一种藏红曲、藏药红曲提取物、制备方法及应用与流程

1.本发明涉及发酵技术领域，具体涉及一种藏红曲、藏药红曲提取物、制备方法及应用。


背景技术：

2.红曲为常用降脂药物，由红曲菌发酵而成。现临床使用的红曲类药物有2种，即中药“红曲”和藏药“藏红曲”。中药“红曲”，以梗米为基质，发酵而成，又习称“红曲米”，临床使用有红曲饮片和其成药血脂康胶囊和脂必妥胶囊；藏药“藏红曲”(原名：青稞红曲)，以我国藏区特产作物青稞的种仁作基质，发酵而成，临床使用其饮片。
3.中药红曲降血脂的活性成分为洛伐他汀类成分，作为原料药材，其标准附于《中国药典》收载的“血脂康胶囊”条下，但对于藏红曲中洛伐他汀类成分研究研究较少。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本技术提供本发明一种藏红曲、藏药红曲提取物、制备方法及应用。本技术优化营养液，以及发酵、干燥过程，提高藏红曲中洛伐他汀含量的同时能有效提高酸式洛伐他汀的含量。本技术藏红曲提取物能明显改善血脂指标，并能抑制高血脂模型体重曲线上升，同时可降低肝脏指数，抑制脂肪沉积形成。
5.为解决以上技术问题，本技术提供的技术方案是一种藏红曲的制备方法，包括：
6.(1)青稞、辅料、营养液按重量比(40
‑
100)：(5
‑
60)：(20
‑
45)混合后进行熟化，得到发酵基质；以重量比计，所述营养液包括：蔗糖0.1
‑
1份、谷氨酸0.2
‑
1份、组氨酸0.01
‑
0.26份、硝酸钙0.01
‑
0.15份、硝酸钠0.01
‑
0.15份、磷酸二氢钾0.01
‑
0.05份、正辛酸0.01
‑
0.05份、抗坏血酸0.1
‑
0.5份、edta
‑
二钠0.00001
‑
0.00005份、水96
‑
98.07份；
7.(2)发酵基质接种红曲菌种种子液后进行发酵，得到发酵物；
8.(3)将发酵物进行干燥。
9.优选的，青稞、辅料、营养液按重量比为88：12：40。
10.优选的，所述辅料由麸皮和豆粕组成，麸皮和豆粕重量比为(5
‑
12)：(2
‑
5)。
11.优选的，所述辅料由麸皮和豆粕组成，麸皮和豆粕重量比为10：2。
12.优选的，以质量百分比计，所述营养液由蔗糖0.41％、谷氨酸0.76％、组氨酸0.26％、硝酸钙0.09％、硝酸钠0.03％、磷酸二氢钾0.01％、正辛酸0.01％、抗坏血酸0.34％、edta
‑
二钠0.00001％、水98.07％组成。
13.优选的，所述青稞经过去渣、粉碎处理。
14.优选的，青稞、辅料、营养液混合过程为青稞、辅料、营养液拌料，拌料时间5
‑
7分钟。实现确保物料混合均匀，手捏成团，轻压即散。
15.优选的，所述熟化条件为121℃，熟化时间30分钟。
16.优选的，所述方法还包括：青稞、辅料、营养液按重量比混合后装瓶，每瓶装量
17.360
‑
440g/瓶，得到装瓶的物料；装瓶的物料进行熟化，得到发酵基质。
18.优选的，所述步骤(2)中发酵基质接种红曲菌种种子液前，发酵基质冷却至25～45℃。
19.优选的，所述红曲菌种种子液的制备过程包括：
20.红曲菌种接种到斜面培养基，30℃培养6
‑
7d培养，用水洗脱，得到孢子悬液；
21.孢子悬液接入发酵罐中30℃培养2
‑
3d培养，得到红曲菌种种子液。
22.优选的，所述红曲菌种种子液的制备过程包括：
23.红曲菌种接种到斜面培养基，30℃培养6
‑
7d培养，用300ml无菌水洗脱，得到孢子悬液；
24.孢子悬液液接入发酵罐中30℃培养2
‑
3d培养，得到红曲菌种种子液。
25.优选的，所述红曲菌种为曲霉科真菌红曲霉monascuspilosus(菌株：ywg
‑
1)。
26.优选的，所述步骤(2)中发酵过程具体包括：
27.高温发酵：发酵基质接种红曲菌种种子液后27
‑
29℃、相对湿度为60％
‑
65％的条件下进行发酵6天；
28.梯度降温发酵：以2
‑
3℃/天梯度降温至23℃，相对湿度保持不变进行梯度降温发酵；
29.低温发酵：在21
‑
23℃、相对湿度为60％
‑
65％的条件下进行低温发酵7
‑
8天，得到发酵物。
30.优选的，所述步骤(2)红曲菌种种子液接种量为0.114～0.139ml/g。
31.优选的，所述(2)中发酵物中总洛伐他汀含量≥0.6％时结束发酵。
32.优选的，所述高温发酵过程中发酵基质接种红曲菌种种子液后48小时第一次摇瓶，后每隔24小时摇瓶一次，共摇瓶4次。
33.优选的，所述梯度降温发酵过程中摇瓶1次。
34.优选的，所述高温发酵过程中每隔72小时摇瓶一次，摇瓶≤4次。
35.优选的，所述步骤(3)具体包括：将发酵物进行干燥，干燥温度为60℃，藏红曲水分≤10％时停止干燥。
36.优选的，所述步骤(3)具体包括：将发酵物进行干燥，干燥温度为60℃，藏红曲水分≤10％时停止干燥。
37.本发明还提供了一种上述的藏红曲在制备降血脂药物、食品中的应用。
38.本发明还提供了一种藏红曲提取物的制备方法，包括：
39.(a)将上述藏红曲粉碎后依次采用闷润、渗漉提取，得到渗漉液；
40.(b)所述渗漉液经浓缩、干燥得到藏红曲提取物。
41.优选的，所述(a)具体为：将权利要求7所述藏红曲粉碎后依次采用乙醇闷润、乙醇渗漉提取，得到渗漉液；
42.优选的，所述步骤(a)中乙醇为70％vol乙醇。
43.优选的，所述步骤(a)中采用乙醇闷润为0.8倍70％vol乙醇闷润12h。
44.优选的，所述步骤(4)具体为：取所述藏红曲14kg，用碾槽将藏红曲粉碎，过3
‑
4号筛，加入0.8倍70％vol乙醇闷润12h后，加入渗漉筒，经70％vol乙醇渗漉提取得到渗漉液，收集渗漉液150l。
45.优选的，所述步骤(b)浓缩为减压浓缩，减压浓缩条件为60
‑
80℃，转速30
‑
60转/
min。
46.优选的，所述步骤(b)干燥处理为冷冻干燥，冷冻干燥条件为温度
‑
10℃～
‑
50℃，真空度1.3
‑
13pa。
47.本发明提供了一种藏红曲提取物，由上述的藏红曲提取物的制备方法制备得到。
48.本发明提供了一种上述的藏红曲提取物在制备降血脂药物、保健食品中的应用。
49.优选的，所述降血脂药物、保健食品单位剂量含有所述藏红曲提取物0.1g～10g。。
50.目前临床治疗高血脂症使用较多的化学药物有他汀类药物、贝特类药物、烟酸类药物、树脂类药物、抗氧化剂类药物、依折麦布类药物等，其降血脂的作用机制主要有三个途径，即抑制内源性和外源性脂质合成和吸收，促进体内脂质转运、代谢和排泄。抑制外源性脂质吸收主要是通过影响小肠组织的胆固醇吸收以减少肠道内胆固醇的吸收，如依折麦布即属胆固醇吸收抑制剂；抑制内源性脂质合成一是通过抑制甲基戊二酰辅酶a(3
‑
hydroxy
‑3‑
methyl glutaryl coenzyme a,hmg
‑
co a)还原酶活性及其m rna表达水平以减少胆固醇的合成，二是通过抑制乙酰辅酶a转移酶(acc)、脂肪酸合成酶(fas)以减少脂肪酸的合成；促进体内脂质转运、代谢和排泄主要是通过促进低密度脂蛋白受体(ldl
‑
r)表达，促进脂肪酸排泄主要是通过增强胆固醇7a
‑
羟化酶(cyp7a
‑
1)活性等。
51.临床常用的降脂药物大多有不良反应，虽然短期内使用得到较好的疗效，但长期使用这些药物会对人体造成不同程度的危害。他汀类药物的不良反应主要表现为肝功能损伤，长期服用对肝功能的损伤的程度还有待观察，少见的是肌毒性方面；贝特类药物则主要是因为体内不能完全吸收，会出现恶心，胃部不适及食欲不振等胃肠症状，此外，还可能会出现头痛、头晕、失眠、皮肤瘙痒、荨麻疹、皮疹、脱发、性欲减退和肝肾功能变化等症状；烟酸类药物会因为皮肤血管扩张而出现的皮肤瘙痒、红斑、潮热、头痛等不良反应，同时也会出现恶心和腹泻等胃肠道副作用；树脂类药物不仅对任何类型的高甘油三酯血症均不起作用，而且还会出现腹胀、产气和便秘等胃肠道反应，同时，它会影响甲状腺素、地高辛、华法林、叶酸和其他脂溶性维生素的吸收，使长期服用的患者需不定时补充叶酸、维生素a、d、k和钙，这给患者带来不便的同时增加患者精神和经济负担；抗氧化剂类药物则在降血脂的同时会使患者血液中的hdl
‑
c降低；依折麦布这类药物一般会引起皮疹和荨麻疹等皮肤症状和血小板减少性紫癜，也会肌肉骨骼损害，同时不仅对非饮食性高胆固醇血症者没有效果，且还会致其血胆固醇升高；服用深海鱼油ω3脂肪酸虽然也能达到控制血脂的目的，但长期服用会引发视力下降，甚至出血等症状。因此，研发预防和治疗高血脂的药物具有重要意义，尤其是在那些高脂血症和心脑血管疾病发病率日益增长的发展中国家。
52.本技术与现有技术相比，其详细说明如下：
