一种植物提取物在制备KRASG12C突变蛋白抑制剂药物中的应用的制作方法

一种植物提取物在制备kras g12c突变蛋白抑制剂药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种植物提取物在制备kras g12c突变蛋白抑制剂药物中的应用。


背景技术：

2.kirsten大鼠肉瘤病毒基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene，kras)的突变在人类癌症中非常常见，在几种较流行的癌症如胰腺癌、结直肠癌、肺腺癌中， kras的突变率分别达到了61％、43％和26％。kras g12c突变是kras主要的突变类型之一，也是一个重要的肿瘤发生致癌因子。在大约13％的肺癌和3％的结直肠癌中均发现了kras g12c突变，特别是在非小细胞肺腺癌中，这个数字达到了20％以上。根据耶鲁癌症中心的最新统计，全球每年约有20万携带 kras g12c突变的肺癌患者死亡。
3.然而由于kras表面并没有可以直接靶向的“口袋”，且和gtp结合的亲和力达到皮摩尔量级，很难设计出一种能够在血液中与gtp竞争结合kras的可逆小分子抑制剂。kras抑制剂的突破出现于2019年nature杂志公布的 amg-510小分子。amg-510以共价结合的方式与kras g12c的获得性半胱氨酸发生迈克尔加成反应，提高了对kras突变蛋白的选择性。目前有七款在临床实验中的kras g12c共价小分子抑制剂：amg-510(sotorasib，lumakras)； mrtx-849(adagrasib)；jdq443；bi 1823911；gdc-6036；ly3537982；jab-21822 (数据来源clinicaltrials.gov)。其中amg-510于今年五月获得fda的加速批准。已公布结构的两款共价抑制剂amg-510和mrtx-849都是利用了丙烯酰基作为亲电体和kras突变的cys12反应结合。从已有的临床数据来看，二者对携带kras g12c突变的非小细胞肺癌的客观缓解率(orr)分别达到了32.2％和45％，疾病控制率(dcr)分别为88.1％和96％，两种药物都达到了不错的治疗效果，但副作用也同样明显。以共价结合为设计基础的kras g12c抑制剂方兴未艾，在药物选择和结构设计上仍有很大进步的空间。
4.尽管amg-510和mrtx-849取得了可喜的治疗效果，但却在临床上表现出非常严重的副作用，这很可能来源于共价抑制剂活性亲电基团的脱靶效应。根据已公布的ⅱ期临床数据显示，服用amg-510和mrtx-849后患者因不良反应降低使用剂量的比率均为22.2％，其中分别有7.1％和7.3％导致停药；另外， amg-510和mrtx-849分别造成了20.6％和32％大于等于3级的副反应，与之相比，传统非共价抑制剂造成的此类副反应一般不会超过10％。amg-510的临床报告中还提到其产生了肝毒性和肝损伤，这在其他药物的报告中是没有出现的。值得注意的是，amg-510的推荐日服用剂量高达每天960mg，不可逆共价结合导致药物小分子在体内更难被降解，因此有更大的可能性通过脱靶效应产生严重的副作用。目前所有已知的kras g12c共价抑制剂均选用和mrtx-849、 amg-510相同的反应活性基团，很有可能产生类似的强烈副作用。
5.狼毒大戟为多年生草本植物，始载于《神农本草经》，主产于辽、吉、黑、河北等地，在国内分布较广，蕴藏量丰富，生长旺盛，花朵美丽，易于种植。在《本草纲目》中记载，主治“积粟”、“恶疮”、“肋下积瘕”、“痰饮穰瘕”。近年来，也有临床使用报道，狼毒大戟具有治疗肺癌、胃癌、肝癌、皮肤癌等多种恶性肿瘤的作用，《中国药典》1977年版收载，早期主要以其水煮液、醋煮作为药用，蒙药以牛奶煮作为药用。
