皂苷在制备抗牛支原体产品中的应用

1.本发明属于抗牛支原体药物技术领域，具体涉及皂苷类化合物在制备抗牛支原体产品中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.牛支原体(mycoplasma bovis)是引起犊牛肺炎和关节炎以及成牛乳腺炎等多种症状的重要病原体之一。自1961年，hale等人首次从美国乳汁中分离得到牛支原体后，世界各地陆续分离到牛支原体。2008年，我国首次在肉牛中暴发牛支原体肺炎疫情，此后相继在湖北、贵州、宁夏、内蒙古、广西、重庆等地区的转运犊牛中发现该病，发病率为50％～100％，病死率高达10％
‑
50％，给我国养牛业造成了巨大的经济损失。
4.牛支原体是一种最小的有细胞结核的微生物，介于细菌和病毒之间，但无细胞壁，属于原核生物。支原体广泛分布于污水、土壤、动物和人体中。牛支原体对外界抵抗力很强，在肥料中可存活230天左右，在水中可存活22天左右，在垫沙中可存活长达8个月。目前，国内外尚无有效的牛支原体疫苗，防控形势严峻。相比细菌而言，由于牛支原体无细胞壁结构，这使得多数常用的广谱抗生素对它们无效，仅有几种抗生素可用于临床感染牛的治疗。一旦产生耐药性，牧场就面临无药可用，只能采取淘汰牛只的方式来控制疫病，造成较大的经济损失。针对该现状，开发和筛选具有抑制牛支原体活性的化合物有望实现对牛支原体病的防治，降低养牛业的经济损失。
5.茶皂素(tea saponin)是从山茶科植物的种子中提取的一种糖式化合物，它属皂素类，是一种天然非离子型表面活性剂。茶皂素具有良好的乳化、分散、发泡、湿润等功能，并且具有消炎、镇痛，抗渗透等药理作用。茶皂素产品为淡黄色的微细粉末，广泛应用于洗涤，毛纺、针织、医药、日用化工行业等生产。在固体型农药中作为湿润剂和悬浮剂，在乳油型农药中作为增效剂与展着剂，也可直接作为生物农药。但对于该药物的其他用途特别是对牛支原体作用效果尚未有人研究。
6.七叶皂苷钠(escin)，分子式为c
55
h
83
nao
23
，是一种白色结晶性粉末，味苦涩而辣，具引湿性。具有消炎、抗渗出、增加静脉张力、改善血液循环以及纠正脑功能失常等作用。对一氧化碳等引起脑水肿具有明显的保护作用。可用于治疗脑水肿、创伤或手术所致肿胀，也用于静脉回流障碍性疾病。但对于该药物的其他用途特别是对牛支原体作用效果尚未有人研究。
7.薯蓣皂苷(dioscin)是薯蓣科植物中的主要成分。传统中医学认为，薯蓣具有祛痰、消食利水、舒筋活血、截疟等功效。现代药理学研究显示薯蓣皂苷有众多药理学作用，特别在抗肿瘤作用方面研究甚多。许多研究也显示薯蓣皂苷具有改善动脉粥样硬化症状和保护血管内皮功能、减少心脑肾的缺血/再灌注损伤、降低血糖、抑制肝脏纤维化、改善更年期
的骨质疏松、缓解类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎病症、拮抗病菌和牛支原体活性。迄今尚未有关于其用于预防和治疗牛支原体的报道。


技术实现要素：

8.基于上述研究背景，本发明目的在于筛选具有抑制牛支原体活性的化合物，从而提供治疗牛支原体疾病的有效药物。为了实现该技术目的，本发明联想到从天然药物提取物中筛选活性化合物，并首次验证了茶皂素、七叶皂苷钠及薯蓣皂苷等多种皂苷类成分能够有效抑制牛支原体的体外增殖，并且上述活性成分对机体的危害程度较小，具有开发成抗牛支原体药物的前景。
9.针对上述技术效果，本发明主要提供了皂苷在制备抗牛支原体产品中的应用。
10.具体的，本发明具体验证了茶皂素、七叶皂苷钠及薯蓣皂苷在制备所述抗牛支原体产品中的应用。
11.现有技术中，茶皂素通常作为表面活性剂添加至生物农药中，在药用价值方面，茶皂素主要用于改善毛细血管通透性，还可用于改善血糖、血压情况。本发明提供了化合物茶皂素在抑制牛支原体的增殖方面的应用，经实验证明，茶皂素对mdbk细胞的半数毒性浓度(cc
50
)为937.5μm，而对牛支原体的半数有效浓度(ec
50
)为97.66μm；茶皂素对牛支原体的治疗指数为9.60。
12.七叶皂苷钠是临床常用的脑血管疾病治疗药物，用于脑血管扩张，改善静脉张力，加快静脉回流等。本发明首次证实化合物七叶皂苷钠能够有效抑制牛支原体的增殖，经实验证明，七叶皂苷钠对mdbk细胞的半数毒性浓度(cc
50
)为703.13μm，而对牛支原体的半数有效浓度(ec
50
)为24.41μm；七叶皂苷钠对牛支原体的治疗指数为28.80。该结果显示七叶皂苷钠具有开发成抗牛支原体药物的前景，为七叶皂苷钠提供了新的医药用途。
