一种治疗肺癌的中药组合物及其制备方法和应用

1.本发明属于中药技术领域，具体涉及一种治疗肺癌的中药组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.肺癌是当前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，具有高转移、易耐药、易复发等特性，严重威胁着人类的健康和生存质量。近些年来，肺癌的靶向治疗和免疫治疗虽取得了很大的进展，但5年生存率仅约为20％。化疗和放疗等传统疗法是治疗肺癌的主要手段，存在多药耐药现象和严重的毒副作用，治疗效果不佳。因此，开发具有疗效好、毒副作用小、不易产生耐药、多靶点的药物应用于肺癌及转移的治疗已经成为当前迫切需要解决的问题。中药复方能够全面地调整机体免疫状态，抑制肿瘤的生长和转移，延长生存期，显著提高患者的生存质量，在肺癌及肺癌转移的治疗中发挥越来越重要的作用。
4.发明人通过对临床上用于治疗多药耐药、广泛多药耐药肺结核的“益肺通络方”的系统研究发现，益肺通络方可调节机体免疫功能，平衡th1/th2免疫应答，通过免疫调节、抗多药耐药和排毒等作用机制发挥抗耐药肺结核的治疗功效(y.wang,q.qi,a.li,m.yang,w.huang,h.xu,z.zhao,s.li,journal of ethnopharmacology,2016,194,72
–
82)。
5.鉴于“益肺通络方”能够调节机体免疫功能，平衡th1/th2免疫应答，发明人考察了“益肺通络方”体内对lewis肺癌生长的抑制作用，实验结果表明益肺通络方具有抗肺癌作用，能够明显地抑制小鼠lewis肺癌的生长并延长了小鼠的生存期，且小鼠体重、血清生化指标、组织病理检查等结果表明益肺通络方在体内没有明显的毒副作用，具有较好的安全性。“益肺通络方”能够抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡发挥抑瘤作用，可能与其激活肿瘤组织中抑癌基因p53，上调bax的表达、下调bcl
‑
2的表达有关(q.qi，y.hou，a.li,y.sun,s.li and z.zhao,molecules,2019,24,31)。
6.然而，“益肺通络方”治疗效果仍然有限，因此研发具有抗癌、抗转移、抗耐药等多重治疗作用的中药组合物是亟待解决的问题。


技术实现要素：

7.针对上述现有技术的不足，本发明提供一种治疗肺癌的中药组合物及其制备方法和应用。本发明制备得到的中药组合物不仅具有抑制肺癌细胞增生的疗效，而且还兼顾其抗肺癌、抑制转移和抗耐药的功效，同时，本发明建立了中药材浸提关键技术，从而保证“成分
‑
机制
‑
功效”相统一的现代中药开发和质量控制的整个链条的科学性，因此具有良好的实际应用之价值。
8.为实现上述发明目的，本发明公开了以下技术方案：
9.本发明的第一个方面，提供一种治疗肺癌的中药组合物，所述治疗肺癌的中药组合物包括以下重量份的原料药：
10.灵芝6
‑
24份、丹参10
‑
30份、百部3
‑
18份、矮地茶10
‑
60份。
11.本发明提供的“灵丹百茶方”由以下四味中药材组成：灵芝、丹参、百部、矮地茶。现代药理学研究表明灵芝具有增强免疫力、保肝护肝、抗肿瘤等药理作用，灵芝水提物和灵芝多糖在几种荷瘤动物体内均表现出明显的抑制肿瘤生长和转移的作用，主要依靠其增强机体的免疫活性；而灵芝乙醇提取物或灵芝三萜类成分具有抗肿瘤作用，这可能与其抑制细胞增殖，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡等多种机制相关。丹参提取物及其主要活性成分具有抑制肿瘤生长和转移的作用，其中涉及的作用机制包括抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制肿瘤侵袭和转移、抑制血管生成、增强机体免疫、逆转肿瘤多药耐药等多个环节。百部中药材的选用重点考虑了其补气滋阴的功效，另外百部的脂溶性主要成分百部生物碱抗肿瘤和抗耐药的特殊功效。矮地茶具有化痰止咳、清热解毒、活血化瘀功效，而其主要活性成分岩白菜素具有抗炎、抗氧化和免疫调节的功效。
12.本发明的第二个方面，提供上述中药组合物的制备方法，所述方法包括步骤如下：
13.将上述原料药材粉碎，加入乙醇，加热回流提取，浓缩得醇提液；将醇提后的药渣加入水，加热回流提取，浓缩得水提液，将所述醇提液与水提液合并，浓缩得药膏。
14.本发明通过对原料药同时采用醇提和水提工艺，从而将脂溶性和水溶性有效成分进行科学组合，从而最大限度地提升了上述中药组合物的免疫调节、抑制肿瘤细胞、抗转移和抗耐药的治疗效果。
