一种砂生槐子生物碱提取工艺

1.本发明属于中药化学成分提取领域，具体涉及一种简便、可靠、稳定、高效的砂生槐子生物碱提取工艺。


背景技术：

2.砂生槐子为豆科槐属植物砂生槐(sophora moorcroftiana)的干燥种子，茎尖、多年生矮灌木，雅鲁藏布江河谷常成大片群落生长，砂生槐子中的化学成分主要包含生物碱类、黄酮类、酯类、甾体类。目前砂生槐子药理活性成分的研究主要以生物碱类化合物为主，已有研究表明，砂生槐子中所含的氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱等单体成分具有较好的抑菌、抗寄生虫、抗病毒/抗肿瘤等药理活性。
3.提取工艺作为中药天然成分及其药理活性研究的重要基础之一，选用适当的提取溶剂再结合高效的提取工艺，能快速提取出更多的目标活性成分。目前，对于砂生槐子中总生物碱的提取工艺，主要是优化提取溶剂(乙醇、水、醋酸水)，提取工艺设计方案主要为响应面法、正交试验法，提取工艺中的正交试验法和响应面法虽对单个因素的影响及分析结果表现一致，但响应面法在最佳提取工艺筛选方面优于正交试验法，但只能分析离散型数据，具有精度不高、预测性不佳等缺点，并不能获得最佳的砂生槐子中总生物碱提取方法。其中，胡春晖等通过大孔树脂的吸附和解吸附行为，选择h103大孔树脂，并通过优化上样ph、上样量、洗脱溶剂以及洗脱量，提供了一种砂生槐子总生物碱的提取工艺，提取获得生物碱中氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱和苦参碱的含量仅为0.15mg/g、0.08mg/g、0.09mg/g、0.15mg/g，四种生物碱总含量仅为0.47mg/g。
4.针对现有砂生槐子中生物碱提取得率较低的问题，本发明通过超声辅助醇提法结合响应面法对砂生槐子生物碱的提取工艺进行优化，显著提高了砂生槐子中生物碱含量，使得砂生槐子中氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱和苦参碱四种生物碱总含量达到388.48mg/g。


技术实现要素：

5.目前，国内外有关砂生槐子生物碱的提取工艺研究鲜有报道，为进一步提高砂生槐子生物碱的得率，提高其兽药开发价值，本发明以高效液相色谱法测定氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱的含量及其干粉得率作为评价指标，采用超声辅助醇提法结合响应面法，优化获得了一种简便、可靠、稳定、高效的砂生槐子生物碱提取工艺，为砂生槐子作为兽用药物资源的充分合理利用提供数据支撑。具体包括以下内容：
6.本发明提供了一种砂生槐子生物碱提取工艺，所述提取工艺包括以下步骤：
7.(1)将豆科槐属植物砂生槐种子粉碎得砂生槐子粗粉；
8.(2)向砂生槐子粗粉中加入体积分数为75％
‑
95％的乙醇溶液超声提取，浓缩干燥得砂生槐子生物碱；
9.其中，所述砂生槐子粗粉与乙醇溶液的料液比为1:15
‑
1:30g/ml；所述超声功率为150
‑
210w；所述超声温度为45
‑
65℃；所述超声时间为30
‑
50min。
10.优选地，所述乙醇溶液的体积分数为75
‑
85％。
11.优选地，所述乙醇溶液的体积分数为75％。
12.优选地，所述超声功率为150
‑
180w。
13.优选地，所述超声功率为150w。
14.优选地，所述超声温度为55℃。
15.优选地，所述超声时间为50min。
16.优选地，所述料液比为1:25
‑
1:30/ml。
17.优选地，所述料液比为1:30g/ml。
18.优选地，所述料液比为1:28.88g/ml。
19.本发明的有益效果是：
20.(1)本发明通过超声辅助醇提法结合响应面法对砂生槐子生物碱的提取工艺进行优化，获得了一种简便、可靠、稳定、高效的砂生槐子生物碱提取工艺；
21.(2)所述的工艺显著提高了砂生槐子中生物碱含量，使得砂生槐子中氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱和苦参碱四种生物碱总含量达到388.48mg/g。
附图说明
22.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
23.图1乙醇浓度、料液比、温度、超声、超声时间、超声功率变化对od值的影响；
24.图2乙醇浓度、超声温度和料液比对od值影响的响应面图；
25.图3混合对照品和供试品溶液高效液相色谱图。
具体实施方式
26.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
27.以下实施例中所述的砂生槐子为2020年8月份采自西藏日喀则的砂生槐子，经甘肃农业大学动物医学院中兽医学教研室鉴定为豆科槐属植物砂生槐种子，对采摘的种子进行脱壳、除杂、弃去虫咬种子、并对其进行室温干燥处理，粉碎后过40目，即得砂生槐子粗粉。