53.本发明提供了一种藏红曲及其制备方法，制备方法工艺稳定性良好，批次之间成分差异较小，质量稳定。本发明优化营养液，以及发酵、干燥过程，提高藏红曲中洛伐他汀含量的同时能有效提高酸式洛伐他汀的含量。
54.本发明藏红曲与市场上类似产品血脂康胶囊、脂必妥片的hplc指纹图谱比较分析显示藏红曲饮片与其他产品在成分上有较大区别，并初步鉴定出11个差异成分，主要为核苷类成分和莫纳可林类(monacolins)成分，其中洛伐他汀是其主要成分之一。
55.本发明提供一种藏红曲提取物及其制备方法、应用，藏红曲提取物能明显改善血脂指标，并能抑制高血脂模型体重曲线上升，使之和空白组体重曲线趋于一致，同时可降低
肝脏指数，抑制脂肪沉积形成。
56.本发明藏红曲提取物中除洛伐他汀和β
‑
葡聚糖外可能含有其他有助于降低血脂的成分。
57.本发明藏红曲提取物组可抑制金黄地鼠高血脂模型的体重增加，使之体重变化曲线与空白组一致，减少腹部脂肪和附睾脂肪沉积。
58.本发明藏红曲提取物(含洛伐他汀相当于人日用量10mg)降脂效果较好，效果优于洛伐他汀组(含洛伐他汀相当于人日用量20mg)，在减重、降低腹部脂肪、附睾脂肪沉积方面相对于洛伐他汀组虽无明显差异，但有降低趋势，提示藏红曲提取物中除含有洛伐他汀降脂药物外，可能还含其他物质可以辅助降血脂、减重、减少脂肪沉积，或系藏红曲中含有的β
‑
葡聚糖对洛伐他汀具有系统作用。
59.本发明藏红曲提取物组与藏红曲水煎液中存在差异的成分，存在影响小鼠精神状态和迅速降低体重的成分。
附图说明
60.图1为效果例1的3.1中峰匹配指纹图谱；
61.图2为效果例1的3.1中对照指纹图谱；
62.图3为效果例1的3.2中血脂康胶囊样品与藏红曲饮片对照指纹图谱的全谱峰匹配图；
63.图4为效果例1的3.3中脂必妥样品与藏红曲饮片对照指纹图谱的全谱峰匹配图；
64.图5为效果例1的3.4中其他红曲样品与藏红曲饮片对照指纹图谱的全谱峰匹配图；
65.图6为效果例1的3.6中为藏红曲饮片对照指纹图谱中共有特征指纹峰图；
66.图7为效果例1的3.7中4组红曲类产品各指纹图谱全谱峰匹配图；
67.图8为效果例1的3.7中4组红曲类产品“峰
‑
峰面积”匹配数据表图；
68.图9为效果例1的3.7中主成分分析图；
69.图10为效果例1的3.7中聚类分析树状图；
70.图11为效果例1的3.7中藏红曲饮片、血脂康胶囊、脂必妥片和其他红曲样品热图分析图；
71.图12为效果例1的3.7中藏红曲饮片与血脂康胶囊的差异成分图；
72.图13为效果例1的3.7中藏红曲饮片和血脂康胶囊热图分析图；
73.图14为效果例2的3.1中体重变化曲线图；
74.图15为效果例2的3.2中藏红曲对高血脂模型血清tc的影响图；
75.图16为效果例2的3.2中藏红曲对高血脂模型血清tg的影响图；
76.图17为效果例的3.2中藏红曲对高血脂模型血清hdl
‑
c的影响图；
77.图18为效果例2的3.2中藏红曲对高血脂模型血清ldl
‑
c的影响图；
78.图19为效果例2的3.3中藏红曲对高血脂模型肝脏指数的影响图；
79.图20为效果例2的3.4中藏红曲提取物对腹部脂肪的影响图；
80.图21为效果例2的3.4中藏红曲提取物对附睾脂肪的影响图；
81.图22藏红曲提取物对金黄地鼠肝组织病理形态的影响(x200)图；
82.图23为效果例2的2.4中的代谢组学检测流程图；
83.图24为效果例2的3中的金黄地鼠肝脏代谢物pca分析图；
84.图25为效果例2的3中的金黄地鼠肝脏代谢物聚类分析图；
85.图26为效果例2的3中的kegg化合物分类图；
86.图27为效果例2的3中的hmdb化合物分类图；
87.图28为效果例2的3中的kegg功能通路图；
88.图29为效果例2的3中的kegg通路富集结果图；
89.图30为效果例2的3中的ppar信号通路图；
90.图31为效果例2的3中的藏红曲提取物对pparα、cyp7a1及cpt
‑
1蛋白的影响图；
91.图32为效果例2的4中pparα信号通路图。
具体实施方式
92.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
93.一种藏红曲的制备方法，包括：
94.(1)青稞、辅料、营养液按重量比(40
‑
100)：(5
‑
60)：(20
‑
45)混合后进行熟化，得到发酵基质；以重量比计，所述营养液包括：蔗糖0.1
‑
1份、谷氨酸0.2
‑
1份、组氨酸0.01
‑
0.26份、硝酸钙0.01
‑
0.15份、硝酸钠0.01
‑
0.15份、磷酸二氢钾0.01
‑
0.05份、正辛酸0.01
‑
0.05份、抗坏血酸0.1
‑
0.5份、edta
‑
二钠0.00001
‑
0.00005份、水96
‑
98.07份；
95.(2)发酵基质接种红曲菌种种子液后进行发酵，得到发酵物；
96.(3)将发酵物进行干燥。
97.优选的，青稞、辅料、营养液按重量比为88：12：40。
98.优选的，所述辅料由麸皮和豆粕组成，麸皮和豆粕重量比为(5
‑
12)：(2
‑
5)。
99.优选的，所述辅料由麸皮和豆粕组成，麸皮和豆粕重量比为10：2。
100.优选的，以质量百分比计，所述营养液由蔗糖0.41％、谷氨酸0.76％、组氨酸0.26％、硝酸钙0.09％、硝酸钠0.03％、磷酸二氢钾0.01％、正辛酸0.01％、抗坏血酸0.34％、edta
‑
二钠0.00001％、水98.07％组成。
101.优选的，所述青稞经过去渣、粉碎处理。
102.优选的，青稞、辅料、营养液混合过程为青稞、辅料、营养液拌料，拌料时间5
‑
7分钟。实现确保物料混合均匀，手捏成团，轻压即散。
103.优选的，所述熟化条件为121℃，熟化时间30分钟。
104.优选的，所述方法还包括：青稞、辅料、营养液按重量比混合后装瓶，每瓶装量
105.360
‑
440g/瓶，得到装瓶的物料；装瓶的物料进行熟化，得到发酵基质。
106.优选的，所述步骤(2)中发酵基质接种红曲菌种种子液前，发酵基质冷却至25～45℃。
107.优选的，所述红曲菌种种子液的制备过程包括：
108.红曲菌种接种到斜面培养基，30℃培养6
‑
7d培养，用水洗脱，得到孢子悬液；
109.孢子悬液接入发酵罐中30℃培养2
‑
3d培养，得到红曲菌种种子液。
110.优选的，所述红曲菌种种子液的制备过程包括：
111.红曲菌种接种到斜面培养基，30℃培养6
‑
7d培养，用300ml无菌水洗脱，得到孢子悬液；
112.孢子悬液液接入发酵罐中30℃培养2
‑
3d培养，得到红曲菌种种子液。
113.优选的，所述红曲菌种为曲霉科真菌红曲霉monascuspilosus(菌株：ywg
‑
1)。
114.优选的，所述步骤(2)中发酵过程具体包括：
115.高温发酵：发酵基质接种红曲菌种种子液后27
‑
29℃、相对湿度为60％
‑
65％的条件下进行发酵6天；
116.梯度降温发酵：以2
‑
3℃/天梯度降温至23℃，相对湿度保持不变进行梯度降温发酵；
117.低温发酵：在21
‑
23℃、相对湿度为60％
‑
65％的条件下进行低温发酵7
‑
8天，得到发酵物。
118.优选的，所述步骤(2)红曲菌种种子液接种量为0.114～0.139ml/g。
119.优选的，所述(2)中发酵物中总洛伐他汀含量≥0.6％时结束发酵。
120.优选的，所述高温发酵过程中发酵基质接种红曲菌种种子液后48小时第一次摇瓶，后每隔24小时摇瓶一次，共摇瓶4次。
121.优选的，所述梯度降温发酵过程中摇瓶1次。
122.优选的，所述高温发酵过程中每隔72小时摇瓶一次，摇瓶≤4次。
123.优选的，所述步骤(3)具体包括：将发酵物进行干燥，干燥温度为60℃，藏红曲水分≤10％时停止干燥。
124.优选的，所述步骤(3)具体包括：将发酵物进行干燥，干燥温度为60℃，藏红曲水分≤10％时停止干燥。
125.本发明还提供了一种上述的藏红曲在制备降血脂药物、食品中的应用。
126.本发明还提供了一种藏红曲提取物的制备方法，包括：
127.(a)将上述藏红曲粉碎后依次采用闷润、渗漉提取，得到渗漉液；
128.(b)所述渗漉液经浓缩、干燥得到藏红曲提取物。
129.优选的，所述(a)具体为：将权利要求7所述藏红曲粉碎后依次采用乙醇闷润、乙醇渗漉提取，得到渗漉液；
130.优选的，所述步骤(a)中乙醇为70％vol乙醇。
131.优选的，所述步骤(a)中采用乙醇闷润为0.8倍70％vol乙醇闷润12h。
132.优选的，所述步骤(4)具体为：取所述藏红曲14kg，用碾槽将藏红曲粉碎，过3
‑
