一种嵌合膜囊泡及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种嵌合膜囊泡及其制备方法和应用。


背景技术：

2.急性肾损伤(aki)，是由多种病因引起的肾功能快速下降而出现的临床综合征，是临床上极为常见的急性并发症之一，具有高的发病率和死亡率特点。其主要表现为尿少或无尿、肿胀、食欲不振等，大多数患者需要住院接受治疗。在住院患者中，近20％患有aki，死亡率更高，结果较差，其预后与脓毒症、创伤、糖尿病、年龄等诸多危险因素有关。目前尚没有真正有效的药物用于治疗aki。多项预临床研究表明，hucmsc
‑
ex在治疗aki中效果显著，但外泌体对肾损伤部位的靶向性不足限制了其临床应用。
3.近年来，以干细胞尤其是脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell，hucmsc)为代表的细胞移植疗法，在防治急慢性肾损伤的医学研究得到了广泛的关注。研究显示，hucmsc可通过直接分化为受损肾脏细胞、或通过旁分泌作用、免疫调节等作用机制发挥肾保护作用，在急慢性肾损伤防治中具有广阔的临床转化和应用前景。然而，msc植入体内后存在长期应用安全性问题以及储存和运输困难等问题，极大的限制其临床应用，寻找能够替代msc在组织损伤修复中作用的生物材料或干细胞制品显得十分迫切。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种嵌合膜囊泡及其制备方法和应用，所述嵌合膜囊泡的稳定性更好，靶向性更强，对急性肾损伤的预防和/或治疗效果更佳，具有更好的商业化前景。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种嵌合膜囊泡，所述嵌合膜囊泡的制备原料包括：人血中性粒细胞来源的纳米囊泡和人脐带间质干细胞来源的外泌体；
7.所述纳米囊泡和外泌体的数量比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。
8.优选的，所述纳米囊泡的制备方法，包括：中性粒细胞膜蛋白冰浴超声2～5min后，依次挤压通过孔径为400nm、200nm和100nm的多聚碳酸酯膜，得所述纳米囊泡。
9.优选的，所述超声的功率为100w，每超声3s后间隔10s再超声。
10.优选的，所述外泌体的制备方法包括利用质量百分浓度为30％的蔗糖密度梯度离心法，从人脐带间质干细胞的上清中分离获得所述外泌体。
11.本发明还提供了上述嵌合膜囊泡的制备方法，包括以下步骤：将所述纳米囊泡和所述外泌体冰浴超声混匀2～5min后，依次挤压通过孔径为400nm、200nm和100nm的多聚碳酸酯膜，得所述嵌合膜囊泡。
12.优选的，所述超声的功率为100w，每超声3s后间隔10s再超声。
13.本发明还提供了上述嵌合膜囊泡在制备预防和/或治疗急性肾损伤药物中的应用。
14.本发明还提供了一种预防和/或治疗急性肾损伤的药物，所述药物包括上述嵌合膜囊泡。
15.有益效果：本发明提供了一种嵌合膜囊泡(neu
‑
ex)，neu
‑
ex直径分布在30～200nm大小，膜电位比嵌合前的人脐带间质干细胞外泌体(hucmsc
‑
ex)和人血中性粒细胞来源的纳米囊泡(neu
‑
nvs)的两组绝对值更高；融合后的neu
‑
ex具有典型的球形结构；neu
‑
ex表达hucmsc
‑
ex和neu
‑
nvs细胞共同的蛋白组分。
16.经动物模型实验证实，neu
‑
exs在体内外顺铂诱导的动物模型实验中起到显著的肾功能保护作用。体内结果显示，所述neu
‑
ex能够有效增强hucmsc
‑
ex向肾损伤部位的靶向特性；所述neu
‑
ex干预后，肾组织中肾小管坏死和炎症细胞浸润减少，肌酐和尿素氮水平降低，肾组织细胞增殖能力增强；体外结果显示，所述neu
‑
ex干预后，肾小管上皮细胞凋亡减少，炎症因子表达下降。
