丹参素甲酯在制备治疗重症急性胰腺炎的药物中的应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及丹参素甲酯在制备治疗重症急性胰腺炎的药物中的应用。


背景技术：

2.重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，sap)是一类由多种病因导致胰酶在胰腺内被激活后引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应，发病急骤，病死率高达39％。研究表明，sap的过程是一个涉及多种因素的复杂病理生理过程，包括微循环，氧化应激，钙超载和促炎介质过度释放的干扰。在胰酶活化后，白介素
‑
1β(il
‑
1β)、肿瘤坏死因子
‑
α(tnf
‑
α)和白介素
‑
6(il
‑
6)被释放。为了缓解炎症和全身中毒症状，临床上在重症胰腺炎的急性期往往采用地塞米松进行病情控制，但由于地塞米松可能造成消化道出血、免疫抑制等并发症，在临床应用中存在一定局限性。
3.有文献报道中药唇形科植物丹参salvia miltiorrhiza bge.可用于急性胰腺炎的治疗，但未明确其药效学的物质基础。丹参素是丹参中的主要有效成分丹参酚酸b的降解产物，具有抗血栓、清除氧自由基、抑制炎症反应等多种药理学作用，但未有研究表明其对急性胰腺炎有治疗作用，但有文献报道丹参素对急性胰腺炎导致的肾损伤具有治疗作用(吴燕丽,张海燕.丹参素对急性胰腺炎大鼠肾损伤的保护作用及对nf
‑
κb信号通路的影响[j].中国中医急症,2018,27(11):1917
‑
1921.)。
[0004]
丹参素甲酯是以丹参素为原料，经酯化反应得到的化合物实体。目前有研究发现该化合物在心血管疾病等领域表现出了良好的药理活性(许春芳,尚刘文心,刘潭,王庭芳,张川.丹参素酯类衍生物的合成及抗心肌缺血活性研究[j].海峡药学,2018,30(02):13
‑
18.)，但未见其在抗重症急性胰腺炎方面的报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供丹参素甲酯的一种医药新用途，具体为丹参素甲酯在制备治疗重症急性胰腺炎的药物中的应用。
[0006]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007]
本发明提供了丹参素甲酯在制备治疗重症急性胰腺炎的药物中的应用。
[0008]
优选的，所述药物的剂型包括口服制剂或注射剂；所述口服制剂包括软胶囊剂或滴丸剂；所述注射剂包括注射液、冻干粉针、注射用乳剂、注射用微球或注射用纳米制剂。
[0009]
优选的，所述药物还包括药学上可接受的辅料；当所述药物的剂型为口服制剂时，所述药学可接受的辅料包括：peg 400、peg 4000、羧甲基淀粉钠和聚维酮k30中的一种或几种；
[0010]
当所述药物的剂型为注射剂时，所述药学可接受的辅料包括：大豆油、磷酯、油酸、泊洛沙姆、甘油和注射用水中的一种或几种。
[0011]
优选的，所述丹参素甲酯的剂型为口服制剂时，以丹参素甲酯计，所述药物的成人
日口服剂量为10～1000mg。
[0012]
优选的，所述丹参素甲酯的剂型为注射剂时，以丹参素甲酯计，所述药物的成人日给药剂量为5～500mg。
[0013]
本发明提供了丹参素甲酯的新用途，具体为丹参素甲酯在制备治疗重症急性胰腺炎的药物中的应用。借助雨蛙素联合脂多糖诱发的大鼠重症急性胰腺炎模型，本发明发现丹参素甲酯对重症急性胰腺炎大鼠有明显的保护作用，且其效果优于同等剂量的丹参素，因此丹参素甲酯有望在制备治疗重症急性胰腺炎药物中得到良好应用。
具体实施方式
[0014]
本发明提供了丹参素甲酯在制备治疗重症急性胰腺炎的药物中的应用。
[0015]
本发明对丹参素甲酯的来源没有特殊限制，来源于常规市售护着采用常规方法制备得到。
[0016]
在本发明的具体实施过程中，所述丹参素钠与丹参素甲酯均由滨州医学院抗衰老研究所提供，纯度均大于99％(hplc)。
[0017]
在本发明中，所述药物的剂型优选的包括口服制剂或注射剂；所述口服制剂优选的包括软胶囊剂或滴丸剂；所述注射剂优选的包括注射液、冻干粉针、注射用乳剂、注射用微球或注射用纳米制剂，更优选的包括注射用乳剂或注射用微球。
[0018]
在本发明中，所述丹参素甲酯的剂型为口服制剂时，以丹参素甲酯计，所述药物的成人日口服剂量优选为10～1000mg，更优选为50～500mg，最优选为100～300mg。在本发明中，所述药物的给药剂量是根据动物实验结果进行动物与人用药剂量换算得到。
[0019]
在本发明中，所述丹参素甲酯的剂型为注射剂时，以丹参素甲酯计，所述药物的成人日给药剂量优选为5～500mg，更优选为10～250mg，最优选为100～200mg。
[0020]
在本发明中，所述药物优选的还包括药学上可接受的辅料。
[0021]