6.前期研究发现狼毒大戟的有效成分主要分为萜类、鞣质类、植物甾醇类、蒽醌、苯乙酮、挥发油成分、杀虫成分等几大类，目前对于其成分的研究主要集中在对其抗癌作用、抗白血病作用、抗菌与抗病毒作用、抗惊厥作用、其他医疗作用及杀虫作用的研究上。目前对于不同提取工艺具体对应何种成分没有系统分析。其抗肿瘤作用及机制逐渐成为热点的研究，大量研究表明，其二萜类化合物及其衍生物如岩大戟内酯b对乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等实体肿瘤及白血病具有显著的抑制作用，可用于恶性肿瘤的治疗。
7.因此，为了克服目前kras g12c共价抑制剂面临结构单一、毒副作用强的问题，寻找一种毒副作用更小的新的kras g12c抑制剂，成为了本领域技术人员亟待解决的难题。


技术实现要素：

8.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种新的植物提取物，该提取物可以作为kras g12c突变蛋白抑制剂。
9.本发明提供了一种植物提取物在制备治疗抑制kras g12c突变相关疾病或病症的药物中的用途
10.进一步，本发明目的是提供了一种kras g12c突变蛋白抑制剂，该抑制剂是以狼毒大戟提取物为主要活性成分。
11.进一步，本发明提供了一种狼毒大戟提取物在制备治疗抑制kras g12c突变相关疾病或病症的药物中的用途。
12.本技术所述kras g12c突变相关疾病或病症选自各种癌症，所述癌症包括肺癌、淋巴瘤、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、脑胶质瘤、子宫颈癌、尿路上皮癌、胃癌、子宫内膜癌、肝癌、胆管癌、乳腺癌、结肠癌、白血病和黑色素瘤。优选胰腺癌、结直肠癌、多发性骨髓瘤、肺癌和黑色素瘤。
13.本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的：本发明提供一种植物提取物，具体而言，从狼毒大戟中通过有机溶剂提取得到的该提取物。其中，所述有机溶剂选自由乙醇、水或石油醚所组成的组。
14.本发明所述的狼毒大戟提取物，其提取方法具体如下：
15.(1)取狼毒大戟粉碎过筛，加入2-20倍体积无水乙醇加热提取2～3次，每次提取时间2～6h，合并提取液并旋转蒸发至干；
16.(2)分别加入去离子水250-500ml提取2次，合并水提取液，用石油醚提取2 次，再次合并提取液，旋转蒸发至干得狼毒大戟提取物。
17.本发明所述kras g12c突变蛋白抑制剂，其中还包含狼毒大戟提取物和药学上可接受的载体。
18.本发明所述kras g12c突变蛋白抑制剂，其中所述载体进一步为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂和润滑剂中的任意一种或两种以上的混合物。
19.本发明所述kras g12c突变蛋白抑制剂，其可以配制成外用制剂、口服制剂和注射
制剂中的任意一种。
20.本发明所述kras g12c突变蛋白抑制剂，其中所述口服制剂优先选自颗粒剂、胶囊剂和片剂中的任意一种。
21.本发明所述kras g12c突变蛋白抑制剂可以是一种药物或药物组合物，其以狼毒大戟提取物为主要活性成分。
22.本发明所述用于提取的狼毒大戟可以是狼毒大戟的根部、枝叶、果实或其它地上部分，优选狼毒大戟的根部。
23.本发明还提供使用狼毒大戟提取物在制备kras g12c突变蛋白抑制剂上的用途。
24.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
25.1、本发明所述狼毒大戟提取物具有显著的靶向kras g12c突变的活性。