17.综上，本发明所用到的外泌体来源于新生儿hucmsc，无伦理问题，免疫原性更低，安全性更高；所述neu
‑
ex可以分装后于
‑
80℃长期保存，易于储存和使用，neu
‑
ex可直接用于顺铂诱导的急性肾损伤预防和治疗，效果显著；而且所述neu
‑
ex按照微粒计数，使用剂量便于掌握，可用于制备防治急性肾损伤的药用制剂。
附图说明
18.图1为人脐带间质干细胞鉴定；
19.图2为人脐带间质干细胞外泌体分离纯化方法示意图；
20.图3为分离到的人脐带间质干细胞外泌体鉴定；
21.图4为人血中性粒细胞鉴定；
22.图5为人血中性粒细胞来源纳米囊泡的制备流程；
23.图6为人血中性粒细胞来源纳米囊泡的鉴定；
24.图7为中性粒细胞源纳米囊泡与脐带间质干细胞源外泌体融合的嵌合膜囊泡的鉴定；
25.图8为中性粒细胞源纳米囊泡与脐带间质干细胞源外泌体融合的嵌合膜囊泡的鉴定；
26.图9为顺铂诱导的急性肾损伤模型的建立；
27.图10为嵌合膜囊泡体内和体外对顺铂诱导的急性肾损伤干预情况。
具体实施方式
28.本发明提供了一种嵌合膜囊泡，所述嵌合膜囊泡的制备原料包括：人血中性粒细胞来源的纳米囊泡(neu
‑
nvs)和人脐带间质干细胞来源的外泌体(hucmsc
‑
ex)；
29.所述纳米囊泡和外泌体的数量比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。
30.本发明所述纳米囊泡和外泌体的数量比优选为1:1，且每种粒子的数量优选均为4
×
10
11
个。
31.本发明所述纳米囊泡的制备方法，优选包括：中性粒细胞膜蛋白冰浴超声2min后，依次挤压通过孔径为400nm、200nm和100nm的多聚碳酸酯膜，得所述纳米囊泡。本发明所述超声的功率为100w，每超声3s后间隔10s再超声。本发明所述挤压优选采用avanti微型挤出
器进行挤压。
32.本发明优选从人血中性粒细胞中提取中性粒细胞膜蛋白，本发明对所述人血中性粒细胞的提取方法和中性粒细胞膜蛋白的提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规提取方法，从新鲜抗凝血液标本中提取中性粒细胞，再从中性粒细胞中提取人血中性粒细胞膜蛋白。
33.本发明所述外泌体的制备方法优选包括利用质量百分浓度为30％的蔗糖密度梯度离心法，从人脐带间质干细胞的上清中分离获得所述外泌体。本发明优选自新生儿脐带中利用qiao chun等的方法分离培养人脐带间质干细胞(hucmsc，qiao chun et al.human mesenchymal stem cells isolated from the umbilical cord.cell biol int.2008；32(1):8
‑
15.)，从而获取原代hucmsc，培养至第三代(p3)hucmsc被用做后续检测实验。
34.本发明在得到原代hucmsc后，优选还包括以下步骤：(1)对脐带间质干细胞进行分离培养至p3代，待p3代hucmsc的融合度达50％～60％时，用pbs缓冲液洗涤，将洗涤后的p3代hucmsc置于去血清外泌体的α
‑
mem培养基培养至p6代，取hucmsc上清；所述α
‑
mem培养基中还有质量含量为10％的胎牛血清；
35.(2)对所述hucmsc上清进行离心和除菌，得脐带间质干细胞外泌体hucmsc
‑
ex；
36.所述离心包括对所述hucmsc上清进行第一离心、上清液进行第二离心、上清液进行第一超滤离心，膜上液进行第三离心，利用pbs缓冲液稀释第三离心的沉淀后进行第二超滤离心，收集膜上液；
37.所述第一离心的离心力为2000g，离心时间为10min；
38.所述第二离心的离心力为10000g，离心时间为30min；
39.所述第一超滤离心为100kda mwco超滤离心，离心力为1000g，离心时间为30min；
40.所述第三离心为将第一超滤离心的膜上液置于30％蔗糖/重水密度垫上进行，所述第三离心的离心力为100000g，离心时间为3h；
