1.本发明涉及山莨菪根部提取物，具体涉及优化山提取莨菪根部生物碱方法，同时还涉及山莨菪根部生物碱药物制剂。
背景技术：
：：2.山莨菪，为茄科山莨菪属植物山莨菪anisodustanguticus(maxim.)pascher的根。植物山莨菪，主要分布于我国甘肃、四川、青海等省。山莨菪根中主要含有4种托品烷类生物碱(樟柳碱、山莨菪碱、东莨菪碱和阿托品)，这些生物碱及其制剂在临床上发挥着重要作用，可用于治疗溃疡病、胃肠炎、胃肠神经官能症、胆道蛔虫症、胆石症、跌打损伤、骨折与外伤出血等。因此从植物山莨菪中有效提取托品烷类生物碱就显得尤为重要。3.目前人们对山莨菪的研究主要集中在从植物山莨菪中提取生物碱的前处理方法上，例如梁鑫淼等采用乙醇热回流法提取山莨菪生物碱(一种山莨菪生物碱的前处理方法，cn102850343a)，张南南等采用酸性水溶液浸提山莨菪生物碱(一种莨菪烷类生物碱的提取工艺，cn110003197b)，陈晨等用酸性醇溶液通过热回流或超声提取山莨菪中的生物碱(一种山莨菪中莨菪烷类生物碱的制备方法，cn111875600a)。显少有研究对山莨菪生物碱提取方法进行优化，在目前的提取工艺中，采用的方法主要为超声醇提法。具体步骤为先将山莨菪根部粉碎得到粉末，将粉末加入乙醇溶液中，经过超声，过滤，得到山莨菪生物碱粗提液，粗提液经过干燥得到山莨菪生物碱粗提物。在超声提取中，超声时间、乙醇浓度、超声温度、提取次数及液料比都会对生物碱的提取率产生影响，因此为了合理运用工艺资源，避免生物资源的浪费，本发明采用响应面法优化山莨菪生物碱提取方法。4.响应面法，即响应曲面设计方法，是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。5.本发明以总生物碱为指标，通过单因素及响应面实验优化了山莨菪生物碱提取方法，为山莨菪药效活性研究以及产品的研制提供了数据支撑，为山莨菪资源的综合利用和产业化开发提供了基础。技术实现要素：6.本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种基于响应面法优化山莨菪生物碱提取工艺的方法，基于该提取方法，研究了山莨菪的有效活性部位，将提取的山莨菪根部生物碱制成一种抗炎乳膏剂。7.具体包括以下步骤：8.(1)山莨菪根粉、乙醇溶液，液料比为100:1～20:1ml/g，乙醇浓度为20％～100％；9.(2)超声提取，提取温度：20～60℃，提取次数：1～3次，提取时间：0.5～3h；10.(3)获取提取液，除去溶剂。11.步骤(3)中，所述获取提取液，是将提取物中的固体去除，保留液体部分，所用方法包括但不限于：过滤、离心等除去固体的常规操作手段，这些手段可以单独使用，也可以联合使用。12.步骤(3)中，所述除去溶剂，是将提取液中的乙醇溶液去除，所用方法包括但不限于：减压蒸发、常压蒸发、烘干、薄膜干燥等常规操作手段，这些手段可以单独使用，也可以联合使用。13.步骤(1)中，山莨菪根粉，是将植物山莨菪根部通过干燥粉碎得到。14.在步骤(1)与步骤(2)中，以液料比、提取温度、乙醇浓度、提取时间、提取次数为自变量，根据5个单因素实验进行调整，发现液料比、提取温度与乙醇浓度对生物碱提取率的影响显著，再根据box‑behnken原理，以生物碱提取率为响应值y，设计三因素三水平响应面实验，建立生物碱提取率的多元二次方程，得出多元二次方程后，各参数应满足如下数学关系式：15.y＝1.68‑0.014x1﹣0.00007x2‑0.076x3﹣0.14x1x3+0.014x2x3﹣0.043x12﹣0.31x22﹣0.33x3216.式中y表示生物碱提取率，x1表示液料比，x2表示提取温度，x3表示乙醇浓度。17.根据方程的生物碱提取最大值计算出相应的参数。18.一、测定山莨菪生物碱含量19.将经过预处理的山莨菪根部样品1.000g置于250ml锥形瓶中，加入乙醇溶液，充分混匀后放入超声提取器中提取，抽滤，用旋转蒸发仪水域蒸干溶剂，得到山莨菪提取物干样，向干样加水10ml使其溶解，调节ph至2～3，过滤，滤液用氨水调ph至9～10，再用氯仿萃取4次，每次6ml，合并定容至25ml，采用紫外‑可见分光光度法测定山莨菪根部生物碱的含量。取103℃干燥至恒重的硫酸阿托品10mg，置于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解定容到刻度线，于420nm处测定吸光度值。20.