盐酸去甲替林和/或其可药用衍生物在制备抗肠道病毒药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及盐酸去甲替林和/或其可药用衍生物在制备抗肠道病毒药物中的应用。


背景技术：

2.肠道病毒71型(enterovirus，ev71)是小rna病毒科(picornaviridae)肠道病毒属成员，是一种无包膜病毒，病毒粒子为直径约30nm的正二十面体球型，其基因组为单正rna链，长度约7.5kb，是引起婴幼儿手足口病的最主要病原体之一。手足口患儿有时伴有严重的中枢神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎，脑炎，脊髓灰质炎样麻痹，神经性心肺衰竭等，甚至导致死亡。人是肠道病毒的唯一自然寄主﹐病毒通过人与人之间的密切接触(通过手指﹑餐具和食物)传播扩散。感染者的咽部和肠中有病毒存在，从粪中排病毒的时间较长，可持续几周。粪
‑
口是主要的传播途径。偶然也可以通过飞沫传播。多发生于5岁以下儿童，1
‑
2岁幼儿发病率最高。
3.肠道病毒71型((enterovirus，ev71)属于小rna病毒科(picornaviridae)肠道病毒属(enterovirus)成员，是引起婴幼儿手足口病的最主要病原体之一，有时伴有严重的中枢神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、自主性神经紊乱、肺水肿等，甚至导致死亡。自1969年首次报道以来，ev71感染性疾病已在世界范围内多次爆发与流行，在亚太地区尤其是我国形势严峻。目前，对于病毒性疾病的预防和治疗主要依靠疫苗和药物，相关的疫苗于2015年才上市，目前还没有具体数据能够支持上市疫苗可以保护其他血清型的肠道病毒。针对ev71病毒感染的治疗方法也相当有限，主要治疗手段为对症支持治疗和广谱抗病毒疗法，其疗效有限，个体差异较大，且难以推广。因此，相关抗病毒药物的研发将是攻克该病毒的关键着力方向，开发特异有效的抗ev71药物势在必行。
4.因此，有必要开发一种新的肠道病毒感染性疾病药物。


技术实现要素：

5.本发明目的是提供盐酸去甲替林和/或其可药用衍生物在制备抗肠道病毒药物中的应用，本技术首次发现盐酸去甲替林对肠道病毒有较强抑制作用，为肠道病毒感染性疾病的治疗和预防提供了方向。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明提供了盐酸去甲替林和/或其可药用衍生物在制备抗肠道病毒药物中的应用。
8.进一步地，所述肠道病毒包括肠道病毒71型、柯萨奇病毒b3型和柯萨奇病毒b4型中的至少一种。
9.进一步地，所述盐酸去甲替林可药用衍生物包括：二甲苯磺酸盐酸去甲替林、甲苯磺酸盐酸去甲替林、盐酸去甲替林的药学上可接受的盐、盐酸去甲替林的可药用酸加成盐。
10.进一步地，所述盐酸去甲替林的可药用酸加成盐中，所述可药用酸选自盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、抗坏血酸、草酸、甲磺酸、苯磺酸和樟脑酸。
11.进一步地，所述盐酸去甲替林的药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐中的至少一种。
12.进一步地，所述的无机盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种；所述的有机盐包括甲磺酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、三氟乙酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、乳酸盐和苹果酸盐中的一种。本发明实施例具体可选用盐酸去甲替林的盐酸盐。
13.进一步地，所述抗肠道病毒药物还包括药学上可接受的辅料和载体。
14.进一步地，所述辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着色剂中的至少一种。
15.进一步地，所述抗肠道病毒药物的剂型包括颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中的至少一种。
16.进一步地，所述抗肠道病毒药物的抗病毒的方式包括：抑制肠道病毒在细胞内核酸复制、病毒蛋白的表达和感染。
17.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
18.本发明提供的盐酸去甲替林和/或其可药用衍生物在制备抗肠道病毒药物中的应用，盐酸去甲替林一直作为一种三环类抗抑郁药，用于短期治疗各种形式的抑郁症的化合物，本发明首次发现它能够用于制备抗肠道病毒药物的新用途。试验结果表明，盐酸去甲替林对于肠道病毒例如ev71、cvb3和cvb4等具有较强的抗病毒活性，可以显著的抑制肠道病毒在宿主细胞rd上产生的细胞病变效应(cpe)，增强细胞存活率；能抑制肠道病毒的复制在细胞水平表现出较强的抗病毒效果，具有明显的技术效果。本发明结果表明化合物盐酸去甲替林有潜力制备抗肠道病毒感染的特异治疗药物，具有较好的临床应用前景。