4号筛，加入0.8倍70％vol乙醇闷润12h后，加入渗漉筒，经70％vol乙醇渗漉提取得到渗漉液，收集渗漉液150l。
133.优选的，所述步骤(b)浓缩为减压浓缩，减压浓缩条件为60
‑
80℃，转速30
‑
60转/min。
134.优选的，所述步骤(b)干燥处理为冷冻干燥，冷冻干燥条件为温度
‑
10℃～
‑
50℃，真空度1.3
‑
13pa。
135.本发明提供了一种藏红曲提取物，由上述的藏红曲提取物的制备方法制备得到。
136.本发明提供了一种上述的藏红曲提取物在制备降血脂药物、保健食品中的应用。
137.优选的，所述降血脂药物、保健食品单位剂量含有所述藏红曲提取物0.1g～10g。
138.本发明效果例中甲醇、乙醇溶液含量以体积百分比计。
139.红曲菌种为曲霉科真菌红曲霉monascuspilosus(菌株：ywg
‑
1)(市售)
140.实施例1
141.种子液的制备：
142.(1)将生长状态良好的红曲菌种接种于茄形瓶斜面，30℃培养6
‑
7d(具体操作参考：生产菌种传代纯化标准操作程序xzyw
‑
sop
‑
001
‑
01)用300ml无菌水洗脱制成孢子悬液。
143.(2)孢子悬液按1wt％左右的接种量接种到发酵罐中，30℃、溶氧100％、140r/min，培养2
‑
3d，作为种子液。
144.红曲菌种接种到斜面培养基，30℃培养6
‑
7d培养，用水洗脱，得到孢子悬液；
145.孢子悬液液接入发酵罐中30℃培养2
‑
3d培养，得到红曲菌种种子液。
146.藏红曲的制备方法：
147.(1a)原料处理：青稞原料去杂、去渣、去霉变等筛选处理后粉碎，过20目筛网
148.(1b)配制培养基质：配制培养基质，按照88wt％青稞、10wt％麸皮、2wt％豆粕的比例进行培养基质的配制。
149.表1培养基质配方
[0150][0151]
(1c)配制营养液：营养液配制严格按照如下配方进行计算称量。
[0152]
表2营养液配方
[0153][0154]
(1d)拌料
[0155]
营养液按照40wt％的比例加入干培养基质中，得到配好的物料。
[0156]
将配好的物料加入拌料机进行拌料，拌料5
‑
7分钟，确保青稞、麸皮、豆粕和营养液混合均匀，手捏成团，轻压即散。
[0157]
(1e)装瓶：拌料完成后按照每瓶装量控制在400g/瓶(
±
10％)进行装瓶，得到装瓶的物料。在此过程中，需qa(质量保证)每15分钟对装瓶量随机抽查，确保装瓶量。
[0158]
(1f)熟化：装瓶的物料进行熟化，得到发酵基质；熟化温度121℃，时间30分钟。熟化结束后立即取出发酵基质至接种间，打散冷却。
[0159]
(2a)接种：发酵基质冷却至25～45℃接种红曲菌种种子液，每瓶接种量为50ml，接种后立即摇瓶。
[0160]
(2b)发酵
[0161]
高温发酵：发酵基质接种红曲菌种种子液后27
‑
29℃、相对湿度为60％
‑
65％的条件下进行发酵6天；
[0162]
梯度降温发酵：以2
‑
3℃/天梯度降温至23℃，相对湿度保持不变进行梯度降温发酵；
[0163]
低温发酵：在21
‑
23℃、相对湿度为60％
‑
65％的条件下进行低温发酵7
‑
8天，得到发酵物，发酵物中总洛伐他汀含量≥0.6％时结束发酵。
[0164]
发酵过程发酵参数见表3
[0165]
表3发酵参数
[0166][0167]
(3a)倒瓶：发酵结束后进行倒瓶，去掉有污染的、结块的发酵物。
[0168]
(3b)干燥：将发酵物进行干燥，干燥温度为60℃，干燥期间可翻曲1
‑
2次，藏红曲水分≤10％时停止干燥。
[0169]
(3c)收料：当藏红曲水分≤10％，立即安排收料，不可延长收曲时间，过度干燥。干燥的藏红曲用洁净塑料袋分装，称量，并做好标识。
[0170]
藏红曲提取物的制备:
[0171]
(4)取所述上述藏红曲14kg，用碾槽将藏红曲粉碎，过3号筛，加入0.8倍70％vol乙醇(乙醇与藏红曲体积比为1:0.8)闷润12h后，加入渗漉筒，经20倍提及的70％vol乙醇渗漉提取得到渗漉液，收集渗漉液150l；
[0172]
(5)边收集渗漉液边将渗漉液置于大型旋转蒸发仪进行减压浓缩，减压浓缩条件为60
‑
80℃，转速30
‑
60转/min，浓缩至体积为10000ml，得到总提取物浓缩液，然后经
‑
25℃,，真空度1.3
‑
13pa条件下低温冷冻干燥120min，得到藏红曲提取物。
[0173]
对比例1
[0174]
本对照例和实施例1的区别仅在于培养基质配方、营养液配方和发酵参数，具体见下表。
[0175]
表4培养基质配方
[0176][0177]
表5营养液配方
sicex tof5600+质谱仪(美国爱博才思仪器公司)；一次性使用无菌注射器(带针)圣光医用制品股份有限公司；一次性0.22、0.45μm滤膜广州市文睿科学仪器有限公司；ymc c18色谱柱(日本ymc科技)；
[0185]
1.2试验材料指纹图谱建立用藏红曲对口药材共计14批，藏红曲由西藏月王生物科技有限公司提供，且均由实施例1中的藏红曲的制备方法制备得到；另外收集了市售血脂康、脂必妥、中药红曲共计12批样品。
[0186]
样品信息见表7。
[0187]
表7藏红曲饮片及中药红曲类样品信息
[0188][0189]
[0190]
1.3试验试剂样品制备用甲醇为分析纯，购自西陇化工股份有限公司。液相色谱所用甲醇购为色谱纯(批号：654655
‑
5456，美国天地公司)，水为实验室密理博纯水仪产超纯水。
[0191]
2方法
[0192]
2.1色谱条件：色谱柱为ymc c18色谱柱(规格为150mm
×
4.6mm,3μm)，柱温30℃，流速1ml/min，检测波长为250nm，进样量10μl。流动相为纯水(a)
‑
甲醇(b)系统，梯度洗脱程序：0～3min，5％甲醇；3～7min，5％～15％甲醇；7～10min，15％～15％甲醇，10～15min，15％～56％甲醇，15～25min，56％～77％甲醇，25～32min，77％～77％甲醇，32～36min，77％～100％甲醇，36～39min，100％～100％甲醇，39～40min，100％～5％甲醇，40～44min，5％甲醇。
[0193]
2.2质谱条件：离子源为电喷雾离子化源(esi)，负离子模式；质量扫描范围m/z50～1200；喷雾电压：
‑
4500v，雾化气温度：550℃，气帘气：170.64kpa，雾化气和辅助气：350.25kpa；去簇电压(dp)：
‑
100v；采用tof
‑
ms
‑
ida
‑
ms/ms方法采集数据，tof/ms一级预扫描和触发的二级扫描tof/ms/ms离子累积时间分别为500、200ms，ce碰撞能量为35ev，ces碰撞能量叠加为(35
±
10)ev，触发二级的方法为ida，触发二级的条件为多重质量亏损(mmdf)和动态背景扣除(dbs)，满足以上的的优先进行二级扫描。
[0194]
2.3供试品溶液制备：分别取每批药材(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率140w，频率42khz)1.5小时，放冷至15～35℃，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，高速离心提取液，取上清液经0.45μml滤头滤过，取续滤液即得。
[0195]
2.4藏红曲药材hplc指纹图谱方法学考察
[0196]
2.4.1指纹图谱色谱条件的考察以指纹图谱呈现的色谱峰信息的丰富度以及主要有效成分洛伐他汀的提取率为考察指标，最终确定了色谱流动相洗脱条件，柱温，检测波长。在本条件下，色谱峰从大极性到小极性的能较好的分离和呈现。
[0197]
2.4.2供试品溶液制备方法考察以指纹图谱呈现的色谱峰信息的丰富度以及主要有效成分洛伐他汀的提取率为考察指标，考察了制备方法的溶剂选择(30％、60％、100％甲醇和30％、60％、100％乙醇)，超声时间(0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h)，最终确定了供试品溶液制备方法，能比较全面的反映藏红曲中的从小极性到大极性的成分。
[0198]
2.4.3精密度试验取参照药材供试品溶液，连续进样6次，按2.1项条件分析，以洛伐他汀峰为参照峰，计算各6个共有色谱峰的相对峰面积与保留时间。结果相对峰面积rsd均小于2.0％，相对保留时间的rsd均小于1％，说明仪器精密度良好。
[0199]