28.以下实施例所述的试剂：氧化苦参碱(cas：145572
‑
44
‑
7，hplc≥98％)、苦参碱(cas：6873
‑
13
‑
8，hplc≥98％)、氧化槐果碱(cas：26904
‑
64
‑
3，hplc≥98％)、槐果碱(cas：6483
‑
15
‑
4，hplc≥98％)购自南京源植生物科技有限公司；甲醇、乙腈、三乙胺均为色谱纯；磷酸二氢钾为分析纯；纯净水购自娃哈哈股份有限公司。
29.以下实施例所述的仪器与设备：agilent 1260型高效液相色谱仪(美国agilent公司)；kq
‑
300de型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；re
‑
6000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；shb
‑
b95循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；dlsb
‑
5/20低温冷却液循环泵(上海豫康科教仪器设备有限公司)；hzk
‑
z
‑
90立式电热恒温真空干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)。
30.实施例1单因素试验
31.1.工艺
32.准确称取5份砂生槐子粗粉3.000g，分别考察55％、65％、75％、85％、95％乙醇浓度，1∶10g/ml、1∶15g/ml、1∶20g/ml、1∶25g/ml、1∶30g/ml的料液比，35℃、45℃、55℃、65℃、75℃时的超声温度，20min、30min、40min、50min、60min的超声时间，150w、180w、210w、240w、270w的超声功率对od值的影响，每组试验重复3次。
33.2.单因素评价方法
34.以氧化苦参碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐果碱得率及提取物的干粉得率的总评“归一值”(od)为评价指标，分别考察乙醇浓度、料液比、超声温度、超声时间、超声功率因素对总评“归一值”的影响，筛选单个因素中的最佳选取范围。
35.提取物干粉得率的计算公式：y＝干粉质量/砂生槐子粗粉
×
100％；
36.生物碱得率的计算公式：y
j
＝cvk/(50ym1)
×
100％；
37.总评“归一值”od计算公式：od＝(d1d2……
d
n
)
1/n
。
38.采用hassan方法分别进行数学转换求“归一值”od的d
min
和d
max
，其中d
min
和d
max
的计算公式如下所示：
39.d
min
＝(y
max
‑
y
j
)/(y
max
‑
y
min
)；
40.d
max
＝(y
j
‑
y
min
)/(y
max
‑
y
min
)；
41.式中，y为干粉得率％，y
j
为生物碱得率％，c为生物碱含量μg/ml，v为样品进样量μl，k为稀释倍数，m1为称取干粉质量mg，n为指标数；y
i
为同一指标实测值，y
max
和y
min
为同一个指标中的最大值和最小值，本实验进行数学转换时均选用指标d
max
。
42.3.结果
43.考察结果如图1所示，乙醇浓度在85％时od值最高(0.98)，料液比在1∶25g/ml时od值最高(0.66)，超声温度在55℃时od值最高(0.78)，超声时间在50min时od值最高(0.77)，超声功率在150w时od值最高(0.88)，因此，确定85％为最佳的乙醇浓度，1∶25g/ml为最佳的料液比，55℃为最佳的超声温度，50min为最佳的超声时间，150w为最佳的超声功率。od值影响单因素中，乙醇浓度>超声功率>超声温度>超声时间>料液比，单因素中随着超声功率的增加，od值逐渐减小，150w时出现od的最大值，超声时间在50min时出现最高点，此时生物碱含量浸出量最高。
44.实施例2响应面试验因素
45.1.响应面试验因素及水平
46.根据实施例1所述单因素分析结果，选取超声时间(50min)和超声功率(150w)为固定条件，进一步优化乙醇浓度(a)、超声温度(b)、料液比(c)的最佳组合设计，结合design export 8.0.6中的box
‑
behnken中心组合试验进行三因素三水平17个点的响应面组合方案设计，每组3次平行试验，因素和水平见表1。
47.表1响应面试验因素及水平
[0048][0049]
2.回归模型的建立及分析
[0050]
利用响应面设计软件对响应面设计组的实验结果数据进行多项式回归分析，建立砂生槐子生物碱中氧化苦参碱(y1)、氧化槐果碱(y2)、苦参碱(y3)、槐果碱(y4)及提取干粉得率(y)的总评od值的提取工艺参数回归模型，响应面设计试验方案及结果见表2。