13.薯蓣皂苷是生产甾体激素类药物的重要基础原料。甾体激素具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克的药理作用，是治疗风湿、心血管、淋巴白血病、细胞性脑炎、皮肤病、抗肿瘤和抢救危重病人的重要用药。除此之外，薯蓣皂苷的药理活性众多，但主要集中于抗肿瘤活性的研究。本发明首次提供了薯蓣皂苷在支原体抑制方面的活性，提供了其在兽药领域的应用，经验证，薯蓣皂苷对mdbk细胞的半数毒性浓度(cc
50
)为31.25μm，而对牛支原体的半数有效浓度(ec
50
)为3.25μm；薯蓣皂苷对牛支原体的治疗指数为9.62。
14.本发明验证了薯蓣皂苷在对牛支原体的抑制作用，且对细胞的毒性较小，该结果为薯蓣皂苷开辟了新的药物用途。
15.以上一个或多个技术方案的有益效果在于：
16.本发明首次提供了茶皂素、七叶皂苷钠及薯蓣皂苷体外抑制牛支原体增殖的活性，基于该研究结果，本发明进一步扩展了上述化合物的医药用途。另外，本领域针对牛支原体的防治手段十分有限，本发明的研究结果可能为抗牛支原体活性成分的开发提供了一定的技术指引；上述化合物对正常细胞的毒性较小，开发成为抗牛支原体药物具有重要意义。
附图说明
17.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示
意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
18.图1为实施例1中茶皂素抗牛支原体损伤细胞的作用图；
19.其中，图1左为mdbk正常细胞组；图1中为mdbk感染牛支原体对照组；图1右为感染细胞药物试验组(使用200μm茶皂素)；
20.图2为实施例1中茶皂素对mdbk细胞的半数细胞毒性浓度(cc
50
)图；
21.图3为实施例1中茶皂素对牛支原体的半数有效浓度(ec
50
)图；
22.图4为实施例2中七叶皂苷钠抗牛支原体损伤细胞的作用图；
23.其中：其中图4左图为mdbk正常细胞组；图4中图为mdbk感染牛支原体对照组；图4右图为感染细胞药物试验组(施用50μm七叶皂苷钠)；
24.图5为实施例2中七叶皂苷钠对mdbk细胞的半数细胞毒性浓度(cc
50
)图；
25.图6为实施例2中七叶皂苷钠对牛支原体的半数有效浓度(ec
50
)图；
26.图7为实施例3中薯蓣皂苷抗牛支原体损伤细胞的作用图；
27.其中，图7左为mdbk正常细胞组；图7中为mdbk感染牛支原体对照组；图7右为感染细胞药物试验组(施用40μm薯蓣皂苷)；
28.图8为实施例3中薯蓣皂苷对mdbk细胞的半数细胞毒性浓度(cc
50
)图；
29.图9为实施例3中薯蓣皂苷对牛支原体的半数有效浓度(ec
50
)图。
具体实施方式
30.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
31.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
32.术语解释：
[0033]“预防和/或治疗”：表示任一适用于治疗牛支原体相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗。
[0034]“抗牛支原体药物”表示一种物质，其对牛支原体具有明显的抑制作用，其直接作用于牛支原体的早期阶段，且其对牛支原体的直接杀灭作用好于吸附阻断作用和复制阻断作用。
[0035]
正如背景技术所介绍的，牛支原体是威胁牛养殖业的重要因素，目前本领域可用于牛支原体的药物十分有限，为了解决如上的技术问题，本发明提供了皂苷类化合物在制备抗牛支原体产品中的应用。
[0036]
本发明第一方面，提供皂苷在制备抗牛支原体产品中的应用。
[0037]
第一方面所述皂苷按皂苷配基的结构分类，包括螺旋甾烷类和三萜皂苷。
[0038]
本发明优选的方案中，所述三萜皂苷包括但不限于甘草皂苷、人参皂苷、三七皂苷、茶皂素、七叶皂苷中的一种；所述螺旋甾烷类皂苷的具体实例如薯蓣皂苷。
[0039]
本发明的一种实施方式中，提供茶皂素在制备抗牛支原体产品中的应用。
[0040]
本发明所述茶皂素，包括茶叶皂素及茶籽皂素(cas no.：8047
‑
15
‑
2)，应当明确的是，本领域所称的茶皂素以茶叶、茶籽、皂树皮等为原料通过水提醇沉等方式进行提取得到，为一种混合物，其中主要发挥茶皂素药理活性的成分结构如下式ⅰ所示：
[0041][0042]
应当说明的是，本发明所述茶皂素并不局限于上述结构所代表的纯品化合物，市面上可购买得到的茶皂素(纯度为10～70％)均可实现本发明所述效果，可用于相关抗牛支原体产品的开发。
[0043]
本发明的又一种实施方式中，提供七叶皂苷在制备抗牛支原体产品中的应用。
[0044]
七叶皂苷是娑罗子提取物中的主要活性成分，由于七叶皂苷不溶于水，本领域常用其钠盐形式，即七叶皂苷钠(cas no.：6805