41.第二超滤离心为100kda mwco超滤离心，离心力为1000g，离心时间为30min。
42.本发明优选将分离出的脐带间质干细胞(hucmsc)于37℃、5％co2饱和湿度培养箱内培养；p3代的hucmsc进行多向分化潜能和流式鉴定，更优选包括选择生长状态良好的p3代hucmsc种板，加入成脂和成骨诱导分化培养基，培养至相应时间进行油红o染色和茜素红染色鉴定；选择生长状态良好的p3代hucmsc进行表面标记染色后进行流式细胞仪检测分析。
43.本发明优选将得到的p3代hucmsc，待融合度达50％～60％时，pbs洗涤3遍后，换成去血清外泌体的10％α
‑
mem培养基继(含10％胎牛血清的低糖dmem培养基)续培养48h，收集p3代至p6代上清后停止。本发明所述上清优选通过离心的方法获得，更优选的300
×
g离心10min以去除漂浮的活细胞，收集上清用于外泌体的分离。
44.得hucmsc上清后，本发明对所述hucmsc上清进行离心和除菌，得脐带间质干细胞外泌体hucmsc
‑
ex；所述离心包括对所述hucmsc上清进行第一离心、上清液进行第二离心、上清液进行第一超滤离心，膜上液进行第三离心，利用pbs缓冲液稀释第三离心的沉淀后进行第二超滤离心，收集膜上液；所述第一离心的离心力为2000g，离心时间为10min；所述第二离心的离心力为10000g，离心时间为30min；所述第一超滤离心为100kda mwco超滤离心，离心力为1000g，离心时间为30min；所述第三离心为将第一超滤离心的膜上液置于30％蔗
糖/重水密度垫上进行，所述第三离心的离心力为100000g，离心时间为3h；第二超滤离心为100kda mwco超滤离心，离心力为1 000g，离心时间为30min。
45.本发明所述离心优选均为低温下离心，更优选为4℃离心，其中第一离心可去除完整死细胞和细胞碎片；第二离心可去除细胞器；第一超滤离心可浓缩。本发明将经第一超滤离心后得到的浓缩液缓慢移至5ml 30％蔗糖/重水密度垫(ρ＝1.210g/cm3)上进行第三离心，收集底部5ml蔗糖/重水层(含外体)，用pbs稀释后进行第二超滤离心。本发明优选将第二超滤离心后的膜上液利用pbs洗涤3次，用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，分装后于
‑
80℃保存，并用bca蛋白质定量试剂盒法进行蛋白质定量检测。
46.本发明还提供了上述嵌合膜囊泡的制备方法，包括以下步骤：将所述纳米囊泡和所述外泌体冰浴超声混匀2～5min后，依次挤压通过孔径为400nm、200nm和100nm的多聚碳酸酯膜，得所述嵌合膜囊泡。
47.本发明所述超声的功率为100w，每超声3s后间隔10s再超声。本发明所述挤压优选采用avanti微型挤出器进行挤压。
48.本发明还提供了上述嵌合膜囊泡在制备预防和/或治疗急性肾损伤药物中的应用。
49.本发明实施例中利用急性肾损伤动物模型进行验证，neu
‑
ex有效增强hucmsc
‑
ex向肾损伤部位的靶向特性；减少顺铂诱导的肾组织中肾小管坏死和炎症细胞浸润，降低肌酐和尿素氮水平，增强肾组织细胞增殖能力；减少肾小管上皮细胞凋亡，抑制其炎症因子的表达，证实neu
‑
ex对顺铂诱导的急性肾损伤具有明显的治疗作用，因此可将neu
‑
ex用于制备预防和/或治疗急性肾损伤药物。
50.下面结合实施例对本发明提供的一种嵌合膜囊泡及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
51.本发明实施例中所用的试剂和仪器，如非必要均为本领域的常规市售产品：
52.msc培养试剂：低糖α
‑
mem(bi)、胎牛血清(gibco)、抗生素(sigma)、二氧化碳培养箱(forma公司)；
53.正置显微镜，超净工作台，台式离心机，超速离心机；