2.4.4重复性试验取同一批药材，按“2.2”项下方法平行制备6份，按2.1项条件分析，以洛伐他汀成分峰为参照峰，计算各6个共有色谱峰的相对峰面积与保留时间。结果相对峰面积rsd均小于3.0％，相对保留时间的rsd均小于1％。
[0200]
2.4.5稳定性试验取同一批药材供试品溶液，间隔进样，每次进样间隔两小时，分别在0、2、4、6、8h
……
48h进样，按2.1项条件分析，以洛伐他汀为参照峰，计算各6个共有色谱峰的相对峰面积与保留时间，计算各共有峰的相对峰面积与相对保留时间。结果共有峰的相对峰面积在24h内rsd均小于3.0％，相对保留时间的rsd均小于1％，说明样品在24h内稳定。
[0201]
2.5数据处理分析采用《中国药典》2012版指纹图谱软件进行指纹图谱分析。通过absciex公司的peakview 1.2软件进行对共有峰进行质谱解析，通过数据库及文献参考对特征峰进行结构鉴定；通过指纹图谱分析获得每个样品的“成分
‑
峰面积”数据表，将此数据表导入metaboanalyst在线分析软件进行主成分分析(pca)和热图分析(heatmap)。
[0202]
3结果与讨论
[0203]
3.1 14批藏红曲饮片hplc指纹图谱分析
[0204]
在2.1项条件下，取14批藏红曲饮片样品(藏红曲序号1～14)，每批样品取2个样本，对28个样本的色谱数据中保留时间在2～38min内峰高大于1000的色谱峰自动积分，以批号为20080201的一个样本色谱图为参照图谱，中位数生成法，选取时间宽度为0.1min，将28个样本色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)，通过比较选择6个共有特征成分峰作为marker峰进行多点校正，进行全谱峰匹配得到峰匹配指纹图谱(图1)，软件生成对照指纹图谱(图2)。通过软件相似度分析，得到各批次样品的相似度数据，结果见表8。
[0205]
图1为28批藏红曲饮片的指纹图谱分析及全谱峰匹配图(r：对照指纹图谱；s1～s28：藏红曲饮片样本)
[0206]
图2藏红曲饮片对照指纹图谱(1～10号峰为共有特征指纹峰，8号峰设为参照峰s)
[0207]
表8 28批藏红曲饮片样本与对照图谱相似度分析结果
[0208]
[0209][0210]
结果显示本实验建立的藏红曲饮片对照指纹图谱与28个样本之间的相似度均在0.95以上。表明试验用各批次藏红曲饮片样品质量稳定性很好，批次间差异较小。
[0211]
3.2藏红曲饮片与中成药血脂康胶囊的指纹图谱对比分析
[0212]
在2.1项条件下检测6批血脂康胶囊，每批样品取2个样本，将所得色谱数据及藏红曲饮片对照指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)，计算相似度，结果见图3、表9。
[0213]
结果表明血脂康胶囊各样本与藏红曲饮片对照指纹图谱的相似度均在0.85～0.88之间，表明血脂康胶囊与藏红曲饮片在成分组成上存在一定差异。
[0214]
图3血脂康胶囊样品与藏红曲饮片对照指纹图谱的全谱峰匹配图(r：藏红曲对照指纹图谱；
[0215]
s1～s12：血脂康胶囊样品)
[0216]
表9血脂康胶囊与藏红曲饮片对照指纹图谱相似度分析结果
(2012版)，计算相似度，结果见图5和表11。
[0227]
图5其他红曲样品与藏红曲饮片对照指纹图谱的全谱峰匹配图(r：藏红曲饮片对照指纹图谱；s1～s10：其他红曲样品)
[0228]
表11其他红曲样品与藏红曲饮片对照指纹图谱相似度分析结果
[0229][0230]
结果表明本研究使用的5个厂家的样本与藏红曲饮片对照指纹图谱的相似度最低为0.33，最高为0.81，表明该5个厂家的中药红曲样本在成分组成上与藏红曲饮片存在较大差异，且各批次样品间质量稳定性差。
[0231]
3.5讨论：
[0232]
以上对藏红曲饮片与其他中药红曲类各样本的指纹图谱分析表明，本发明制备的藏红曲饮片对照指纹图谱能较好的反映藏红曲饮片产品的质量和稳定性，且可以鉴别出藏红曲饮片与临床常用的如血脂康胶囊、脂必妥片等其他传统红曲类产品之间的差异。结果显示，脂必妥片在成分组成上与藏红曲饮片较为接近，相似度在0.95左右；血脂康胶囊在成分组成上与藏红曲饮片差异较大，均在0.85～0.88之间；而本使用的5个厂家的红曲样品在成分上与本发明藏红曲饮片存在显著，相似度在0.33～0.81之间，反映出市场上不同厂家生产的红曲饮片的质量一致性较差。
[0233]
3.6uhplc
‑
ms/ms方法对藏红曲指纹图谱中成分峰的鉴定
[0234]
通过色谱峰的紫外以及质谱碎片信息进行数据库搜索和文献比对藏红曲饮片对照指纹图谱中21个共有特征峰进行初步鉴定，共鉴定出其中20个成分，各峰编号见图6(图6为藏红曲饮片对照指纹图谱中共有特征指纹峰图)，各化合物鉴定结果质谱相关信息表见表12。
[0235]
在鉴定出的成分中，2、3、4号峰代表的成分均为核苷类物质，13、14、15号峰代表的成分均为红曲色素类物质，18号峰为藏红曲饮片主要活性成分洛伐他汀(monacolin k)，10号峰为主要毒性成分桔霉素(cirinin)；其他14个色谱峰代表的成分均为莫拉可林(monacolins)类化合物。结果表明藏红曲饮片中含有多种莫拉可林类(他汀类)成分，且其
中洛伐他汀，即monacolin k为这类成分中含量较高的代表性成分。另外藏红曲饮片中也含有红曲产品中普遍常见的毒性成分桔霉素。
[0236]
表12藏红曲饮片中成分的质谱鉴定信息表
[0237]
[0238]
[0239]
[0240][0241]
3.7藏红曲饮片与血脂康等其他红曲产品的化学成分比较分析
[0242]
3.7.1将所有红曲类产品分为藏红曲饮片、血脂康胶囊、脂必妥片和其他红曲(中药红曲)四组，每组样品取6个样本，采取前述指纹图谱方法进行分析，将数据导入到指纹图谱软件系统，多点校正后，进行全谱峰匹配(见图7)，提取出各样本“色谱峰
‑
峰面积”匹配数据表(图8)。将此表数据格式化，上传至metaboanalyst在线分析软件系统，进行主成分分析(pca)、系统数分析和热图(heatmap)分析。结果显示指纹图谱软件系统共提取出130个色谱峰。
[0243]
图7 4组红曲类产品各指纹图谱全谱峰匹配图(s1～s6：藏红曲饮片样本zhq
‑
1～zhq
‑
6；s7～s12：血脂康胶囊样本xzk
‑
1～xzk
‑
6；s13～s18：脂必妥片样本zbt
‑
1～zbt
‑
6；s19～s24：其他红曲(中药红曲)饮片样本oth
‑
1～oth6)
[0244]
图8 4组红曲类产品“峰
‑
峰面积”匹配数据表
[0245]
3.7.2基于“色谱峰
‑
峰面积”表数据，对四组红曲样本进行统计学分析。主成分分析(图9)(scores plot between the selected pcs.)显示藏红曲饮片、血脂康胶囊、脂必妥片和其他红曲(中药红曲)4组样品分别聚类在一起，且前3组样品聚合度更高。从前述指纹图谱分析可知“其他红曲样品组”中有2个样品的成分与其他样品差异较大，几乎不含其他红曲都含有的洛伐他汀成分。另从层次聚类分析树状图(图10)(clustering result shown asdendrogram(distancemeasure using euclidean,and clustering algorithm using average).)和热图分析(clustering result shown as heatmap)(图11)可看出藏红曲饮片、血脂康胶囊、脂必妥片和其他红曲样品组成分上的远近关系，与藏红曲饮片成分按相似程度排序依次为脂必妥片、血脂康胶囊和其他红曲样品，这也与在指纹图谱中的相似度分析结果一致。其他样品组中有2个样品(oth
‑
5和oth
‑
6)单独聚在一起，说明其成分上与其他红曲样品差异较大。从前述指纹图谱分析结果可知该2个样品不含红曲产品中的特征活性成分洛伐他汀。
[0246]
3.7.3基于“色谱峰
‑
峰面积”表数据，对藏红曲饮片和血脂康胶囊的2组样本进行统计学分析。基于top45差异成分，通过热图分析(图13)(clustering result shown as heatmap top 45(distance measure using euclidean,and clustering algorithm using average).)结合藏红曲饮片和血脂康胶囊指纹图谱，初步确定藏红曲饮片指纹图谱中的1～6号峰和血脂康胶囊中的ⅰ～
ⅴ
号峰分别为其优势成分，且可作为藏红曲饮片和血脂康胶囊中差异较为明显的成分(见图12)。
[0247]