精密量取硫酸阿托品对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置于5个分液漏斗中，各依次加0.500g/ml酸性染料溴甲酚绿溶液3ml，三氯甲烷10ml，用水补充至等体积，振摇提取2min，静置5min，分液，向有机相溶液中加入0.5g无水硫酸钠脱水，静置20min，取另一精密加入三氯甲烷10.0ml的分液漏斗，精密加入水1.0ml，同时支制成空白对照溶液，于波长420nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，硫酸阿托品含量为横坐标作标准曲线，计算回归方程为y＝0.4516x‑0.0106,相关系数r2＝0.9953，将山莨菪提取在420nm处测定的吸光度值带入回归方程，计算得到的y值为山莨菪根部生物碱的含量。21.其中，0.500g/ml酸性染料溴甲酚绿溶液的配制方式为：精密称取溴甲酚绿50mg，邻苯二甲酸氢钾1.021g，加0.2mol/l氢氧化钠溶液6.0ml使其溶解，在加蒸馏水稀释至100ml，摇匀，过滤。22.二、单因素实验23.以液料比、提取温度、乙醇浓度、提取时间、提取次数为自变量作为山莨菪生物碱提取率影响的5个因素，并将上述5个因素进行单因素试验，确定5个因素在其他因素不变前提下的最优水平，具体单因素试验操作如下步骤：24.1、液料比对生物碱提取率的影响25.如图1所示，山莨菪生物碱的提取率在液料比60:1ml/g时达到最大，超过60:1ml/g，生物碱的提取率略有下降。所以在响应面条件优化时选择40:1ml/g、1:60ml/g、80:1ml/g3个水平。26.2、温度对生物碱提取率的影响27.如图2所示，在温度区间20～60℃，提取率逐渐提高；80～100℃时，得率的变化平缓；100℃时，生物碱提取率有所下降。60～100℃是保证生物碱得率的合适区间，为确保山莨菪生物碱的得率，故选用60℃、80℃、100℃。28.3、提取次数对生物碱提取率的影响29.如图3所示，虽然随着提取次数的增加，生物碱的含量会增加，但提取2次和提取3次对生物碱含量的增加影响不大，所以再后续的响应面优化中不考虑次数的影响，提取次数控制在2次。30.4、提取时间对生物碱提取率的影响31.如图4所示，虽然随着提取时间的增加，生物碱的含量最大在2h，超过2h时，含量有所下降，但下降的并不明显。所以在响应面优化时不考虑时间的影响，并选择提取时间为1h。32.5、乙醇浓度对生物碱提取率的影响33.如图5所示，在乙醇浓度区间20～80％，提取率逐渐提高；80～100％乙醇浓度时，得率的变化平缓；100％乙醇浓度时，生物碱提取率有所下降。60～100％乙醇浓度是保证生物碱得率的合适区间，为确保山莨菪生物碱的得率，故选用乙醇浓度为60％、80％、100％。34.三、响应面实验35.根据单因素实验结果，确定对山莨菪生物碱提取率影响显著的液料比(x1)、温度(x2)、乙醇浓度(x3)3个因素，各设置3个水平，结合box‑behnken原理设计响应面实验。36.表1响应面实验设计因素与水平37.table1factorsandlevelsofresponsesurfacedesign[0038][0039]借助实验设计软件designexpert8.0，设置响应值为生物碱提取率(y)，设计进一步优化液料比(x1)、温度(x2)和乙醇浓度(x3)的3因素3水平响应面实验(因素与水平见表1)，共计17组实验，表2所列为设计方案与结果，其他条件与单因素实验结果一致。[0040]表2响应面实验设计方案与结果[0041]table2designandresultsofresponsesurface[0042][0043][0044]使用designexpert8.0对响应面实验结果进行拟合，建立数学模型，二次回归方程为：[0045]y＝1.68‑0.014x1﹣0.00007x2‑0.076x3﹣0.14x1x3+0.014x2x3﹣0.043x12﹣0.31x22﹣0.33x32。[0046]表3为该模型的方差分析。[0047]表3模型的方差分析[0048]table3anovaofmathematicmodel[0049][0050][0051]模型的相关系数r2＝0.9364，说明二次回归方程的拟合度良好，预测值与真实值的相关性较强。此回归模型达极显著水平(p<0.01)，失拟不显著(p>0.05)，表明模型是可行的，其中，x12、x22、x32项均极显著(p<0.01)，其他项不显著(p>0.05)。比较回归方程一次项系数的绝对值大小，3个因素的作用效果排序为：乙醇浓度>温度>料液比。