54.重水(d2o，上海创赛公司)，分析纯蔗糖(广州化学试剂厂)，成脂、成骨诱导培养基、干细胞表面标记检测试剂盒(广州赛业生物科技有限公司)，cd9、cd63、cd81、tsg101、calnexin抗体(cst)，bca蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗兔igg二抗(北京康为世纪公司)，预混hrp化学发光底物、100kda mwco超滤离心管、0.22μm无菌滤膜(美国millipore公司)；透射电子显微镜(fei tecnai 12，philips公司)；原子力显微镜(德国，布鲁克)纳米颗粒追踪分析仪(德国，zetaview)；
55.icr小鼠(江苏大学动物实验中心，此实验由江苏大学伦理委员会批准)；
56.免疫组织化学染色试剂(武汉博士德公司，按照试剂盒说明书进行操作)；
57.肾小管内皮细胞株nrk52e细胞(购于atcc)；
58.倒置显微镜，共聚焦及超高分辨显微镜，超净工作台，台式离心机；
59.qrtpcr技术相关试剂(vazyme)。
60.实施例1人脐带间质干细胞及其来源外泌体分离纯化
61.(1)hucmsc的分离培养及鉴定：采用qiao chun的方法成功分离培养及鉴定hucmsc
(qiao chun et al.human mesenchymal stem cells isolated from the umbilical cord.cell biol int.2008 jan；32(1):8
‑
15)，分离出的hucmsc于37℃、5％co2饱和湿度培养箱内培养；选择生长状态良好的第三代hucmsc种板，加入成脂和成骨诱导分化培养基，培养至相应时间进行油红o染色和茜素红染色鉴定；选择生长状态良好的第三代hucmsc进行表面标记染色后进行流式细胞仪检测分析。
62.成脂诱导分化结果显示，相比阴性对照组(图1中a左)，诱导后的hucmsc胞体呈现典型油滴(图1中a右)；成骨诱导分化结果显示，相比阴性对照组(图1中b左)，诱导后的hucmsc胞体呈现钙结节(图1中b右)；流式细胞仪结果显示hucmsc阳性表达cd29、cd73和cd105，阴性表达cd11b、cd14和cd45(图1中c)。
63.(2)人脐带间质干细胞上清(hucmsc
‑
cm)的制备：选择生长状态良好的3～6代hucmsc先用含10％胎牛血清的低糖dmem培养基培养，待细胞融合至50％～60％时换无血清培养基培养，48h后收集培养上清，300g离心10min以去除漂浮的活细胞，用于外泌体的分离。
64.实施例2人脐带间质干细胞来源外泌体的分离纯化
65.(1)根据图2所示流程进行脐带间质干细胞上清中外泌体的分离纯化：将收集的hucmsc上清液于4℃、2000g离心10min，以去除细胞碎片；收集上清后于4℃、10000g离心30min，以去除细胞器；将上清转移至100kda mwco超滤离心管，4℃、1000g离心30min进行浓缩；将浓缩液缓慢移至5ml 30％蔗糖/重水密度垫(ρ＝1.210g/cm3)，4℃、100000g离心3h；收集底部5ml蔗糖/重水层(含外泌体)，pbs稀释后加入100kda mwco超滤离心管中，4℃、1000g离心30min，pbs洗涤3次；最后用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，分装后于
‑
80℃保存，并用bca蛋白质定量试剂盒法进行蛋白质定量检测，分离的hucmsc
‑
ex浓度为40mg/ml。
66.(2)透射电镜观察外泌体的基本形态：取20μl的hucmsc
‑
ex，充分混匀后滴加于直径2mm的载样铜网上，于室温静置5min后，用滤纸轻轻吸去铜网边缘残余液体，然后将铜网倒扣于30g/l磷钨酸(ph 6.8)液滴上，室温下负染5min，最后将铜网在白炽灯下烘干，置于透射电镜下观察并拍照，如图3中a所示，外泌体为典型的“杯状”结构。
67.(3)原子力显微镜观察外泌体的高度和形貌：取10μl的hucmsc
‑