通过高分辨质谱分析对这11个成分进行了结构鉴定。初步鉴定结果见表13。
[0248]
图12：藏红曲饮片与血脂康胶囊的差异成分(a：藏红曲1～6；b：血脂康ⅰ～
ⅴ
)
[0249]
表13藏红曲饮片与血脂康胶囊的差异成分质谱鉴定信息表
[0250]
[0251][0252]
4结论
[0253]
4.1建立了分析结果显示藏红曲的各批样品与对照指纹图谱相似度均在0.95以上，表明藏红曲饮片的工艺稳定性良好，批次之间成分差异较小，质量稳定。
[0254]
4.2本发明制备的标准指纹图谱能有效区分藏红曲饮片与市场上类似产品如血脂康胶囊(相似度均低于0.85)，但与另一产品脂必妥片区分度不是很高(相似度约为0.95)，但脂必妥收集样品数较少。
[0255]
4.3通过液相高分辨质谱联用技术对藏红曲饮片标准指纹图谱中的色谱峰进行了初步鉴定，已鉴定出其中21种主要成分。
[0256]
4.4通过藏红曲饮片与市场上类似产品血脂康胶囊、脂必妥片的hplc指纹图谱比较分析，显示藏红曲饮片与其他产品在成分上有较大区别，并初步鉴定出11个差异成分，主
要为核苷类成分和莫纳可林类(monacolins)成分，其中洛伐他汀是其主要成分之一。
[0257]
效果例2
[0258]
藏红曲降脂活性的研究
[0259]
(1)以雄性金黄地鼠为实验对象，高脂饲料连续喂养2周血脂升高后，继续饲喂高脂饲料4周并同时给予藏红曲提取物，实验结束时检测其降血脂作用及机制，并观察藏红曲是否会抑制高血脂症向非酒精性脂肪肝的进展。
[0260]
(2)实验设置7个组：空白组(normal)、模型组(model)、藏红曲低剂量组(zhq
‑
low)、藏红曲高剂量组(zhq
‑
high)、血脂康对照组(xzk)、洛伐他汀阳性对照组(lovastatin)、洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组对照组(lovastatin+βg)对照组。空白组给予对照饲料，模型组、藏红曲提取物低、高剂量组、血脂康组、洛伐他汀对照组及洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组对照组(lovastatin+βg)对照组给予高脂饲料，六组均给予足够饮水。藏红曲提取物低剂量组、高剂量组以原药量0.42g/kg、0.84g/kg每天灌胃；洛伐他汀对照组每天灌胃洛伐他汀(1.87mg/kg)水溶液，洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组每天灌胃洛伐他汀(1.87mg/kg)+β
‑
葡聚糖(0.017g/kg)水溶液；正常组和模型组每天灌胃蒸馏水，灌胃体积均为10ml/kg。每3天记录体重；最后，通过眼眶取血方式测定清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)值。
[0261]
(3)实验结束时进行藏红曲降血脂的药效学指标检测
[0262]
1)绘制各组体重变化曲线表，观察藏红曲对高血脂金黄地鼠体重的影响(已经检测)
[0263]
2)称量各组肝、肾、腹部脂肪、附睾脂肪的重量计算脏器系数，观察藏红曲对各脏器系数的影响。
[0264]
3)测定血清tc、tg、高密度脂蛋白(hdl
‑
c)和低密度脂蛋白(ldl
‑
c)，观察脏红曲对血脂的影响。
[0265]
4)苏木精
‑
伊红染色(he)观察肝脏组织结构，观察肝脏脂滴形成情况，判断藏红曲是否能抑制或延缓非酒精性脂肪肝的形成。
[0266]
(4)藏红曲降血脂的机制研究
[0267]
1)检测藏红曲对金黄地鼠高血脂模型肝脏代谢组学的影响，以便分析检测藏红曲降血脂作用影响的代谢通路。
[0268]
2)在降胆固醇方面的机制研究：蛋白质印记法(western
‑
blot)测定肝脏组织中与胆固醇代谢相关的蛋白表达水平。
[0269]
3)降甘油三酯方面的机制研究：蛋白质印记法(western
‑
blot)测定肝脏组织中与脂肪酸代谢相关蛋蛋白的表达水平。
[0270]
(一)、藏红曲降血脂作用的药效学研究
[0271]
1.实验材料
[0272]
1.1实验药物
[0273]
藏红曲水煎液：本发明实施例1制备得到的藏红曲(西藏月王药诊生态藏药科技有限公司)，用法用量：内服：煎汤，6
‑
12g，开水泡服：每次3g，每日2
‑
4次，或尊医嘱。
[0274]
试验以人用量9g/日，成人体重70kg计算，按体表面积法换算到金黄地鼠剂量为0.84g/kg(相当于人剂量9g/日)，以此剂量为藏红曲提取物高剂量组，藏红曲提取物低剂量组为0.42g/kg(相当于人剂量4.5g/日)。
[0275]
藏红曲提取物制备：实施例1制备得到。
[0276]
血脂康胶囊：北京北大维信生物科技有限公司，规格：0.3g*12粒/盒；用法用量：口服，一次2粒，一日2次，早晚饭后服用；轻、中度患者一日2粒，晚饭后服用。本研究作为阳性对照药以人用量1.2g/日(按照2015版药典规定洛伐他汀含量推算，1.2g血脂康胶囊含10mg洛伐他汀)，成人体重70kg计算，按体表面积法换算到金黄地鼠剂量为0.11g/kg(此剂量相当于成人每日服用洛伐他汀的量为10mg)。
[0277]
洛伐他汀胶囊：扬子江药业集团有限公司，规格：20mg；用法用量：一般始服剂量为每日20mg，晚餐时一次顿服。本研究作为阳性对照药以人用量20mg/日，成人体重70kg计算，按体表面积法换算到金黄地鼠剂量为1.87mg/kg(此剂量相当于成人每日服用洛伐他汀的量为20mg)。
[0278]
β
‑
葡聚糖：宁波千草生物科技有限公司，纯度70％。藏红曲产品含β
‑
葡聚糖量不少于1.5％，平均在2％左右，9g藏红曲中含有β
‑
葡聚糖量为0.18g，按体表面积法换算到金黄地鼠的β
‑
葡聚糖量剂量为0.017g/kg
[0279]
1.2饲料
[0280]
高脂高果糖高胆固醇造模饲料、对照饲料和地鼠维持饲料均购于南通特洛菲饲料科技有限公司，生产许可证号：苏饲证(2019)06092。
[0281]
1.3实验动物
[0282]
56只雄性spf级金黄地鼠(110
‑
130g)，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，使用许可证号scxk(京)2016
‑
0011。室内温度21
‑
24℃，12h昼夜循环，保证金黄地鼠进食饮水自由。
[0283]
2实验方法
[0284]
2.1灌胃液的配制
[0285]
0.011g/ml血脂康灌胃液：称取研磨后的血脂康0.55g，蒸馏水定容到50ml，37℃水浴加热并搅拌至完全溶解。
[0286]
0.187mg/ml洛伐他汀灌胃液：称取洛伐他汀18.7mg，蒸馏水定容到100ml，37℃水浴加热并搅拌至完全溶解。
[0287]
0.0168g/ml藏红曲高剂量灌胃液：藏红曲提取物研磨后称取0.84g，蒸馏水定容到50ml，37℃水浴加热并搅拌至完全溶解。低剂量组是在高剂量的基础上稀释一倍。
[0288]
洛伐他汀+β
‑
葡聚糖灌胃液：洛伐他汀浓度为0.187mg/ml，β
‑
葡聚糖浓度为0.0017g/ml。含β
‑
葡聚糖量为70％的β
‑
葡聚糖提取物0.12g，用0.187mg/ml洛伐他汀灌胃液定容到50ml，37℃水浴加热并搅拌至完全溶解。
[0289]
2.2造模与分组
[0290]
56只雄性spf级金黄地鼠(110
‑
130g)适应性喂养1周后，根据体重随机分为8只对照饲料喂养的空白组，40只模型饲料喂养的模型组，喂养2周。2周后禁食不禁水12h，目内眦取血，冰上静置2h后，4℃，3500r/min,15min离心分离血清。测血清中tc和tg含量，并根据tc和tg含量及体重把模型小鼠分为7组，每组8只，分别为模型组，血脂康对照组(0.11g/kg)，洛伐他汀对照组(1.87mg/kg)，藏红曲低剂量组(0.112g/kg)藏红曲高剂量组(0.224g/kg)，洛伐他汀+β葡聚糖组(1.87mg/kg+0.017g/kg)，每天灌胃1次，模型组和空白组蒸馏水灌胃，灌胃体积为10ml/kg。各组灌胃剂量与浓度如表14所示。除空白组给对照饲料，其他组均给
高脂高果糖高胆固醇造模饲料。给药期间自由饮水。药干预后，每3天称重，记录各组金黄地鼠体重变化。给药两周后，禁食不禁水12h，目内眦取血，分离血清，测血清生化指标。给药四周后禁食不禁水12h，称重后目内眦取血，测血清生化指标，并用乙醚进行麻醉后脱颈椎处死，取大肠中粪便3
‑