当所述药物的剂型为口服制剂时，所述药学可接受的辅料包括：peg400、peg 4000、羧甲基淀粉钠和聚维酮k30中的一种或几种。
[0022]
当所述药物的剂型为注射剂时，所述药学可接受的辅料优选的包括：大豆油、磷酯、油酸、泊洛沙姆、甘油和注射用水中的一种或几种。
[0023]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0024]
实施例1.丹参素甲酯滴丸的制备
[0025]
处方:
[0026][0027]
操作：称取处方量的peg400、peg4000、羧甲基淀粉钠、聚维酮k30，加入滴丸机95℃熔融，边搅拌边加入处方量的丹参素甲酯，充分混匀，药料温度为85℃，药料以滴距20cm、按28滴/min的滴速滴入液体石蜡中，10℃冷凝，固化，形成滴丸后，取出、干燥，即得。
[0028]
实施例2.丹参素甲酯注射乳的制备
[0029]
处方:
[0030][0031]
操作：称取处方量的甘油，加注射用水适量，使溶解，配成甘油水溶液，在50～60℃保温，作为水相；称取处方量的磷脂、泊洛沙姆与大豆油，混合，在50～70℃搅拌溶解，作为油相；将油酸和丹参素甲酯加入油相，搅拌使混合均匀，边剪切边加入到水相中，高速剪切形成均匀初乳，以注射用水定容到5000ml，过均质机，制得粒径均一、平均粒径在160～280nm的脂质微球；将制得的液体用0.22μm的膜过滤、充氮气、灌装，125℃流通蒸汽旋转灭菌5min，即得。
[0032]
实施例3.灌胃给药时丹参素甲酯与丹参素钠对大鼠重症急性胰腺炎的保护作用比较
[0033]
1材料
[0034]
1.1实验动物清洁级sd雄性大鼠，体重(200
±
25)g，由济南鹏悦实验动物繁育有限公司提供，动物合格证号：scxk(鲁)20140007。
[0035]
1.2药品与试剂丹参素甲酯与丹参素钠均由滨州医学院抗衰老研究所提供，纯度均在99％以上(hplc)，用时以1％羧甲基纤维素钠溶液混悬；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制药股份有限公司)，用时以1％羧甲基纤维素钠溶液混悬；雨蛙素(上海源叶生物科技有限公司)与脂多糖(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，用时以生理盐水溶解；中性树胶(中国上海懿洋仪器有限公司)。其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产。
[0036]
1.3仪器spectramax id3多功能酶标仪(美国molecular devices公司)；血生化仪(朗普puzs
‑
300)；全自动组织脱水仪与包埋仪(天津爱华医疗器械有限公司)；病理切片机(德国slee)；光学显微镜(上海佑科仪器仪表有限公司)；电子天平(梅特勒
‑
托利多仪器(上海)有限公司)；101
‑
3a型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。
[0037]
2方法
[0038]
2.1动物建模与分组将54只sd大鼠随机分为9组，每组6只。分别为空白组(control)、模型组(sap)、阳性对照组(地塞米松)、丹参素钠与丹参素甲酯各三个剂量组(低、中、高剂量分别为10、20、40mg.kg
‑1)，采用雨蛙素联合lps诱导大鼠重症急性胰腺炎模型(参考文献：凤振宁,金世柱.急性胰腺炎动物模型构建方法的研究[j].胃肠病学和肝病学杂志,2020,29(04):388
‑
391.)。在诱导模型完成5min后，开始灌胃给药，每只2ml/3h，连续4次，空白组和模型组灌胃等容量的1％(m/v)羧甲基纤维素钠溶液。各组于造模最后一次注射雨蛙素和脂多糖后，开始计时，41h结束。
[0039]
2.2大鼠血清检测至41h，麻醉、取血。具体操作为：大鼠称重，腹腔注射3％戊巴比妥钠液(1ml
·
kg
‑1)进行麻醉，确认大鼠麻醉后，腹主动脉收集实验大鼠的血液(10ml离心管)，将收集好的血样在4℃放置2h或室温静置30min后，3500g离心、10min，取上清，标记后放置于
‑
20℃冰箱，用以生化指标血清淀粉酶、血清脂肪酶及血清炎症因子il
‑
1β、tnf
‑
α、il
‑
6的检测。以上指标均用大鼠elisa试剂盒检测，按试剂盒操作说明进行操作。
[0040]
3结果
[0041]
3.1丹参素甲酯和丹参素钠对大鼠血清生化指标的的影响
[0042]
见表1。
[0043]
表1灌胃给药丹参素钠与丹参素甲酯对大鼠血清生物指标影响的比较
[0044][0045][0046]
##
p＜0.01，vs空白组；
**
p＜0.01,vs模型组。
[0047]
实施例4.腹腔注射给药时丹参素甲酯与丹参素钠对大鼠重症急性胰腺炎的保护作用比较
[0048]
所用材料、药品与试剂、仪器、建模方法及血清检测指标均同实施例3。丹参素甲酯与丹参素钠腹腔注射给药，丹参素钠与丹参素甲酯各三个剂量组(低、中、高剂量分别为5、10、20mg.kg