[0051]
最终得到自变量od值对乙醇浓度(a)、超声温度(b)、料液比(c)因素的回归拟合方程为：
[0052]
od＝0.34
‑
0.023a
‑
0.071b+0.021c+0.22ab
‑
0.19ac+0.13bc
‑
0.10a2‑
0.022b2‑
0.051c2；
[0053]
其中，a
‑
c分别代表乙醇浓度、超声温度、料液比的一次多项式；a2‑
c2分别代表乙醇浓度、超声温度、料液比的二次多项式。
[0054]
表2响应面设计试验方案结果
[0055]
[0056]
3.统计学方法分析
[0057]
对建立的模型进行方差分析及模型系数进行显著性检验，如表3所示，回归模型极显著(p<0.0001)，说明建立的该模型具有实际性的意义，失拟项p＝0.0535，p>0.05说明没有显著性差异，因此，可用该模型来进一步分析和预测砂生槐子生物碱的优化提取工艺。通过对方差结果的进一步分析，得到模型确定系数r2＝0.9727，模型的校正决定系数r2adj＝0.9376，表明模型拟合度良好，试验误差较小。
[0058]
表3响应面试验回归模型的方差分析
[0059][0060]
注：“**”表示差异极显著(p<0.01)；“*”表示差异显著(p<0.05)；
“‑”
表示差异不显著(p>0.05)。
[0061]
4.因素交互作用分析
[0062]
根据回归方程可得到响应面图，通过响应面图可分析乙醇浓度、超声温度、料液比中的一个因素为固定因素时，另外两个因素对od值的影响，如图2所示，其中从图2中a可知，当超声温度的温度较低时，随乙醇浓度的增加od值逐渐减小；从图2中b可知，当乙醇浓度较低时，随着料液比的增加，od值逐渐变大；从图c可以看出，超声温度较低时，随着料液比的增加，od值逐渐减小；从超声温度、料液比、乙醇浓度三个因素方面综合来看，乙醇浓度和超声温度的交互作用最显著。
[0063]
5.最佳提取条件验证实验
[0064]
采用design
‑
expert 8.0.6软件优化方案，以od值为指标，得到砂生槐生物碱的最佳提取工艺参数为：75％乙醇浓度，超声温度55℃，料液比1∶28.88g/ml，此时od的预测值为0.56，为方便后续的生产操作，所以将优化工艺参数调整为：75％乙醇浓度，超声温度55℃，
料液比1：30g/ml，超声功率150w，超声时间50min进行工艺验证，验证结果如表4所示，od值的实测平均值为0.5586，与理论预测值0.563无显著性差异(相对误差为0.78％)，因此，通过响应面优化法得到的砂生槐子生物碱提取工艺条件准确，具有实际参考价值。
[0065]
表4工艺优化验证实验结果
[0066][0067]
实施例3砂生槐子中生物碱的提取
[0068]
目前砂生槐子生物碱成分的测定方法主要以高效液相色谱法和薄层色谱光密度法为主，因高效液相色谱法在中草药活性成分含量测定中具有简便、快速、高效等特点，并能对一些高极性、高分子量和离子型的物质进行较好的分离和分析，因此被广泛用于生物碱含量的测定，因此实施例通过建立高效液相色谱法对砂生槐子提取物中的活性成分氧化苦参碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐果碱的含量进行测定。
[0069]
1.砂生槐子待测药液制备
[0070]
准确称取砂生槐子粗粉10.00g，加入75％乙醇300ml，在功率为150w，温度为55℃条件下，超声提取50min，浓缩后置于真空干燥箱中干燥，即得砂生槐子醇提物干粉，精密制备1mg/ml的砂生槐子醇提物药液，过0.22μm滤膜后待测。
[0071]
2.标准品溶液制备
[0072]
取各标准品溶液，精密制备成终浓度为302.8571μg/ml的氧化苦参碱，88.5714μg/ml的苦参碱，78.5714μg/ml的氧化槐果碱，46.4286μg/ml的槐果碱混合标准品溶液，过0.22μm滤膜后待测。
[0073]
3.色谱条件
[0074]
agilent zorbax sb c18色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，流动相0.05mol/l磷酸二氢钾水溶液(2.00ml/l三乙胺)(a)
‑
乙腈(c)，检测波长210nm；体积流量1.0ml/min，柱温35℃；进样量20μl，梯度洗脱条件：0
‑
15min，94％a；15
‑
40min，94～90％a。
[0075]
4.系统适应性实验
[0076]
进样器吸取混合标准品溶液和待测药液各20μl，分别于上述“3”项所述色谱条件下进样。测定结果中氧化苦参碱出峰时间为17.238min，氧化槐果碱出峰时间为19.705min，苦参碱出峰时间为29.699min，槐果碱出峰时间为37.294min，混合标准品、待测药液的hplc色谱图如图3所示，其中a为标准品溶液峰，b为待测药液峰，c为溶解溶剂甲醇峰。