5粒，放于冻存管中，液氮冻存，用于微生物多样性检测。取肝脏，拍照、称重，取相同部位肝组织用4％多聚甲醛固定用于病理组织学检查，另外每个肝脏取4份肝组织放于
‑
80℃冻存，分别用于western blot,pcr，肝脏代谢组学检测，肝组织生化指标检测，每个指标检测的肝组织为相同部位的肝组织。
[0291]
表14各组小鼠给药剂量表
[0292][0293]
洛伐他汀系藏红曲及血脂康中降脂的主要活性成分，鉴于不同样品中洛伐他汀的含量不同，为客观比较，各组给药量均换算为洛伐他汀相当剂量。
[0294]
2.3脏器体重指标等测定
[0295]
给药结束后，禁食不禁水12h，称量体重用乙醚进行麻醉后脱颈椎处死后，取肝脏，腹部脂肪，附睾脂肪并分别称重。计算脏器指数和体脂率。
[0296]
脏器指数＝脏器重量/体重*100％
[0297]
体脂率＝脂肪重量/体重*100％
[0298]
2.4血清指标测定
[0299]
目内眦取血，冰上静置2h后，4℃，3500r/min,15min离心之后取上层血清分装，
‑
20℃保存，避免反复冻融，室温下复融。按照试剂说明书测定甘油三酯tg、总胆固醇tc、低密度脂蛋白胆固醇ldl
‑
c、高密度脂蛋白胆固醇hdl
‑
c、谷草转氨酶ast、谷丙转氨酶alt、超氧化物歧化酶sod、丙二醛mda
[0300]
2.5肝脏指标测定
[0301]
tg、tc、sod和mda的测定：取金黄地鼠肝脏右叶组织100mg于离心管，加入900μl预冷的生理盐水匀浆。然后在4℃下，10000r/min，离心20min，分离上清液，按照说明书测定肝脏组织中的各项指标。
[0302]
2.6肝脏组织病理学观察
[0303]
肝脏组织he染色及油红染色，观察肝脏中脂肪泡的大小与多少，采用半定量的方法对肝脏脂肪变性程度进行分级。计算肝脏脂肪病变的综合得分。
[0304]
肝脏脂肪变性分级标准
[0305]
1级：肝小叶内＜30％的肝细胞有脂肪变
[0306]
2级：肝小叶内30％
‑
50％的肝细胞有脂肪变
[0307]
3级：肝小叶内50％
‑
75％的肝细胞有脂肪变
[0308]
4级：肝小叶内＞75％的肝细胞有脂肪变
[0309]
2.7数据分析
[0310]
利用graphpad prism 6.0软件进行统计学处理，实验数据表示以mean
±
sd表示，并进行单因素方差分析(one
‑
way anova)，p<0.01或p<0.05均代表差异具有统计学意义。
[0311]
3结果
[0312]
3.1藏红曲提取物对高血脂金黄地鼠体重的影响
[0313]
实验期间，空白组精神状态良好，皮毛光滑，动作灵敏。模型组皮毛暗淡，反应稍迟钝，且活动量减少。与模型组相比，血脂康，藏红曲提取物低、高剂量组、洛伐他汀组、洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组精神状态改善，活动量增加。与空白组相比，模型组金黄地鼠体重增长迅速，血脂康组在给药后4周体重显著低于空白组，藏红曲高剂量组、洛伐他汀组、洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组体重增长趋势和空白组趋势一致，与空白组无显著差异，与模型组相比体重显著降低。
[0314]
各组体重变化曲线见图14，与空白组(normal)相比，模型组(model)小鼠自开始给药后第13天体重显著升高(p<0.05)。与模型组相比，给药第10天开始血脂康组(xzk)与藏红曲提取物高剂量组(zhq
‑
high)体重均显著性降低(p<0.05)，此趋势一致持续至给药后28天，并且体重持续低于空白组，说明血脂康组(xzk)与藏红曲提取物高剂量组可抑制金黄地鼠模型体重增长，但藏红曲提取物高剂量组与空白组体重变化一致，血脂康组与空白组相比体重显著降低(p<0.05)。藏红曲提取物低剂量组(zhq
‑
low)与模型组相比体重并没有一致呈显著性下降。洛伐他汀组(lovastatin)与洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组(lovastatin+βg)均从给药后第13天体重均显著低于模型组，与空白组体重变化趋势一致。
[0315]
图14藏红曲对高血脂模型体重曲线变化的影响
[0316]
(与空白组相比，
###
，p<0.001，
#
，p<0.05；与模型组相比，
[0317]
*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001)
[0318]
3.2藏红曲提取物对金黄地鼠血脂的影响
[0319]
3.2.1藏红曲提取物明显降低血清胆固醇(tc)水平
[0320]
与空白组(normal)相比，模型组(model)血清tc含量显著升高(p<0.001)，与模型组相比，血脂康组(xzk)，洛伐他汀组(lovastatin)，洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组(lovastatin+βg)、藏红曲低剂量组(zhq
‑
low)、高剂量组(zhq
‑
high)均有降低血清tc趋势，但血脂康组，洛伐他汀组降低tc没有显著性差异，藏红曲低、高剂量组、洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组均能明显降低血清tc含量(p<0.05)。
[0321]
值得注意的是，洛伐他汀与β
‑
葡聚糖联用可明显降低血清tc含量，表明β
‑
葡聚糖有助于洛伐他汀降低tc(即存在协同作用)，藏红曲低、高剂量组中所含洛伐他汀的量低于或等于血脂康中洛伐他汀的含量，但其可明显降低tc含量，提示藏红曲中可能还含有除洛伐他汀以外的能降低tc的成分，或系由于藏红曲中的β
‑
葡聚糖对洛伐他汀降tc的协同作用所致。(图15)
[0322]
表15藏红曲对高血脂模型血清tc的影响(n＝8，mean
±
sd)
[0323]
组别tc(μmol/l)
normal2378.64
±
70.36model3476.16
±
492.04
##
xzk3343.09
±
101.21lovastatin3491.57
±
224.76lovastatin+βg3062.44
±
201.33*zhq
‑
low2976.59
±
175.70*zhq
‑
high3094.98
±
164.54*
[0324]
图15藏红曲对高血脂模型血清tc的影响
[0325]
(与空白组相比，
###
，p<0.001；与模型组相比，*，p<0.05)
[0326]
3.2.2藏红曲提取物明显降低血清甘油三酯(tg)水平
[0327]
与空白组(normal)相比，模型组(model)血清tg含量显著升高(p<0.001)，与模型组相比，藏红曲低剂量组(zhq
‑
low)明显降低血清tg水平(p<0.05)，血脂康组(xzk)、洛伐他汀组(lovastatin)、洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组(lovastatin+βg)、藏红曲高剂量组(zhq
‑
high)均显著降低血清tg(p<0.001)。(图16)血脂康组和藏红曲高剂量组的血清tg含量最低，藏红曲低剂量组与高剂量组在降低tg水平上呈剂量依赖性。
[0328]
表16藏红曲对高血脂模型血清tg的影响(n＝8，mean
±
sd)
[0329][0330][0331]
图16藏红曲对高血脂模型血清tg的影响
[0332]
(与空白组相比，
###
，p<0.001；与模型组相比，*，p<0.05,***p<0.001)
[0333]
3.2.3藏红曲提取物明显升高血清高密度脂蛋白(hdl
‑
c)水平
[0334]
与空白组(normal)相比，模型组(model)血清hdl
‑
c含量显著下降(p<0.001)；与模型组相比，血脂康组(xzk)，洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组(lovastatin+βg)、藏红曲低剂量组(zhq
‑
low)、高剂量组(zhq
‑
high)均明显升高血清hdl
‑
c水平(p<0.05，p<0.01)，洛伐他汀组血清hdl
‑
c水平虽然有升高，但与模型组相比没有明显差异(p>0.05)，而洛伐他汀与β
‑
葡聚糖联用可以明显升高血清hdl
‑
c水平，如图3。此结果显示β
‑
葡聚糖有与洛伐他汀联用有助于升高血清hdl
‑
c水平。另外藏红曲高剂量组(含洛伐他汀相当于人的每日服用量10mg)能显著升高血清hdl