‑1)。
[0049]
结果见表2。
[0050]
表2腹腔注射给药丹参素钠与丹参素甲酯对大鼠血清生物指标影响的比较
[0051][0052]
##
p＜0.01，vs空白组；
**
p＜0.01，vs模型组。
[0053]
重症急性胰腺炎(sap)的进展通常分为三个阶段。首先，细胞内酶的异常活化发生，导致胰腺腺泡细胞损伤，诱发炎症反应，并由于炎症因子的过度释放，导致全身多个器官的并发症。本研究中，检测了丹参素甲酯与丹参素钠灌胃与腹腔注射给药时实验大鼠血清中il
‑
1β和tnf
‑
α的水平以及最常见的血清生物标志物血清淀粉酶(ams)和脂蛋白脂肪酶(lps)的浓度，以评估sap的严重程度并比较了丹参素甲酯与丹参素钠对sap大鼠的保护作用。
[0054]
实施例3(灌胃给药)和实施例4(腹腔注射给药)的结果均显示，在模型组大鼠血清tnf
‑
α、il
‑
1β、il
‑
6、ams、lps浓度明显高于正常组，且具有统计学意义(p<0.01)，表明sap模型诱导成功；相较于模型组，丹参素钠与丹参素甲酯各剂量组血清tnf
‑
α、il
‑
1β、il
‑
6、ams、lps浓度均显著降低，且呈现剂量依赖性。而丹参素甲酯血清tnf
‑
α、il
‑
1β、il
‑
6、ams、lps浓度降低程度明显优于丹参素钠组(见表1、表2)，说明无论是灌胃给药还是腹腔注射给药，丹参素甲酯对重症急性胰腺炎大鼠均有保护作用，且该作用优于丹参素钠。
[0055]
由于丹参素分子中的极性基团羧基及多羟基的存在，导致化合物具有较大极性，口服利用度差，影响了治疗效果。实施例3和实施例4的研究数据表明，丹参素经酯化成丹参素甲酯后，对重症急性胰腺炎大鼠的保护效果明显优于丹参素。
[0056]
实施例5.丹参素甲酯与丹参素钠口服吸收利用度比较
[0057]
1.仪器与材料
[0058]
thermo fisherultimate3000高效液相色谱仪(美国thermo公司)；台式高速冷冻离心机(美国thermo公司)；kq
‑
50b超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；jyd
‑
900智能型
超声波细胞粉碎机(上海之信仪器有限公司)；vortex
‑
genie2涡旋混合器(美国sientific industies)；电子天平(梅特勒
‑
托利多仪器(上海)有限公司)。
[0059]
丹参素钠、丹参素甲酯均由滨州医学院抗衰老研究所提供，用时以1％羧甲基纤维素钠溶液混悬。
[0060]
spf级昆明小鼠，雌雄各半，体质量22～25g，购自济南鹏悦实验动物繁育有限公司，合格证号：scxk(鲁)20140007。
[0061]
2.实验方法
[0062]
2.1动物分组与样本采集
[0063]
取健康spf级昆明小鼠135只，随机分为正常组和给药组，其中正常组5只，其余随机分为丹参素钠与丹参素甲酯的给药组，且每个药物的给药组随机分为13组，每组5只，在给药前禁食24h，但不禁水。实验室适应3d后，给药组每只按30mg
·
kg
‑1体重单剂量灌胃给药，并在给药后15、30、45、60、75、90、105、120、180、240、360、480、720min，取一组小鼠摘眼球取血，并以4000r
·
min
‑1的转速在4℃条件下离心20min，取上清液检测。
[0064]
2.2检测方法
[0065]
phenomenexc
18
色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，流动相为甲醇：0.1％磷酸水(30:70)，检测波长为286nm，流速为1ml
·
min
‑1，柱温35℃，进样量20μl。
[0066]
检测方法的方法学验证过程略。
[0067]
2.3数据处理
[0068]
应用prism8.0对数据进行处理，结果以方式表示。
[0069]
3.实验结果
[0070]
见表3。从实验数据可以看出，小鼠灌胃同等剂量的丹参素钠与丹参素甲酯后，丹参素甲酯吸收更快，药物峰值浓度高(16.32
±
2.33μg
·
ml
‑1)，且达峰时间短(给药后45min)。相比之下，丹参素钠在血液组织中的达峰时间为90～120min，且达峰时的血药浓度均远低于丹参素甲酯。
[0071]
表3小鼠灌胃丹参素钠与丹参素甲酯后不同时间点血药浓度检测结果
[0072]
[0073][0074]
*ng：未检出。
[0075]
由实施例5的结果可以看出，通过比较小鼠灌胃给药时丹参素钠和丹参素甲酯后的血药浓度，发现与丹参素钠(溶液状态为游离丹参素)相比，丹参素甲酯的口服吸收达峰值时间短，血药浓度高，揭示丹参素甲酯即使在口服给药时也可用于重症急性胰腺炎的治疗。
[0076]
上述实施例的结果表明，丹参素甲酯在雨蛙素联合脂多糖介导构建的sap模型上表现出了更好的抗重症急性胰腺炎的效果。
[0077]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。