19.同时，本发明所述的盐酸去甲替林小分子化合物合成工艺简单，易于大规模生产推广；盐酸去甲替林的抗病毒活性未见报道，对其抗肠道病毒活性的开发具有一定的导向作用；从结构相似的化合物中寻找抗肠道病毒的药物，易于通过构效关系研究寻找到其作用靶点，为进一步药物开发提供一定的借鉴意义。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
21.图1为本发明实施例1中盐酸去甲替林对于ev71病毒作用的rd细胞毒性检测结果分析图；
22.图2为本发明实施例2中盐酸去甲替林对于ev71病毒在宿主rd细胞产生的细胞病变效应(cpe)影响结果图；
23.图3为本发明实施例3中不同浓度盐酸去甲替林的抗病毒活性rna表达检测结果分
析图；
24.图4为本发明实施例4中盐酸去甲替林对ev71病毒增殖的影响检测结果分析图；
25.图5中为本发明实施例4中计算药物对于病毒复制的半数抑制浓度；
26.图6为本发明实施例5中免疫荧光法检测盐酸去甲替林抑制ev71病毒基因表达结果分析图；
27.图7为本发明实施例6中盐酸去甲替林对cvb3和cvb4复制的影响的结果图，其中，图7a为盐酸去甲替林对cvb3复制的影响，图7b为盐酸去甲替林对cvb4复制的影响。
具体实施方式
28.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
29.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
30.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
31.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
32.盐酸去甲替林是一种二苯环庚二烯三环类抗抑郁药，为阿米替林的代谢产物，具有抗抑郁作用，适用于伴有紧张，焦虑的抑郁症患者。盐酸去甲替林的化学结构式如下：
[0033][0034]
本技术的发明人结合病毒rna水平分析，滴度测定和mtt测定细胞存活率检测方法，对盐酸去甲替林小分子化合物进行抗肠道病毒活性研究实验，实施例中的数据分析采用graphpad软件进行统计分析，发现盐酸去甲替林对肠道病毒有较强抑制作用。所述肠道病毒包括肠道病毒71型、柯萨奇病毒b3型和柯萨奇病毒b4型中的至少一种。
[0035]
具体地：对盐酸去甲替林对ev71病毒的抑制活性进行评估，通过标准的抗病毒活性测试方法对其进行活性测试。经过大量生物学实验，发现盐酸去甲替林具有较好抑制ev71复制的活性，具体表现为可以抑制ev71病毒在细胞内核酸复制和病毒蛋白的表达，从而抑制病毒的增殖。
[0036]
实验结果表明，盐酸去甲替林对于ev71具有较强的抗病毒活性，可以显著的抑制ev71病毒在宿主细胞rd上产生的细胞病变效应(cpe)，增强细胞存活率；能抑制病毒的复制在细胞水平表现出较强的抗病毒效果，具有明显的技术效果。
[0037]
此外，盐酸去甲替林在不同浓度条件下，盐酸去甲替林对cvb3和cvb4的复制均有
显著抑制作用。
[0038]
综上可知，本发明结果表明化合物盐酸去甲替林有潜力制备抗ev71感染的特异治疗药物，具有较好的临床应用前景。
[0039]
因此，本发明提供盐酸去甲替林在制备抗肠道病毒药物中的应用，所述应用是指盐酸去甲替林添加药剂学可接受的辅料和载体，用于制备抗ev71病毒的制剂，辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着色剂中的至少一种，根据药物剂型的需要选择不同的辅料。所述制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。
[0040]
可以理解的是，以盐酸去甲替林为先导化合物进行进一步结构优化，用于制备治疗肠道病毒感染性疾病药物也属于本发明想要保护的范围。其中，所述盐酸去甲替林可药用衍生物包括：盐酸去甲替林的药学上可接受的盐、盐酸去甲替林的可药用酸加成盐。
[0041]
下面将结合实施例及实验数据对本技术的盐酸去甲替林在制备抗肠道病毒药物中的应用进行详细说明。
[0042]
实施例1、盐酸去甲替林的细胞毒性检测
[0043]
在rd细胞中，对盐酸去甲替林的细胞毒性进行检测。将rd细胞接种于96孔板中，在37℃，5％co2培养箱中培养12
‑
16h后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度测试盐酸去甲替林的细胞维持液继续培养，每组3个复孔，对照组加等量的无盐酸去甲替林的细胞维持液。作用48h后用mtt染色，检测od
492
nm，分析细胞存活率。
[0044]
结果分析：检测结果如图1所示，graphpad prism8软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(median cyctoxic concentration，cc50)，盐酸去甲替林的cc