‑
c水平(p<0.01)，而洛伐他汀组(含洛伐他汀相当于人的每日服用量20mg)不
能明显提高血清hdl
‑
c水平(p＞0.05)，提示藏红曲中含有其他能升高血清hdl
‑
c水平的成分。(图17)
[0335]
表17藏红曲对高血脂模型血清hdl
‑
c的影响(n＝8，mean
±
sd)
[0336]
组别hdl(mmol/l)normal1.930
±
0.289model1.079
±
0.264###xzk1.737
±
0.510**lovastatin1.479
±
0.329lovastatin+βg2.142
±
0.670**zhq
‑
low1.670
±
0.276*zhq
‑
high1.722
±
0.537**
[0337]
图17藏红曲对高血脂模型血清hdl
‑
c的影响
[0338]
(与空白组相比，
###
，p<0.001；与模型组相比，*，p<0.05,**p<0.01)
[0339]
3.2.4藏红曲提取物明显降低血清低密度脂蛋白(ldl
‑
c)水平
[0340]
与空白组(normal)相比，模型组(model)血清ldl
‑
c含量显著上升(p<0.001)；与模型组相比，血脂康组(xzk)、洛伐他汀、洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组(lovastatin+βg)、藏红曲低剂量组(zhq
‑
low)、高剂量组(zhq
‑
high)均有降低血清ldl
‑
c水平的趋势，但是只有藏红曲高剂量组及洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组可明显降低血清ldl
‑
c水平(p<0.05，p<0.01)，血脂康组、洛伐他汀组、藏红曲低剂量组降低血清ldl
‑
c均不明显(p>0.05)。洛伐他汀、洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组(lovastatin+βg)均含有同等量的洛伐他汀，但lovastatin+βg组降ldl
‑
c的效果更好，提示洛伐他汀与β
‑
葡聚糖联用时，β
‑
葡聚糖有助于降低血清ldl
‑
c。藏红曲高剂量组与血脂康组均能降低血清ldl
‑
c水平，但藏红曲降低ldl
‑
c水平有显著性差异，两组中含洛伐他汀的量一直，提示藏红曲中可能还含有其他能降低血清ldl
‑
c水平的成分，或系藏红曲中含有的β
‑
葡聚糖对洛伐他汀降ldl
‑
c的协同作用所致。(图18)
[0341]
表18藏红曲对高血脂模型血清ldl
‑
c的影响(n＝8，mean
±
sd)
[0342][0343][0344]
图18藏红曲对高血脂模型血清ldl
‑
c的影响
[0345]
(与空白组相比，
###
，p<0.001；与模型组相比，*，p<0.05,**p<0.01)
[0346]
3.3藏红曲提取物对高血脂模型肝脏的影响
[0347]
藏红曲提取物高剂量组及血脂康组可明显抑制高血脂金黄地鼠体重增长，同时抑制肝脏肿大(p<0.05，p<0.01)，如表8。各组动物解剖后，肉眼观察肝脏外观形态显示：空白组肝脏无异常变化，肝脏红褐色，质地柔韧，弹性好，被膜光滑，边缘薄。模型组肝脏外观呈淡黄色，体积增大，表面有沙粒样改变，弹性差，被膜紧张，边缘钝。与模型组相比给药组肝脏颜色，质地，弹性均有改变。从肝脏外观看，模型组呈淡红色，体积增大，推测模型组可能由高血脂症发展为脂肪肝，此需要进一步的病理切片进行病理观察进一步验证，而藏红曲组提取物组肝脏外观颜色比模型组有所改善，肝体积减小。
[0348]
藏红曲提取物高剂量组及血脂康组可明显降低肝脏指数。与空白组(normal)相比，模型组(model)肝脏指数明显上升(p<0.001)；与模型组相比，血脂康组(xzk)、洛伐他汀组、洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组(lovastatin+βg)、藏红曲低剂量组(zhq
‑
l)、高剂量组(zhq
‑
h)的肝脏指数均有降低趋势，其中血脂康组、藏红曲高剂量组可明显降低肝脏指数(p<0.05)。(图19，表19)
[0349]
图19藏红曲对高血脂模型肝脏指数的影响
[0350]
(与空白组相比，
###
，p<0.001；与模型组相比，*，p<0.05)
[0351]
表19藏红曲对体重、肝重、肝脏系数的影响(mean
±
sd,n＝8)
[0352][0353]
(注：与空白组相比，
###
，p<0.001；与模型组相比，*，p<0.05,**p<0.01。)
[0354]
3.4藏红曲提取物对高血脂模型腹部脂肪及附睾脂肪的影响
[0355]
藏红曲提取物不仅可以减轻体重，还可以抑制腹部脂肪及附睾脂肪沉积(表20、21，图20、21)。与空白组相比，模型组的腹部脂肪重量显著升高(p<0.05)(图20、表16)，附睾脂肪重量虽无显著性变化(p＞0.05)，但有升高趋势(图21、表17)。给药组血脂康组、藏红曲提取物高剂量组的腹部脂肪指数和附睾脂肪指数均低于模型组，但无显著意义。其在降脂的同时可能具有减肥抑制脂肪沉积的作用，但是可能给药时间较短，其减肥降脂的作用还未达到明显差异。
[0356]
表20藏红曲对体重、腹部脂肪、腹部脂肪系数的影响(mean
±
sd，n＝8)
[0357][0358]
注：与空白组相比，
#
，p<0.05；与模型组相比，*，p<0.05,**p<0.01
[0359]
表21藏红曲对体重、附睾脂肪、附睾脂肪系数的影响(mean
±
sd,n＝8)
[0360][0361]
注：与空白组相比，
#
，p<0.05；与模型组相比，*，p<0.05,**p<0.01。
[0362]
图20藏红曲提取物对高血脂金黄地鼠腹部脂肪的影响
[0363]
图21藏红曲提取物对高血脂金黄地鼠附睾脂肪的影响
[0364]
3.5藏红曲提取物对金黄地鼠肝组织病理形态的影响
[0365]
he染色结果显示：空白组(normal)金黄地鼠肝组织着色均匀，肝细胞形态结构正常，未见肝细胞脂肪变性。高脂模型组(model)金黄地鼠肝小叶内可见肝组织内可见大量大小不等的脂滴空泡，肝小叶结构紊乱；血脂康组(xzk)及洛伐他汀组(lovastatin)金黄地鼠可见轻度的肝细胞脂肪变性，肝细胞内有散在空泡现象，肝细胞较模型组均排列整齐，脂肪变性程度比模型组有较大改善；洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组(lovastatin+βg)、藏红曲低剂量组(zhq
‑
l)及高剂量组(zhq
‑
h)有肝组织脂肪变性、肝细胞肿胀的程度较模型组均明显改善，肝细胞的数量相对增多，趋于正常细胞。藏红曲低、高剂量组、洛伐他汀+β葡聚糖组与阳性药对照组(血脂康组、洛伐他汀组)在病理改变上未有较大差异，均具有较好的抑制肝细胞脂肪变性的作用，因此藏红曲低、高剂量组均有较好的抑制高血脂金黄地鼠脂肪肝形成的作用。
[0366]
图22藏红曲提取物对金黄地鼠肝组织病理形态的影响(x200)
[0367]
4结论
[0368]
以高脂高胆固醇饲料喂养金黄地鼠，成功地在较短时间内形成了稳定的高血脂模型。高脂饲料喂养接近人类的饮食状态,该模型符合人类高血脂的形成过程。另金黄地鼠肝外合成比例约为85％，肝内合成较少，而人的内源性胆固醇约有10％是肝内合成的，因此金黄地鼠的这一高血脂形成特点及对他汀类药物的敏感性与临床上人的高血脂症相一致。
[0369]
由于人类胆固醇肝内合成较少这一特点，因此推测临床上应用的他汀类降脂药具
有其局限性，因为他汀类降脂药对hmg
‑
coa还原酶有竞争性抑制作用，而hmg
‑
coa还原酶是肝细胞合成胆固醇过程中的限速酶,在胆固醇合成过程中,hmg
‑
coa还原酶催化hmg
‑
coa转换成中间产物甲羟戊酸(mva),mva是内源性胆固醇合成的关键步骤,他汀类药物与hmg
‑
coa的化学结构相似,且和hmg
‑
coa还原酶的亲和力要比hmg
‑
coa高数千倍,对该酶发生竞争性抑制作用,可使肝脏合成胆固醇受到抑制,从而降低血清胆固醇。但是hmg
‑
coa还原酶并不参与胆固醇的肝外合成过程,因此他汀类药物对肝外合成胆固醇影响较小。实验结果显示洛伐他汀单独应用并没有显示较好的降低血清胆固醇的作用，而洛伐他汀+β葡聚糖组、藏红曲高低剂量组和藏红曲高剂量组虽有明显的降脂作用，但仅降低11％的胆固醇。
[0370]
由胆固醇的降脂机制及血清胆固醇的实验结果可分析出两点：