[0052]响应面趋势分析:[0053]保持其中一个变量在中心值，其他两个变量变化对生物碱得率的影响绘制成3d响应面图和等高线图。3组响应面图开口向下且存在最高点，生物碱提取率从最高点向四周边缘逐渐下降。由图6、图7和图8可知，y值在x2轴方向上变化明显，提取率受乙醇浓度的影响比液料比、温度明显。等高线表明，等高线呈椭圆形，交互作用明显，椭圆的短轴与x2轴平行，说明曲面在x2轴上弯曲明显，中心附近等高线闭合，说明最高点位于区域内部。[0054]模型预测与验证：[0055]使用designexpert8.0软件对二次回归方程中各自变量求偏导，计算并比较所有极值点和边界点对应的预测值，得到最优工艺参数为：液料比60.72ml/g、温度79.73℃、乙醇浓度77.56％，预测得率为1.687％。结合实际可控性，确定采用：液料比61ml/g，乙醇浓度78％，温度80℃，提取时间2h，提取2次。称取山莨菪1.000g，进行提取验证，平行3组。测得该条件下，实际生物碱提取率1.639％，与预测值1.687％接近。[0056]四、山莨菪有效活性部位研究及其制剂[0057]采用已建立的细胞炎症模型对山莨菪提取物(除糖后部分)进行了抗炎活性的比较，实验结果表明，与空白对照组相比，山莨菪种子提取物对细胞活力均无影响。而地上提取物在细胞活力大于或等于50μg/ml时，能显著降低细胞活力。一氧化氮(no)产生实验表明，根部分和地上提取物在较高浓度(80μg/ml)时均能显著抑制内毒素(lps)对巨噬细胞的激活，并呈现浓度依赖性。而种子提取物不能抑制lps诱导的no的产生。该实验结果表明根部分和地上提取物可能具有很好的抑制炎症作用，并且根部分抑制活性强于地上提取物。[0058]由于山莨菪根总生物碱提取物具有较好抗炎活性，因此，本发明以山莨菪根总生物碱提取物为原料进行皮炎乳膏的研制。[0059]乳膏外观：微黄色，细腻，半固体状。该乳膏分装后表面平整，取用方便，易涂展，易去除，具有清香味。[0060]说明书附图[0061]图1为料液比对生物碱提取率的影响图[0062]图2为温度对生物碱提取率的影响图[0063]图3为提取次数对生物碱提取率的影响图[0064]图4为提取时间对生物碱提取率的影响图[0065]图5为乙醇浓度对生物碱提取率的影响图[0066]图6为液料比与温度相互作用的响应面图和等高线图[0067]图7为液料比与乙醇浓度相互作用的响应面图和等高线图[0068]图8为乙醇浓度与温度相互作用的响应面图和等高线图具体实施方式[0069]下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。[0070]实施例1[0071](1)向粉碎后的山莨菪根部样品加入乙醇溶液，液料比为61:1ml/g，乙醇浓度为78％，(2)充分混匀后放入超声提取器中，在80℃下超声提取2次，提取时间为2h，(3)将步骤(2)得到的提取物抽滤，得到粗提液，(4)将粗提液经旋转蒸发仪水浴蒸干溶剂，得到山莨菪生物碱，根据紫外可见分光光度法得到在420nm处生物碱的含量，计算得到生物碱提取率为1.639％。[0072]实施例2[0073](1)向粉碎后的山莨菪根部样品加入乙醇溶液，液料比为40:1ml/g，乙醇浓度为100％，(2)充分混匀后放入超声提取器中，在80℃下超声提取2次，提取时间为1h，(3)将步骤(2)得到的提取物抽滤，得到粗提液，(4)将粗提液经旋转蒸发仪水浴蒸干溶剂，得到山莨菪生物碱，根据紫外可见分光光度法得到在420nm处生物碱的含量，计算得到生物碱提取率为1.473％。[0074]实施例3[0075](1)向粉碎后的山莨菪根部样品加入乙醇溶液，液料比为40:1ml/g，乙醇浓度为60％，(2)充分混匀后放入超声提取器中，在80℃下超声提取2次，提取时间为1h，(3)将步骤(2)得到的提取物抽滤，得到粗提液，(4)将粗提液经旋转蒸发仪水浴蒸干溶剂，得到山莨菪生物碱，根据紫外可见分光光度法得到在420nm处生物碱的含量，计算得到生物碱提取率为1.306％。[0076]实施例4[0077]乳膏剂配方：山莨菪生物碱10g，单硬脂酸甘油酯7g，硬脂酸10g，白凡士林12g，液状石蜡10g，甘油12g，十二烷基硫酸钠10g，尼泊金乙酯0.1g，蒸馏水48ml。[0078]以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式只局限于这些说明。对本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。当前第1页12当前第1页12