ex滴加到细胞爬片上，于室温静置干燥后，用双蒸水润洗以去除pbs盐结晶。再次自然干燥后，置于原子力显微镜下观察并拍照，如图3中b所示，外泌体为典型的“杯状”结构。
68.(4)westernblot检测hucmsc
‑
ex的表面标记蛋白：配制15％sds
‑
page电泳胶，将上述提取的外泌体充分裂解后加入1/4体积的5
×
sds上样缓冲液，煮沸5min，按200μg蛋白质总量上样，电转移(350ma，120min)将蛋白质转至pvdf膜上，用含50g/l脱脂牛奶的tbs/t室温封闭1h，分别与cd9、cd63、cd81、tsg101、calnexin抗体(1:500)于4℃反应过夜，次日用tbs/0.5％tween 20洗膜3次后，与hrp标记的山羊抗兔igg二抗37℃温育1h)，tbs/0.5％tween 20洗膜3次后，加入预混hrp化学发光底物，并通过化学发光凝胶成像系统进行检测，如图3中c所示，hucmsc
‑
ex蛋白特异性标志的cd9，cd63，tsg101，alix和hsp70呈阳性表达，calnexin呈阴性表达。
69.(4)nta检测hucmsc
‑
ex的粒径、浓度和电位：取1μl的hucmsc
‑
ex进行稀释(1:5000)后，于nta上检测。如图3中d和e所示，hucmsc
‑
ex粒径分布在30～150nm，峰值在123nm左右，呈负性电位。
70.实施例3人血中性粒细胞膜纳米囊泡的制备及鉴定
71.(1)人血中性粒细胞的分离及鉴定：征求健康志愿者知情同意后，从江苏大学校医院获取新鲜抗凝血液标本，在超净工作台中，将5ml新鲜全血沿着管壁缓慢加入到底部铺有5ml polymorphprep分离液的15ml无菌离心管中，23℃、600g缓升缓降离心30min后，移液器小心吸取中间白膜层到无血清1640培养基中进行洗涤；23℃、800g离心5min后，小心弃除上清，并加入新鲜配置的裂红液，小心吹打混匀后静置5
‑
10min后，用无血清1640培养基进行终止；23℃、800g离心5min后收获中性粒细胞沉淀，用预冷的pbs洗涤三遍，4℃、800g离心5min后获取细胞沉淀；正置显微镜检测细胞形态；瑞氏吉姆萨染色检测细胞核和胞质；流式细胞仪检测中性粒细胞特异性标志cd11b和cd33。
72.如图4所示，正置显微镜下观察显示中性粒细胞呈典型的圆球形(图4中a)；流式检测显示细胞表面表达特异分子cd11b和cd33(图4中b)；瑞氏吉姆萨染色显示中性粒细胞呈典型的杆状或分叶核结构(图4中c)；激光共聚焦显微镜也显示分离到中性粒细胞具有完整的胞膜结构。
73.(2)根据图5所示流程进行人血中性粒细胞膜蛋白的提取与鉴定：用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的ib
‑
1分离液重悬中性粒细胞沉淀，反复冻融3次后，冰浴超声5min对细胞进行破碎；4℃、800g离心10min以出去完整地死细胞和细胞碎片；上清继续在4℃、10000g离心30min以去除细胞器成分；上清继续在4℃、100000g离心2h收获膜蛋白沉淀；4℃、100000g离心2h，富集的膜蛋白沉淀洗涤2遍，重悬到
‑
80℃备用。bca法检测中性粒细胞膜蛋白质含量；考马斯亮蓝染色和蛋白质免疫印迹技术分别检测中性粒细胞全部膜蛋白组分和一些特异性蛋白分子。
74.如图6所示，考马斯亮检测结果显示，所提取的中性粒细胞膜主要在70kda左右表达中性粒细胞相同的蛋白组分(图6中c)；westernblot结果显示，所提取的中性粒细胞膜蛋白中富集大量的膜表面蛋白成分：ccl2，cxcr4，fas，icam
‑
1，整合素αv和整合素β3(图6中d)。
75.(3)人血中性粒细胞膜纳米囊泡的制备及鉴定：中性粒细胞膜蛋白冰浴超声2min后，用avanti微型挤出器将膜蛋白组分依次挤压通过不同孔径多聚碳酸酯膜(400nm、200nm、100nm)形成中性粒细胞膜纳米囊泡(neu
‑
nvs)；纳米颗粒分析仪(nta)检测neu
‑
nvs的粒径、浓度和电位；透射电子显微镜(tem)检测neu