[0371]
①
实验结果中洛伐他汀几乎没有降脂作用可以理解，因为模型组与给药组均在持续饲喂高脂高胆固醇饲料，持续性摄入外源性胆固醇，而胆固醇的降脂作用主要是抑制肝内胆固醇的合成。
[0372]
②
洛伐他汀+β葡聚糖组、藏红曲高低剂量组和藏红曲高剂量组虽有明显的降脂作用，但仅降低11％左右的胆固醇，对照但用洛伐他汀组无降低胆固醇作用，推测藏红曲中含有降低外源性胆固醇的成分，也可能是β
‑
葡聚糖在发挥作用。
[0373]
另外从结果部分可的出以下结论：藏红曲提取物能明显改善金黄地鼠高血脂模型的血脂指标，并能抑制高血脂模型体重曲线上升，使之和空白组体重曲线趋于一致，同时可降低肝脏指数，抑制脂肪沉积形成。藏红曲提取物在降血脂方面有以下优点：
[0374]
①
藏红曲已明确含有洛伐他汀和β
‑
葡聚糖，本研究结果显示β
‑
葡聚糖有助于降低血清tc、ldl
‑
c并升高血清hdl
‑
c水平；
[0375]
②
藏红曲低、高剂量组在含有洛伐他汀量相对低于洛伐他汀组的情况下，能仍然可以改善血清tc、tg、hdl
‑
c及ldl
‑
c指标，并且藏红曲高剂量组在降tc及ldl
‑
c方面效果优于血脂康和洛伐他汀组，推测藏红曲中可能含有其他有助于降低血脂的成分还未被发现。
[0376]
③
藏红曲高剂量组可抑制金黄地鼠高血脂模型的体重增加，减少腹部脂肪和附睾脂肪沉积。
[0377]
④
藏红曲低、高剂量组均可抑制高血脂金黄地鼠的脂肪肝形成。
[0378]
(二)、藏红曲降血脂作用的代谢组学研究
[0379]
1.材料
[0380]
同“一、藏红曲降血脂作用的药效学研究1.实验材料”。
[0381]
各组的肝组织样本，每组6个样本，取材后迅速用液氮冷冻备用。
[0382]
2.方法
[0383]
2.1灌胃液的配制
[0384]
同“一、藏红曲降血脂作用的药效学研究2.1灌胃液的配制”[0385]
2.2造模与分组
[0386]
同“藏红曲降血脂作用的药效学研究2.2”[0387]
2.3代谢组学检测背景
[0388]
利用lc
‑
ms平台样本中所有小分子代谢物同时进行检测分析，通过组间比较，从而挖掘代谢谱差异，找出差异代谢物，代谢通路。
[0389]
2.4代谢组学检测流程
[0390]
样本前处理:代谢物提取
[0391]
lg/ms分析信息提取:去躁平滑，基线校正，重叠峰识别
[0392]
数据预处理:归—化，数据转换，标准化
[0393]
模式识别:多元统计分析(pca，pls
‑
da,opls
‑
da)
[0394]
差异代谢物分析:多种算法vip值分析，相关性分析，统计
[0395]
功能分析:keg通路分析
[0396]
图23代谢组学检测流程
[0397]
2.5分析用软件信息
[0398]
表22分析用软件信息
[0399][0400]
3结果
[0401]
3.1肝脏代谢物pca分析及聚类分析结果
[0402]
对金黄地鼠肝脏代谢物进行pca分析，样本通过降维分析后，在主成分p1，p2上有相对坐标点，各个坐标点的距离代表了样本间聚集和离散程度，正常对照组与模型组及其他给药组均有组间分离趋势，在95％的置信度下无异常点出现。给药组之间有重叠部分，如：洛伐他汀+β
‑
葡聚糖组(lovastatin+βg)、藏红曲低剂量组(zhq
‑
l)及高剂量组(zhq
‑
h)有较大重叠，血脂康组(xzk)及洛伐他汀组(lovastatin)重叠较多，组与组之间有重叠的说明其代谢物存在相似性(图24)。这种趋势在代谢物聚类分析中也可明显看出(图2.3)，lovastatin+βg组、zhq
‑
l组与zhq
‑
h组聚类集在一起，xzk组与lovastatin组聚类在一起，聚类在一起的组别说明其代谢物表达模式接近。五个给药组中给药的成分均有洛伐他汀，不同的是lovastatin+βg组含有β
‑
葡聚糖组、zhq
‑
l组与zhq
‑
h组均是藏红曲提取物组，也含有β
‑
葡聚糖组；xzk组与lovastatin组聚在一起可能与他们都含有洛伐他汀有关。因此推测，五个给药组分成两个聚类可能与β
‑
葡聚糖有关。
[0403]
图24金黄地鼠肝脏代谢物pca分析
[0404]
注：pca得分图。样本通过降维分析后，在主成分p1，p2上有相对坐标点，各个坐标
processing)，环境信息处理(environmental information processing)，细胞过程(cellular processes)，生物体系统(organismal systems)，人类疾病(human diseases)，药物开发(drugdevelopment)。条形的颜色表示不同代谢途径类别。
[0418]
图29 kegg通路富集结果
[0419]
注：横坐标表示pathway name，纵坐标表示富集率，比值越大，表示富集的程度越大。柱子颜色梯度表示富集的显著性，默认颜色越深，代表该keggterm越显著富集，其中pvalue或fdr<0.001的标记为***，pvalue或fdr<0.01的标记为**。
[0420]
图30 ppar signaling pathway
[0421]
3.4药物对ppar signaling pathway中蛋白的影响
[0422]
从代谢物的的功能通路富集结果可知，参与ppar signaling pathway的物质是类二十烷酸(eicosanoid)，类二十烷酸也称类花生酸，eicosanoid参与pparα，pparγ影响的代谢通路，影响脂质代谢，包括胆固醇代谢及脂肪酸氧化等，我们对胆固醇代谢及脂肪酸氧化相关的蛋白进行western blot验证。如检测肝组织中ppar signaling pathway上的pparα、cyp7a1及cpt1a的表达情况。
[0423]
western blot检测结果显示，与模型组相比藏红曲低、高剂量组、洛伐他汀组、洛伐他汀+β葡聚糖组均能上调pparα及cpt
‑
1的表达(图31)，进而促进脂质氧化，调节脂质的利用与储存，使脂代谢处于平衡。同时与模型组相比藏红曲低、高剂量组、洛伐他汀组、洛伐他汀+β葡聚糖组均能上调cyp7a1表达(图32)，cyp7a1是催化胆固醇分解代谢和胆汁酸生物合成中的限速步酶，对胆固醇稳态很重要。
[0424]
图31藏红曲提取物对pparα、cyp7a1及cpt
‑
1蛋白的影响
[0425]
4总结
[0426]
通过对各组肝脏的代谢物分析发现，脂类代谢物质比较多，对代谢物进行kegg通路富集发现富集程度在top 20的通路富集率最高且具有显著性的的通路为ppar signaling pathway，ppar signaling pathway与脂质代谢及氧化有关，ppar signaling pathway通路中有pparα、cpt
‑
1及cyp7a1影响脂肪酸氧化及胆固醇代谢的蛋白。
[0427]
pparα是过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators activated receptors，ppars)中的一个亚型，当ppar
‑
α基因表达升高时，过氧化物酶体β
‑
氧化限速酶acox
‑
1的表达增强，直接增强细胞色素p450酶的活性促进微粒体ω
‑
氧化，促进肝脏对脂质的利用。同时pparα调节线粒体膜外的肉碱棕榈酰转移酶
‑
1(cpt
‑
1)控制脂肪酸在线粒体膜上转运，催化β
‑
氧化的限速步骤，进而调节脂质的利用与储存，使脂代谢处于平衡。cyp7a1通过在胆固醇的7位引入亲水性部分，催化胆固醇分解代谢和胆汁酸生物合成中的限速步骤，对胆固醇稳态很重要。目前发现藏红曲可上调pparα表达，而pparα可能通过调节acsl、cpt
‑
1、acox1、cyp7a1促进脂肪酸代谢和促进胆固醇排泄(图32)。已证实的有藏红曲可以上调cpt
‑
1及cyp7a1。
[0428]
图32 pparαsignaling pathway
[0429]
从目前的结果可以看出藏红曲提取物通过上调pparα，进而上调cpt1促进脂肪酸代谢，上调cyp7a1促进胆固醇代谢起到降脂作用，但洛伐他汀和血脂康对cpt
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1及cyp7a1也有调节作用，这种降脂机制并不能区分藏红曲提取物与血脂康和洛伐他汀的优劣。但从药效上推测出可能藏红曲还存在其他方面的降脂机制。
[0430]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。