15.本发明的第三个方面，提供上述中药组合物在制备治疗肺癌的药物制剂中的应用。
16.本发明的第四个方面，提供一种治疗肺癌的药物制剂，所述药物制剂由上述中药组合物和药学上可接受的辅料制备而成。
17.本发明的第五个方面，提供一种治疗肺癌的方法，所述方法包括：向受试者施用治疗有效剂量的上述药物组合物或上述药物制剂。
18.与现有技术相比，上述一个或多个技术方案取得了以下有益效果：
19.上述技术方案提供一种治疗肺癌的中药组合物，经体外和体内疗效研究证明，本发明的中药组合物及其中药制剂具有良好的免疫调节、抑制肿瘤细胞、抗转移和抗耐药等多种治疗肺癌效果，且对受试者安全性高；同时，优化制备工艺，通过科学组方以及水溶性和脂溶性有效成分浸提制备获得，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
20.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
21.图1为本发明实施例中灵丹百茶方对肺癌a549细胞增殖的影响。
22.图2为本发明实施例中灵丹百茶方诱导人肺癌a549细胞凋亡；其中，a为dapi染色结果图；b为细胞凋亡流式检测结果图；c为细胞凋亡率。统计学标识：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与空白组比较。
23.图3为本发明实施例中灵丹百茶方对a549细胞迁移能力的影响；其中，a为伤口愈
合试验的代表性显微图像；b为腔室膜迁移试验所得的代表性显微图像；c为腔室膜迁移试验中相对迁移细胞数柱状图。统计学标识：*p<0.05，**p<0.01，与空白组比较。
24.图4为本发明实施例中灵丹百茶方对a549细胞侵袭能力的影响；其中，a为腔室膜侵袭试验的代表性显微图像；b为腔室膜侵袭试验中相对侵袭细胞数柱状图。统计学标识：**p<0.01，与空白组比较。
25.图5为本发明实施例中灵丹百茶方(cmfe)对atp酶水解活性的影响。
26.图6为本发明实施例中灵丹百茶方对lewis肺癌小鼠体重的影响。图中标识：mc：模型组；ctx：环磷酰胺阳性对照组；cmfe
‑
l和cmfe
‑
h：分别为灵丹百茶方低和高剂量组。
27.图7为本发明实施例中灵丹百茶方对lewis肺癌小鼠血清中生化因子的影响；其中，a、b、c、d分别为荷瘤小鼠血清中生化因子ast、alt、bun、cr的含量结果图。图中标识：mc：模型组；cmfe
‑
l和cmfe
‑
h：分别为灵丹百茶方低剂量和高剂量组。
28.图8为本发明实施例中灵丹百茶方对lewis肺癌小鼠肿瘤生长的影响。图中标识：mc：模型组；ctx：环磷酰胺阳性对照组；cmfe
‑
l和cmfe
‑
h：分别为灵丹百茶方低和高剂量组。统计学标识：***p<0.001，与模型组(mc)比较。
29.图9为本发明实施例中灵丹百茶方对lewis肺癌小鼠生存期的影响。图中标识：mc：模型组；cmfe
‑
l和cmfe
‑
h：分别为灵丹百茶方低和高剂量组。
30.图10为本发明实施例中灵丹百茶方对lewis肺癌移植瘤肺转移的影响；其中，a每组小鼠全肺的代表性照片和肺组织切片的h&e染色图；b为整个肺组织中迁移的肿瘤数。图中标识：mc：模型组，cmfe
‑
l和cmfe
‑
h：分别为灵丹白茶方低和高剂量组；统计学标识：**p<0.01and***p<0.001，与模型组(mc)比较。
31.图11为本发明实施例中灵丹百茶方调节肿瘤组织中e
‑
cadherin、mmp
‑
2和mmp9蛋白的表达；其中，a为e
‑
cadherin、mmp
‑
2和mmp9免疫组织化学的代表性显微照片；b为针对β
‑
肌动蛋白标准化的e
‑
cadherin、mmp
‑
2和mmp9蛋白的定量光密度分析柱状图。图中标识：mc：模型组；cmfe
‑
l和cmfe
‑
h：分别为灵丹白茶方低和高剂量组；统计学标识：*p<0.05，与模型组(mc)比较。
32.图12为本发明实施例中灵丹百茶方对lewis肺癌小鼠脾脏t淋巴细胞增殖的影响。图中标识：nc：正常对照组；mc：模型组；cmfe
‑
l和cmfe
‑
h：分别为灵丹白茶方低和高剂量组；统计学标识：##p<0.01，与正常对照组(nc)比较；*p<0.05，**p<0.01，与模型组(mc)比较。
33.图13为本发明实施例中灵丹百茶方对lewis肺癌小鼠脾脏中nk细胞杀伤活性的影响。图中标识：nc：正常对照组；mc：模型组；cmfe
‑
l和cmfe
‑
h：分别为灵丹白茶方低和高剂量组；统计学标识：##p<0.01，与正常对照组(nc)比较；*p<0.05，**p<0.01，与模型组(mc)比较。