50
为7183nm。后续实施案例中，盐酸去甲替林使用的最大浓度为5000nm，处于安全无毒性范围内。
[0045]
实施例2、盐酸去甲替林对ev71的抗病毒活性检测
[0046]
将rd细胞铺板96孔细胞培养板，在37℃，5％co2培养箱培养12
‑
16h后，100tcid
50
的ev71病毒液感染细胞2h，分别加含不同浓度测试盐酸去甲替林的细胞维持液继续培养约48h，阴性对照加入同体积无盐酸去甲替林的细胞维持液。病毒对照孔出现90％左右的cpe病变时，显微镜下观察细胞病变效应(cpe)。
[0047]
结果分析：盐酸去甲替林抑制ev71引起的rd细胞cpe效应如图2所示，ev71感染的rd细胞变圆，从细胞板壁脱离，不同浓度的实验化合物处理对于其病变效应有显著的抑制作用。
[0048]
实施例3、盐酸去甲替林抑制ev71增殖活性的检测
[0049]
rd细胞接种于24孔细胞培养板中，于37℃，5％co2培养箱中培养12
‑
16h，用100tcid
50
的ev71病毒液感染2h后，使用含有不同浓度的实验盐酸去甲替林的细胞维持液进行处理，阴性对照加入同体积无盐酸去甲替林的细胞维持液。处理24h后，通过tcid50滴度测定法检测抑制病毒增殖的效果。
[0050]
结果分析：检测结果如图3所示，在不同浓度条件下，化合物盐酸去甲替林对ev71均有显著抑制作用，药物处理组相对于对照组可以明显降低病毒的tcid50的值。在所述盐酸去甲替林浓度为20μm时，对ev71病毒的抑制率为83％。
[0051]
实施例4、盐酸去甲替林对ev71复制的影响
[0052]
本实验检测到盐酸去甲替林对于ev71有较好的抑制活性：
[0053]
将rd细胞接种于12孔细胞培养板中，于37℃，5％co2培养箱中培养12
‑
16h，用
100tcid50的ev71病毒液感染2h后，使用含有不同浓度的实验化合物(盐酸去甲替林)进行处理，阴性对照加入同体积无盐酸去甲替林的细胞维持液。处理16h后，收集培养结束的细胞提取总rna，通过实时荧光定量pcr(qpcr)方法检测盐酸去甲替林抑制病毒复制的效果。
[0054]
结果分析：检测结果如图4所示，graphpad prism8软件分析病毒vp1基因的表达水平及半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，ic50)，图4中为盐酸去甲替林对ev71 vp1基因表达的影响，在不同浓度条件下，盐酸去甲替林对ev71病毒的vp1基因的表达均有显著抑制作用，图5中为计算药物对于病毒复制的半数抑制浓度(concentration for 50％of maximal inhibit，ic50)，盐酸去甲替林的ic50为66.64nm。
[0055]
实施例5、免疫荧光法检测盐酸去甲替林抑制ev71病毒基因表达的影响
[0056]
本实验检测到盐酸去甲替林对于ev71复制有较好的抑制活性：
[0057]
将rd细胞接种于24孔细胞培养板中，于37℃，5％co2培养箱中培养12
‑
16h，用100tcid50的ev71病毒液感染2h后，使用含有不同浓度的实验化合物(盐酸去甲替林)进行处理，阴性对照加入同体积不含药物的维持液。处理16h后，加入4％甲醛固定细胞，加入针对dsrna的抗体4℃孵育过夜后，通过高内涵仪器进行分析及拍照。
[0058]
结果分析：结果如图6所示，标记有红色荧光染料的抗体特异结合病毒的rna，红色荧光与病毒数量成正比，结果显示红色荧光数量伴随药物浓度的增加逐渐减少，程浓度以来的方式抑制病毒的增殖。
[0059]
实施例6、盐酸去甲替林对cvb3和cvb4复制的影响
[0060]
将hela细胞接种于12孔板细胞培养板中，于37℃，5％co2培养箱中培养12
‑
16h，用100tcid
50
的cvb3和cvb4病毒液分别感染感染2h后，使用含有不同浓度的实验化合物(盐酸去甲替林)进行处理，阴性对照加入同体积无盐酸去甲替林的细胞维持液。处理17h后，通过实时荧光定量pcr(qpcr)方法检测盐酸去甲替林抑制病毒复制的效果。
[0061]
结果分析：检测结果如图7所示，图7a为盐酸去甲替林对cvb3复制的影响，图7b为盐酸去甲替林对cvb4复制的影响，在不同浓度条件下，盐酸去甲替林对cvb3和cvb4的复制均有显著抑制作用。
[0062]
综上所述，盐酸去甲替林具有显著的抑制ev71复制的活性，其中盐酸去甲替林具有最佳的抑制效果，可以强烈抑制ev71病毒引起的rd细胞病变效应，增强细胞存活率；抑制病毒rna水平的复制，有潜力进一步开发制备一种临床上有效对抗ev71病毒感染的药物。
[0063]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0064]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0065]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。