1.本发明属于植物成分提取技术领域，具体涉及一种辣木叶总黄酮的提取方法。
背景技术：
2.辣木(学名：moringa oleiferalam.)是辣木科辣木属植物，原产于印度，广植于各热带地区。中国广东(广州、儋县)和台湾等地有栽培，辣木具有观赏，经济，食用价值，辣木叶是我国新资源食品。辣木叶黄酮(flavonoids from moringa oteifera lam.leaves，fml)具有抗氧化、抑菌、降血糖、抗癌等多种生理活性作为蔬菜和食品有增进营养，食疗保健的功能；也广泛应用于医药、保健等方面，被誉为“生命之树”，“植物中的钻石”。
3.目前黄酮类成分的提取方法主要为溶剂提取法，采用的溶剂多为乙醇，该方法存在提取杂质较多，提取效率不够高，结果不够稳定等缺点。也有研究采用超声提取法，该法对设备要求高，单次提取量较小，不适用于企业工业化生产。
技术实现要素：
4.为了解决辣木叶黄酮的有效分离问题，发明人提供了一种利用复合酶酶解的辣木叶总黄酮的提取方法，技术方案如下：
5.一种辣木叶总黄酮的提取方法，包括以下步骤：
6.称取辣木叶粉15-27g，以30～60℃石油醚为溶剂，加入石油醚100-200ml，浸泡24-48h后，抽滤，取滤渣，自然挥干石油醚，即得脱脂辣木叶粉；
7.准确称取脱脂辣木叶粉3-4g于锥形瓶中，加入1-2％的酶，及40-50ml磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液调节ph，恒温酶解，在沸水中灭酶2-4min，加乙醇调节乙醇浓度为60-75％，置65-75℃恒温水浴锅提取2-4h，抽滤，浓缩，得提取液。
8.进一步的，所述的酶包括纤维素酶或果胶酶或二者的复合酶。所述的复合酶为纤维素酶和果胶酶按质量比1：1-2的比例混合。所述的酶解时间为120-160min，酶解温度为50-60℃，酶解ph为4.0-5.5。
9.进一步的，所述的提取方法优选为：
10.称取辣木叶粉27g以石油醚30～60℃为溶剂，加入200ml石油醚(脱脂、除色素)，浸泡24h后，抽滤，取滤渣，自然挥干石油醚，即得脱脂辣木叶粉；
11.准确称取脱脂辣木叶粉3g于锥形瓶中，加入纤维素酶和果胶酶的复合酶，酶比例为1：1，酶量为样品量1％，加入40ml磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，调节ph为5.5，搅拌均匀后，置于50℃恒温水浴，酶解160min，然后置于100℃沸水中灭酶2min，加乙醇调节乙醇浓度为65％，置70℃恒温水浴锅提取2.5h后，抽滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩，浓缩至10ml，得提取液。
12.区别于现有技术，上述技术方案的优点在于：通过脱脂操作，除去脂溶性杂质，酶解效率高，无需高温加热，操作简便，对辣木叶黄酮的提取率高；同时对设备要求较低，可以实现企业批量生产的需求。
具体实施方式
13.为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。
14.实施例1
15.1.总黄酮的含量测定
16.芦丁标准曲线的建立：精密称取芦丁对照品适量，配置成芦丁对照品溶液(0.200mg/ml)，分别精密量取芦丁对照品溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml，置于6个25ml量瓶中，各加水6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，摇匀，放置6min，再加10％的硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6min，加4.3％氢氧化钠溶液10.0ml，加水稀释至刻度，摇匀，放置15min，按紫外-可见分光光度法，在510nm波长处测定各溶液的吸光度。以浓度(c)(mg/ml)为横坐标，吸光度(a)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为a＝12.488c－0.0291，r2＝0.9993，表明芦丁在0-0.04440mg/ml线性良好。
17.提取液总黄酮含量的测定：精密吸取项中各浓缩液1.00ml，置25ml容量瓶中，按上述标准曲线实验步骤进行操作，自“各加水6ml”起，同法测其吸光度，根据回归方程计算总黄酮的含量，并按下列公式计算黄酮提取率。
18.黄酮提取率(％)＝提取液中总黄酮物质的质量/辣木叶粉质量
×
100％
19.2.索氏75％乙醇加热回流提取