‑
41
‑
0)，结构如下式ⅱ所示。因此，本发明更为具体的实施方式中，还提供七叶皂苷钠在制备抗牛支原体产品中的应用。
[0045][0046]
本发明又一种实施方式中，提供薯蓣皂苷在制备抗牛支原体产品中的应用。
[0047]
薯蓣皂苷是薯蓣科植物中的主要成分，其化学结构式如下式ⅲ所示。
[0048][0049]
上述实施方式中，所述茶皂素、七叶皂苷及薯蓣皂苷还包括其药学上可接受的盐，所述药学上可接受的盐包括茶皂素、七叶皂苷或薯蓣皂苷与无机酸或有机酸形成的盐；具体的实例中，所述无机酸为盐酸、硫酸、硝酸或氢溴酸；所述有机酸为甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸。
[0050]
还应当理解的是，第一方面所述抗牛支原体产品，用于预防和/或治疗与牛支原体相关的疾病，所述产品形式包括但不限于兽用药物、饲料或生化试剂中的一种。
[0051]
进一步的，所述兽用药物包括血清制品、疫苗、诊断制品、微生态制品、中药材、中成药、化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品、外用杀虫剂或消毒剂。
[0052]
进一步的，所述饲料包括全价饲料、浓缩饲料、预混饲料、精饲料或混合饲料。
[0053]
进一步的，所述生化试剂包括用于诊断及生化研究的试剂，具体应用形式包括诊断试剂、抗牛支原体活性成分的筛选试剂等。
[0054]
本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中，至少包括茶皂素、七叶皂苷钠或薯蓣皂苷中的一种或几种的组合。
[0055]
第一方面所述药物组合物中，所述茶皂素、七叶皂苷钠或薯蓣皂苷的药物剂量可
通过本领域常规方式进行确定，所述常规方式可以是借助上述成分的半数有效浓度及动物模型实验结果进行确定。
[0056]
优选的，所述药物组合物中，还包括药学上所必需的载体，所述载体包括赋形剂和/或稀释剂。例如药学上相容的无机或有机酸或碱、聚合物、共聚物、嵌段共聚物、单糖、多糖、离子和非离子型表面活性剂或脂质，还包括药理上无害的盐(例如氯化钠、调味剂)、维生素(例如维生素a或维生素e)、生育酚或抗氧化剂(例如抗坏血酸)、用于延长药物活性成分或配方的使用和保存时间的稳定剂和/或防腐剂，或其它现有技术中公知的常用非药物活性成分或助剂和添加剂及其混合物。
[0057]
本发明第三方面，提供一种用于防治牛支原体疾病的药物，所述药物中包括第二方面所述组合物。
[0058]
优选的，所述药物为口服制剂、外用药物或注射剂形式；进一步的，所述口服制剂包括口服固体制剂或口服液体制剂；
[0059]
具体的，所述口服固体制剂包括但不限于散剂、可溶性粉剂、预混剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、膏剂、糊剂型等；
[0060]
具体的，所述口服液体制剂包括但不限于水剂、酊剂、煎剂、合剂中的一种；
[0061]
具体的，所述外用药物包括但不限于气雾剂、浇淋剂或滴喷剂。
[0062]
进一步的，所述注射剂包括但不限于粉针剂、大输液、混悬液、乳浊液、水针或油针制剂，注射形式包括但不限于肌肉、皮下、皮内或静脉注射。
[0063]
本发明第四方面，提供一种防治牛支原体相关疾病的方法，所述防治方法包括对有需要的个体施用第二方面所述药物组合物或第三方面所述药物。
[0064]
上述第四方面中，“有需要的个体”包括哺乳动物，优选小鼠、大鼠或其他啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、羊、马或灵长类动物，其中，优选为牛。
[0065]
一种实施方式中，所述施用方式包括但不限于将所述药物组合物或药物添加至所述牛的饮食饮水的中进行给药，还包括采用所述药物组合物或药物对牛的养殖环境进行消杀。
[0066]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
[0067]
实施例1茶皂素抑制牛支原体效果验证
[0068]
一、茶皂素对mdbk细胞的毒性实验：
[0069]
mdbk细胞是牛支原体的易感细胞。因此，首先检测茶皂素对mdbk细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：
[0070]
(1)在96孔板内接种100μl细胞(mdbk 5000个/孔)。
[0071]