26.2、本发明所述狼毒大戟提取物克服了现有kras g12c抑制剂副作用严重的问题。
27.3、本发明所述狼毒大戟提取物拓展了已有kras g12c抑制剂有限的选择空间。
附图说明
28.图1表示狼毒大戟提取物对携带kras g12c突变的癌细胞系具有更强的细胞活率抑制作用。
29.图2表示狼毒大戟提取物对mia-paca2癌细胞增殖的抑制效果。
30.图3表示小鼠cdx模型的构建过程及给药方式。
31.图4表示狼毒大戟提取物对三种cdx模型小鼠肿瘤进展的抑制作用。
32.图5表示狼毒大戟提取物对三种cdx模型小鼠体重的影响。
33.图6表示狼毒大戟提取物和amg-510对小鼠的肿瘤体积和体重的影响。
具体实施方式
34.以下进一步对本发明的具体实施技术方案进行说明，以使本领域技术人员理解本发明，而不构成对本发明权利的限制。
35.试剂：无水乙醇，分析纯ar，北京通广精细化工公司。石油醚(60-90℃) 分析纯ar，北京通广精细化工公司。
36.狼毒大戟样品购自黑龙江省齐齐哈尔西郊林研所实验基地，由中国林业科学院林业研究所邱德有研究员和宋加宾研究员认证。
37.实施例1植物提取物的制备例
38.称取狼毒大戟样品400g，将狼毒大戟样品粉碎100目，分别加入无水乙醇2000ml于60℃，加热6h分别提取2次，合并提取液旋转蒸发至干，分别加入去离子水250ml提取2次，合并水提取液分别用600ml石油醚提取2次，合并提取液旋转蒸发至干得狼毒大戟提取物8.30g。
39.实施例2植物提取物的制备例
40.称取狼毒大戟样品500g，将狼毒大戟样品粉碎200目，分别加入无水乙醇 3000ml于65℃，加热4-6h分别提取3次，合并提取液旋转蒸发至干，分别加入去离子水500ml提取2次，合并水提取液分别用1000ml石油醚提取2次，合并提取液旋转蒸发至干得狼毒大戟提取物10.60g。
41.实施例3对kras g12c突变细胞系的作用效果
42.首先培养不同kras突变属性的癌细胞系。在96孔板中每孔加入100μl含 4
×
103个细胞的培养基溶液，板子周围一圈加入100μl ph7.4的pbs缓冲液防止内部培养基蒸发。16h后按照浓度梯度(10-2
μm至1000μm，10倍递增)更换含药物(实施例1制备得到的狼毒大戟提取物)培养基，每个浓度设置四次生物学重复，另设空白反应及空白对照。72h后吸弃原培养基，向每孔加入含10mlcck-8试剂(beyotime)的培养基，37℃、5％co2下孵育1h，在酶标仪450nm 处测定od值。
43.根据细胞活率＝(实验组od值-空白反应组od值)/(空白对照组od值
‑ꢀ
空白反应组od值)计算各药物浓度下的癌细胞活率。使用graphpad prism8软件以细胞活率对药物浓度作图，并采用三参数的非线性拟合方法进行曲线拟合，求出药物作用的半数效应浓度(ec
50
)，ec
50
计算的结果如表1所示。曲线拟合的结果如图1所示，数据以平均值
±
标准误差表示。
44.表1狼毒大戟提取物抑制不同癌细胞系活率的半数效应浓度
[0045][0046]
试验结果显示，狼毒大戟提取物可以抑制多癌种来源的癌细胞系存活率，同时表现出对kras g12c突变细胞系(mia-paca2、nci-h358)更强的药物活性，特别是对于kras g12c纯合突变的mia-paca2细胞系，半数作用浓度(ec
50
) 达到0.88μm。
[0047]
实施例4对kras g12c突变细胞系mia-paca2的增殖抑制作用
[0048]
在六孔板中每孔加入2ml含1
×
103个mia-paca2细胞的培养基溶液，并设置两个生物学重复。培养箱中培养16h后按照浓度梯度(10-1
