶，搅拌均匀，于40℃下反应35min后进行提取操作；其中，所述牛膝菊粉、所述处理酶、所述溶剂的重量比为100：0.3:550，所述溶剂为体积分数为40％的乙醇溶液，所述处理酶为纤维素酶；
40.还包括3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱，所述3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱分成两份，一份酶解用，一份提取用；其中，酶解过程中，酶解用的3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱的添加量为0.2g/l，提取过程中，提取用的3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱的添加量为1.5g/l且吐温20的添加量为2.5g/l；具体地，所述3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酶解过程中，在向所述牛膝菊中依次加入乙醇溶液、酶后，再加入3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱，此时3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱的添加量为0.2g/l；提取过程中，在向酶解后的牛膝菊粉中依次加入乙醇溶液、吐温20后，再加入3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱，此时3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱的添加量为1.5g/l且吐温20的添加量为2.5g/l，3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱和吐温20形成复配表面活性剂，进一步增大复配表面活性剂对牛膝菊的润湿和增溶作用。
41.<对比例1>
42.不添加吐温20，其他与实施例1相同。
43.<对比例2>
44.只在酶解过程中添加3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱，其他与实施例5相同。
45.<对比例3>
46.只在提取过程中添加3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱，其他与实施例5相同。
47.<对比例4>
48.去掉酶解过程，其他与实施例5相同。
49.<对比例5>
50.提取过程中，吐温20的使用量为2.5g/l，3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱的添加量为1.2g/l，其他与实施例5相同。
51.<对比例6>
52.提取过程中，吐温20的使用量为2.5g/l，3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱的添加量为1.8g/l，其他与实施例5相同。
53.<黄酮提取率的检测>
54.1、标准曲线的制作：
55.用75％的乙醇将10.00mg芦丁标准品溶解后定容至50ml，即可得到浓度为0.200mg/ml的芦丁标准溶液。
56.准确吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4、4.5ml标准溶液于10ml的容量瓶中，再分别加入0.3ml5％的nano2溶液，摇匀，放置6min后加入0.3ml10％al(no3)3溶液，摇匀，放置6min，加入4.0ml4％的naoh溶液，最后用75％的乙醇定容至刻度，摇匀，静置12min，在510nm处测定吸光度，制作标准曲线。
57.2、样本检测
58.取样本0.5ml于干燥的10ml容量瓶中，再分别加入0.3ml5％的nano2溶液，摇匀，放置6min后加入0.3ml10％al(no3)3溶液，摇匀，放置6min，加入4.0ml4％的naoh溶液，最后用75％的乙醇定容至刻度，摇匀，静置12min，在510nm处测定吸光度；根据标准曲线计算黄酮含量，并按下式计算牛膝菊黄酮的最终得率。
59.60.3、样本
61.将实施例1
‑
5，对比例1
‑
6中得到的提取液作为样本进行测定，具体实验结果见表1。
62.表1各实施例与对比例中牛膝菊中黄酮提取率对比表
63.实验组黄酮得率(％)实施例11.91实施例21.83实施例32.51实施例43.87实施例55.56对比例11.39对比例24.33对比例34.24对比例43.76对比例54.11对比例64.03
64.从表1中可以看出，通过添加表面活性剂(吐温20或吐温80)对牛膝菊粉中的黄酮进行提取，相比较不添加表面活性剂，可提高黄酮提取率，表面活性剂可降低固
‑
液相的表面张力，表面活性剂进入溶液中形成的胶束为溶质提供了多个相互作用位点，可增加黄酮的溶出度；通过预先对牛膝菊粉进行脱脂处理，可去除油脂等杂质，有助于进一步提高黄酮的提取率；通过对牛膝菊进行酶解处理，可破坏牛膝菊细胞壁，使黄酮进一步逸出；通过添加3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱，用于酶解过程中，可促进纤维素酶的活性，提高酶解效果，用于提取过程中，可与吐温20形成复配的表面活性剂，有助于进一步促进黄酮的溶出；当3
‑
磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱的添加量为1.5g/l且吐温20的添加量为2.5g/l时，黄酮提取率较高；为整体上，将牛膝菊粉先脱脂再酶解，最后复配表面活性剂，可极大地提高黄酮的提取率。
65.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。