(2)培养约12h后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μl含不同药物浓度的2％fbs dmem，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μl含0.9％dmso的2％fbs dmem培养基。调零孔：不铺细胞。
[0072]
(3)在37℃，5％co2条件下培养48h后，弃去孔内的培养基。用100μl pbs洗涤两遍，排除药物对cck8反应的影响。每孔再补加100μl dmem培养基+10μl cck8溶液。
[0073]
(4)37℃，5％co2条件下继续培养4h后，在450nm测定吸光值。将未处理的细胞的450nm设为100％细胞对照。
[0074]
(5)上述试验重复三次，利用graphpad prism5软件分析数据，计算茶皂素的半数细胞毒性浓度(cc
50
)值。试验结果表明，茶皂素出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定茶皂素半数中毒浓度(cc
50
)为937.5μm。
[0075]
二、茶皂素对牛支原体的抑制实验：
[0076]
(1)在96孔板的每个孔中接种1
×
104个mdbk细胞，37℃，5％co2培养箱中过夜培养至细胞长满；
[0077]
(2)弃去培养基，每孔加入100μl 100tcid
50
的牛支原体稀释液(用2％fbs dmem配置牛支原体稀释液)，按照50μm初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％co2培养箱中培养；
[0078]
(3)48h后按cck
‑
8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的od值；
[0079]
(4)上述试验重复三次，进行数据统计分析。牛支原体抑制率(％)＝(药物处理组450nm od值
‑
牛支原体对照组450nm od值)/(正常细胞对照组450nm od值
‑
牛支原体对照组450nm od值)
×
100％，用graphpad prism5软件得茶皂素的半数有效浓度(ec
50
)值。其结果如图3所示。然后按公式ti＝cc
50
/ec
50
，计算相应的治疗指数ti值。
[0080]
结果：通过cck
‑
8试剂盒检测细胞活力，可以计算出药物对牛支原体的有效抑制率。从结果可以看出，茶皂素在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对牛支原体的半数有效浓度(ec
50
)为97.66μm。结合mdbk细胞的毒性实验结果，茶皂素半数中毒浓度(cc
50
)为937.5μm，计算可知牛支原体的治疗指数为9.60。
[0081]
实施例2七叶皂苷钠抑制牛支原体效果验证
[0082]
一、七叶皂苷钠对mdbk细胞的毒性实验：
[0083]
首先检测七叶皂苷钠对mdbk细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：
[0084]
(1)在96孔板内接种100μl细胞(mdbk 5000个/孔)。
[0085]
(2)培养约12h后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μl含不同药物浓度的2％fbs dmem，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μl含0.9％dmso的2％fbs dmem培养基。调零孔：不铺细胞。
[0086]
(3)在37℃，5％co2条件下培养48h后，弃去孔内的培养基。用100μl pbs洗涤两遍，排除药物对cck8反应的影响。每孔再补加100μl dmem培养基+10μl cck8溶液。
[0087]
(4)37℃，5％co2条件下继续培养4h后，在450nm测定吸光值。将未处理的细胞的450nm设为100％细胞对照。
[0088]
(6)上述试验重复三次，利用graphpad prism5软件分析数据，计算七叶皂苷钠的半数细胞毒性浓度(cc
50
)值。试验结果表明，七叶皂苷钠出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定七叶皂苷钠半数中毒浓度(cc
50
)为703.13μm。
[0089]
二、七叶皂苷钠对牛支原体的抑制实验：
[0090]
(1)在96孔板的每个孔中接种1
×
104个mdbk细胞，37℃，5％co2培养箱中过夜培养至细胞长满；
[0091]
(2)弃去培养基，每孔加入100μl 100tcid
50
的牛支原体稀释液(用2％fbs dmem配置牛支原体稀释液)，按照50μm初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％co2培养箱中培养；