[0077]
5.线性关系实验
[0078]
混合标准品进行倍比稀释，制成终浓度为302.8571μg/ml，151.4286μg/ml，75.7143μg/ml，37.8571μg/ml，18.9286μg/ml的氧化苦参碱，终浓度为88.5714μg/ml，44.2857μg/ml，22.1429μg/ml，11.0714μg/ml，5.5357μg/ml的苦参碱，终浓度为78.5714μg/
ml，39.2857μg/ml，19.6429μg/ml，9.8214μg/ml，4.9107μg/ml的氧化槐果碱，终浓度为46.4286μg/ml，23.2143μg/ml，11.6072μg/ml，5.8036μg/ml，2.9018μg/ml，1.4509μg/ml的槐果碱标准品溶液。按照上述“3”项条件，吸取20μl进样，以质量浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，建立标准曲线。结果表明，各生物碱组分的线性关系良好，线性范围、回归方程及回归系数如表5所示。
[0079]
表5生物碱回归方程、回归系数及线性范围
[0080][0081]
6.精密度实验
[0082]
吸取混合标准品溶液20μl，按照上述色谱条件下连续进样6次，计算氧化苦参碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐果碱的rsd值分别为0.47％、2.07％、0.73％、1.40％，rsd值均小于3％，说明仪器有较好的精密度(n＝6)。
[0083]
7.稳定性实验
[0084]
吸取0、2、4、8、12、24h的混合标准品溶液20μl，按照上述色谱条件进样，计算氧化苦参碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐果碱的rsd值分别为0.69％、2.11％、0.83％、1.40％，rsd值均小于3％，说明标准品在24h有较好的稳定性(n＝6)。
[0085]
8.重复性实验
[0086]
按照上述砂生槐子待测药液制备方法，制备砂生槐子药液6份，按照上述色谱条件进样，计算氧化苦参碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐果碱的rsd值分别为1.19％、1.53％、1.76％、1.44％，rsd值均小于3％，说明重复性较好(n＝6)。
[0087]
9.加样回收实验
[0088]
按照上述砂生槐子待测药液制备方法，制备砂生槐子待测药液6份，按照上述色谱条件进样，根据表5所述回归方程计算各生物碱含量，精密吸取已知浓度的混合标准品溶液加入已制备好的待测药液中进行测定。得到氧化苦参碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐果碱的加样回收率为99.58％、102.04％、98.82％、98.91％，rsd分别为2.02％、2.20％、1.60％、1.46％，rsd值均小于3％，说明本方法稳定可行(n＝6)。
[0089]
10.生物碱含量检测结果
[0090]
在75％乙醇浓度，超声温度55℃，料液比1：30g/ml，超声功率150w，超声时间50min的条件下，提取获得的砂生槐子提取物中氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱含量分别为341.33mg/g、33.02mg/g、11.71mg/g、2.41mg/g，得率分别为2.94％，0.28％，0.10％，0.02％，干粉得率为20.37％，四种生物碱总含量达388.48mg/g。
[0091]
上述结果表明，本发明获得了一种砂生槐子生物碱的最佳提取工艺为：75％乙醇浓度，超声温度55℃，料液比1：30g/ml，超声功率150w，超声时间50min；在此条件下，砂生槐子提取物中氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱含量分别为341.33mg/g、33.02mg/g、
11.71mg/g、2.41mg/g，总生物碱含量达388.48mg/g；所述结果与胡春晖等报道的最佳工艺方案相比(氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱和苦参碱的含量仅为0.15mg/g、0.08mg/g、0.09mg/g、0.15mg/g，四种生物碱总含量仅为0.47mg/g)，显著提高了砂生槐子总生物碱的提取率。因此，本发明建立了一种简便、可靠、稳定、高效的砂生槐子生物碱的新提取工艺，为砂生槐子作为兽用药物资源的充分合理应用提供了详细的数据支撑。