20.辣木叶预处理：将辣木叶阴干，粉碎过100目筛，密封保存，至干燥处备用。准确称取辣木叶粉5g，于索氏提取装置加热回流提取：初提：纯化水100ml，回流2h；复提：纯化水100ml，回流1h，浓缩液加75％乙醇醇沉24h；将两次提取液合并，浓缩至25ml，加入1勺活性炭除杂，搅拌，用滤纸和漏斗过滤，再倒入125ml的分液漏斗，加入20ml石油醚萃取2次，得辣木总黄酮提取液。定容至50ml测定其总黄酮的含量。
21.实验结果显示，直接乙醇提取法获得的总黄酮含量为0.93％。
22.3.单酶和复合酶单因素试验
23.(1)辣木叶预处理：称取辣木叶粉15g，以石油醚30～60℃为溶剂，加入100ml石油醚(脱脂、除色素)浸泡24h后，抽滤，取滤渣，自然挥干石油醚，即得脱脂辣木叶粉。
24.(2)选用纤维素酶、果胶酶为实验用酶，为考察单酶和复合酶对辣木叶黄酮提取的影响，分别称取3.0g脱脂辣木叶粉5份，在脱脂辣木叶粉中分别加入相同酶活单位的纤维素酶、果胶酶和40ml磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液混合，酶量为样品量1％，纤维素酶和果胶酶的质量比分别为1：0、0:1、1:1、2:1、1:2，酶解时间为150mim，酶解温度为50℃后，100℃灭酶2min，加乙醇调节乙醇浓度为65％【乙醇浓度＝乙醇含量/(缓冲溶液体积+乙醇体积)
×
100％】，置70℃恒温水浴锅提取1.5h，抽滤，浓缩至12ml，得提取液。测定提取液中黄酮含量，计算提取率，结果见表1。
25.表1单酶和复合酶单因素试验结果
26.试验号辣木叶粉/g酶解时间/min酶比例酶解温度/℃黄酮提取率/％131501:0501.152231500:1501.002331501:1501.590431502:1501.141
531501:2501.380
27.实验结果表明，单一的纤维素酶或果胶酶对总黄酮的提取率影响不大，复合酶的效果比单酶好，不同组成的复合酶效果也不同。当复合酶比例为1:1时提取效果最好。
28.4.复合酶正交试验
29.(1)辣木叶预处理：称取辣木叶粉27g以石油醚30～60℃为溶剂，加入200ml石油醚(脱脂、除色素)浸泡24h后，抽滤，取滤渣，自然挥干石油醚，即得脱脂辣木叶粉。
30.(2)选择纤维素酶和果胶酶比例为1：1时组成的复合酶作为辣木黄酮提取用酶。选取酶解时间、酶解温度及酶解ph三个主要因素，酶解时间120min、140min、160min，酶解温度50℃、55℃、60℃，酶解ph为4、4.5、5.5，采用正交试验方案对辣木叶黄酮进行提取(见表2)。
31.准确称取脱脂辣木叶粉，每份3g，称取9份分别放于250ml锥形瓶中，分别加入纤维素酶、果胶酶组成的复合酶(酶比例为1：1，酶量为样品量1％)，加入40ml磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液调ph，搅拌后，恒温水浴设置温度，置恒温水浴锅酶解后，放于100℃沸水中灭酶2min，加乙醇调节乙醇浓度为65％【乙醇浓度＝乙醇含量/(缓冲溶液体积+乙醇体积)
×
100％】，置70℃恒温水浴锅提取2.5h后，抽滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩，转速50rpm，浓缩至10ml，得提取液。按紫外分光光度法，在510nm处测各溶液吸光度，计算黄酮含量和提取率。
32.表2复合酶酶解正交试验方案和试验结果
33.试验号酶解温度/℃酶解时间/min酶解ph总黄酮提取率/％1501204.02.202501404.52.153501605.53.214551204.51.725551405.51.626551604.01.637601205.51.708601404.01.579601604.51.70
34.实验结果表明，复合酶提取辣木叶黄酮，在纤维素酶：果胶酶质量比为1：1，酶用量为样品量1％，酶解温度50℃，酶解时间160min，酶解ph为5.5，酶解后恒温水浴70℃提取2.5h时，辣木叶总黄酮提取率最高，为3.21％。
35.综上所述，复合酶辅助提取辣木叶黄酮比直接乙醇提取效果好，直接醇提提取率仅为0.93％，而复合酶辅助提取辣木叶黄酮的提取率可达3.21％。
36.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括
……”
或“包含
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解
为包括本数。
37.需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。