[0092]
(3)48h后按cck
‑
8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的od值；
[0093]
(4)上述试验重复三次，进行数据统计分析。牛支原体抑制率(％)＝(药物处理组450nm od值
‑
牛支原体对照组450nm od值)/(正常细胞对照组450nm od值
‑
牛支原体对照组450nm od值)
×
100％，用graphpad prism5软件得七叶皂苷钠的半数有效浓度(ec
50
)值。其结果如图6所示。然后按公式ti＝cc
50
/ec
50
，计算相应的治疗指数ti值。
[0094]
结果：通过cck
‑
8试剂盒检测细胞活力,可以计算出药物对牛支原体的有效抑制率。从结果可以看出，七叶皂苷钠在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对牛支原体的半数有效浓度(ec
50
)为24.41μm。结合mdbk细胞的毒性实验结果，七叶皂苷钠半数中毒浓度(cc
50
)为703.13μm，计算可知牛支原体的治疗指数为28.80。
[0095]
实施例3薯蓣皂苷抑制牛支原体效果验证
[0096]
一、薯蓣皂苷对mdbk细胞的毒性实验：
[0097]
首先检测薯蓣皂苷对mdbk细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：
[0098]
(1)在96孔板内接种100μl细胞(mdbk 5000个/孔)。
[0099]
(2)培养约12h后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μl含不同药物浓度的2％fbs dmem，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μl含0.9％dmso的2％fbs dmem培养基。调零孔：不铺细胞。
[0100]
(3)在37℃，5％co2条件下培养48h后，弃去孔内的培养基。用100μl pbs洗涤两遍，排除药物对cck8反应的影响。每孔再补加100μl dmem培养基+10μl cck8溶液。
[0101]
(4)37℃，5％co2条件下继续培养4h后，在450nm测定吸光值。将未处理的细胞的450nm设为100％细胞对照。
[0102]
(7)上述试验重复三次，利用graphpad prism5软件分析数据，计算薯蓣皂苷的半数细胞毒性浓度(cc
50
)值。其结果如图8所示。
[0103]
结果：薯蓣皂苷出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定薯蓣皂苷半数中毒浓度(cc
50
)为31.25μm。
[0104]
二、薯蓣皂苷对牛支原体的抑制实验：
[0105]
(1)在96孔板的每个孔中接种1
×
104个mdbk细胞，37℃，5％co2培养箱中过夜培养至细胞长满；
[0106]
(2)弃去培养基，每孔加入100μl 100tcid
50
的牛支原体稀释液(用2％fbs dmem配置牛支原体稀释液)，按照50μm初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％co2培养箱中培养；
[0107]
(3)48h后按cck
‑
8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的od值；
[0108]
(4)上述试验重复三次，进行数据统计分析。牛支原体抑制率(％)＝(药物处理组450nm od值
‑
牛支原体对照组450nm od值)/(正常细胞对照组450nm od值
‑
牛支原体对照组450nm od值)
×
100％，用graphpad prism5软件得薯蓣皂苷的半数有效浓度(ec
50
)值。其结果如图9所示。然后按公式ti＝cc
50
/ec
50
，计算相应的治疗指数ti值。
[0109]
结果：通过cck
‑
8试剂盒检测细胞活力，可以计算出药物对牛支原体的有效抑制率。从结果可以看出，薯蓣皂苷在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对牛支原体的半数有效浓度(ec
50
)为3.25μm。结合mdbk细胞毒实验结果，薯蓣皂苷半数中毒浓度(cc
50
)为31.25μm，计算可知牛支原体的治疗指数为9.62。
[0110]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。