μm至1000μm， 100倍递增)更换药物培养基，另设空白对照。3天一次更换新的药物(实施例2 制备得到的狼毒大戟提取物)培养基。14天后吸弃原培养基，使用ph7.4的pbs 缓冲液清洗，之后加入4％的细胞固定液固定细胞，清洗后使用结晶紫溶液进行染色。室温反应20min后继续使用pbs溶液反复清洗，晾干后拍照，如图2所示。
[0049]
试验结果显示，狼毒大戟提取物能够明显抑制mia-paca2细胞系增殖，在 0.1μm的剂量下就明显抑制了mia-paca2细胞的增殖速率，体现了其抗泛癌种的活性以及靶向kras g12c突变的选择性。
[0050]
实施例5对携带kras g12c突变肿瘤的作用效果
[0051]
使用六周龄的balb/c免疫缺陷型小鼠作为试验对象。首先在25*25cm培养皿中培养kras g12c突变细胞系mia-paca2和nci-h358、非kras g12c突变细胞系hct-116，消化后在生理盐水中重悬。分别使用这三种细胞系对小鼠进行5
ꢀ×
106细胞量/只的皮下注射荷瘤，构建三种细胞系的异种移植模型，如图3所示。
[0052]
当小鼠肿瘤的平均体积达到约200mm3时，记录小鼠体重、肿瘤体积数据，开始进行
药物(实施例1制备得到的狼毒大戟提取物)的每日灌胃给药(300mg /kg)，同时三天一次持续记录小鼠的体重和肿瘤体积，当最大肿瘤体积接近 2500mm3时终止给药。
[0053]
使用graphpad prism8软件制作肿瘤体积-给药时间和小鼠体重变化率时间的变化图，结果以平均值
±
标准误差显示，显著性使用最后一天的肿瘤体积数据通过t-test进行计算检验，如图4所示。小鼠体重变化率＝100％*(小鼠体重-小鼠初始体重)/小鼠初始体重，如图5所示。
[0054]
图4的试验结果显示，狼毒大戟提取物能够显著抑制携带kras g12c突变肿瘤的发展进程(mia-paca2组和nci-h358组)，但对不含kras g12c突变的肿瘤作用效果并不显著(hct-116组)，体现了狼毒大戟提取物对kras g12c 突变的靶向活性。
[0055]
图5的试验结果显示，狼毒大戟提取物的使用相比对照组并没有对小鼠的体重产生明显影响，体现了狼毒大戟提取物具有较小的副作用。
[0056]
实施例6与阳性对照品的对比试验
[0057]
使用六周龄的balb/c小鼠作为试验对象，首先培养了kras g12c纯合突变细胞系mia-paca2，对小鼠进行5
×
106细胞量/只的上皮注射荷瘤，构建mia-paca2 细胞系的cdx模型。当肿瘤体积接近200mm3时，开始每天分别对各组小鼠进行dmso、狼毒大戟提取物(实施例2制备得到的)(前13天为30mg/kg，之后增至300mg/kg)和amg-510(10mg/kg，第10天停药)的灌胃给药。
[0058]
试验结果显示，狼毒大戟提取物有效延缓了肿瘤的发展进程，amg-510在给药的第10天基本遏制了肿瘤的生长，之后停止给药，如图6-a所示。
[0059]
在第13天将狼毒大戟提取物的给药从30mg/kg提升至300mg/kg，尽管如此，相比对照组，狼毒大戟提取物并没有对小鼠的体重产生明显影响，但对于 amg-510组小鼠，即使肿瘤已经基本完全消退且停止了amg-510的给药，该组小鼠的体重相比对照组仍有显著下降，如图6-b所示，说明amg-510的副作用强且持久，而狼毒大戟提取物的毒副作用更弱。
[0060]
对于本领域技术人员，本公开不只局限于前述说明性实施例，在不脱离其必要属性的情况下能以其它特定形式体现。因此期望认为，所有方面均作为说明性而不是限制性、对所附权利要求进行参考的实施例而不是前述实施例，引用文献只是针对附加的权利要求而不是上述的实例，以及落入权利要求等效性的含义和范围之内的所有变化因此预期包含于此。
[0061]
本说明书中列举的所有专利、专利申请和文献参考均在此以其全部内容引入作为参考。在不一致的情况下，包括定义的本公开将是有说服力的。