‑
nvs的大小和形态；原子力显微镜(tem)检测neu
‑
nvs的高度和形貌。
76.如图6所示，原子力显微镜检测显示和透射电子显微镜检测显示，挤压后形成的纳米囊泡具有典型的球形结构(图6中e和f)；nta检测结果显示，挤压后形成的纳米囊30～200nm，呈现负性电位(图6中g和h)；超高分辨显微镜也检测到相应的囊泡状结构(图6中i)。
77.实施例4 neu
‑
ex的制备和鉴定
78.中性粒细胞源neu
‑
nvs与hucmsc
‑
ex融合的嵌合膜囊泡制备及鉴定：neu
‑
nvs与hucmsc
‑
ex超声混匀2min后，依次挤压通过上述不同孔径的多聚碳酸酯膜(400nm、200nm、100nm)形成neu
‑
ex。纳米颗粒分析仪(nta)检测neu
‑
ex的粒径、浓度和电位；透射电子显微镜(tem)检测neu
‑
ex的大小和形态；原子力显微镜(tem)检测neu
‑
ex的高度和形貌；蛋白质免疫印迹技术检测neu
‑
ex特异性蛋白；超高分辨显微镜和荧光共振能量转移技术检测neu
‑
ex融合情况。
79.nta检测结果显示，融合后的neu
‑
ex直径分布在30～200nm大小，膜电位比其他单独两组绝对值更高(图7中a和b)；透射电子显微镜(tem)和原子力显微镜(afm)检测结果显示，融合后的neu
‑
ex的具有典型的球形结构(图7中c和d)；考马斯亮蓝检测和western blot检测结果显示，融合后的neu
‑
ex表达细胞共同的蛋白组分；超高分辨显微镜检测结果显示，绿色荧光染料标记的neu
‑
nvs和红色荧光染料标记的hucmsc
‑
ex在挤压后出现了明显的融合(图8)。
80.实施例5 neu
‑
ex的治疗作用
81.(1)顺铂诱导急性肾损伤模型构建：将体重20～25g的icr小鼠单次腹腔注射10mg/kg顺铂(sigma)后72h导致急性肾损伤。
82.顺铂处理72h，血清生化检测结果显示，模型组小鼠肌酐和尿素氮等指标显著下降(图9中a)。he染色结果显示，模型组肾组织空泡变性显著，组织结构紊乱(图9中b)；表明顺铂诱导的急性肾损伤模型构建成功。
83.(2)嵌合膜囊泡对急性肾损伤的体内和体外治疗作用：将顺铂诱导72h后急性肾损伤模型老鼠，随机分为pbs组，中性粒细胞纳米囊泡组，嵌合膜囊泡组；每只小鼠尾静脉注射相同颗粒数(8
×
10
10
)的囊泡进行治疗，以pbs作为阴性对照。48h后对修复效果进行评价；
84.he染色结果显示，相比pbs和单独的neu
‑
nvs干预组，neu
‑
ex干预后的小鼠肾组织空泡变性减少，组织炎症细胞浸润减少，组织结构相对完整(图10中a)；免疫组织化学染色结果显示，neu
‑
ex干预后的小鼠肾组织细胞表现出更强的增殖活力(图10中b)。血清生化检测结果显示，模型组小鼠肌酐和尿素氮等指标显著下降，而neu
‑
ex干预后有效缓解了肾功能损害(图10中c)。以上体内结果显示，所述的neu
‑
ex对顺铂诱导的急性肾损伤具有明显的治疗作用。
85.体外顺铂诱导的肾小管内皮细胞(nrk52e)损伤模型中，qrt
‑
pcr检测结果显示，neu
‑
ex干预后，明显抑制了顺铂对nrk52e细胞的炎症因子tnf
‑
α及il
‑
6表达水平。这表明所述的neu
‑
ex在体内外实验中对顺铂诱导的急性肾损伤具有明显的治疗作用(图10中d)。
86.表1 tnf
‑
α和il
‑
6的引物序列
[0087][0088]
20μl qrt
‑
pcr体系：sybr green mix 10μl、rnase free ddh2o 7μl、f/r引物各0.5μl和cdna2μl。
[0089]
qrt
‑
pcr程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，40个循环；72℃再延伸10min。
[0090]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。