34.图14为本发明实施例中灵丹百茶方对lewis肺癌小鼠瘤组织中细胞因子的影响；其中，a、b、c、d分别为肿瘤组织中il
‑
2，ifn
‑
γ，il
‑
10，tgf
‑
β的含量图。图中标识：mc：模型组；cmfe
‑
l和cmfe
‑
h：分别为灵丹白茶方低和高剂量组；统计数据：*p<0.05and**p<0.01，与模型组(mc)比较。
具体实施方式
35.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另
有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
36.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
37.结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；在本发明没有特别限定，均可通过商业途径购买得到。
38.本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种治疗肺癌的中药组合物，所述治疗肺癌的中药组合物包括以下重量份的原料药：
39.灵芝6
‑
24份、丹参10
‑
30份、百部3
‑
18份、矮地茶10
‑
60份。
40.本发明提供的“灵丹百茶方”由以下四味中药材组成：灵芝、丹参、百部、矮地茶。现代药理学研究表明灵芝具有增强免疫力、保肝护肝、抗肿瘤等药理作用，灵芝水提物和灵芝多糖在几种荷瘤动物体内均表现出明显的抑制肿瘤生长和转移的作用，主要依靠其增强机体的免疫活性；而灵芝乙醇提取物或灵芝三萜类成分具有抗肿瘤作用，这可能与其抑制细胞增殖，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡等多种机制相关。丹参提取物及其主要活性成分具有抑制肿瘤生长和转移的作用，其中涉及的作用机制包括抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制肿瘤侵袭和转移、抑制血管生成、增强机体免疫、逆转肿瘤多药耐药等多个环节。百部中药材的选用重点考虑了其补气滋阴的功效，另外百部的脂溶性主要成分百部生物碱抗肿瘤和抗耐药的特殊功效。矮地茶具有化痰止咳、清热解毒、活血化瘀功效，而其主要活性成分岩白菜素具有抗炎、抗氧化和免疫调节的功效。
41.因此，所述治疗肺癌的疗效具体表现为如下任意一种或多种：
42.a)抑制肿瘤细胞增殖；
43.b)诱导肿瘤细胞凋亡；
44.c)抑制肿瘤细胞迁移；
45.d)抑制肿瘤细胞侵袭；
46.e)抑制肿瘤耐药；
47.f)抑制肿瘤生长；
48.g)延长受试者生存期；
49.h)抑制肺癌自发性肺转移；
50.i)调节肿瘤组织中转移相关蛋白表达水平；
51.j)恢复受试者t淋巴细胞增殖能力，改善受试者细胞免疫功能；
52.k)增强受试者nk细胞的杀伤活性；
53.l)调节肿瘤微环境中的细胞因子表达水平。
54.其中，所述肿瘤为肺癌。
55.所述肿瘤细胞以a549细胞为例。
56.所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物(如小鼠、人等)。
57.所述e)中，抑制肿瘤耐药具体表现为：抑制p糖蛋白(p
‑
gp)外排活性。
58.所述i)中，肿瘤组织中转移相关蛋白包括e
‑
钙黏蛋白(e
‑
cadherin)、mmp
‑
2和mmp
‑
9；更具体的，所述调节肿瘤组织中转移相关蛋白表达水平表现为：促进肺肿瘤组织中e
‑
cadherin的表达，抑制mmp
‑
2、mmp
‑
9蛋白的表达。
59.所述l)中，所述细胞因子包括il
‑
2、ifn
‑
γ、il
‑
10和tgf
‑
β；更具体的，所述调节肿瘤微环境中的细胞因子表达水平表现为：促进肿瘤组织中il
‑
2和ifn
‑
γ的表达，抑制肿瘤组织中il
‑
10和tgf
‑
β的表达。
60.本发明的又一具体实施方式中，提供上述中药组合物的制备方法，所述方法包括步骤如下：
61.将上述原料药材粉碎，加入乙醇，加热回流提取，浓缩得醇提液；将醇提后的药渣加入水，加热回流提取，浓缩得水提液，将所述醇提液与水提液合并，浓缩得药膏。
62.其中，所述原料药与乙醇的质量比为1：6
‑
10，如1：8；所述乙醇浓度控制为60
‑
100％，如70％、90％、100％；
63.更具体的，醇提过程中，所述加热回流提取具体方法包括：加热回流提取两次，每次1小时，过滤得滤液，合并两次滤液，浓缩得醇提液。
64.所述药渣与水的质量比为1：4
‑
8，如1：6；
65.更具体的，水提过程中，所述加热回流提取具体方法包括：加热回流提取两次，每次1小时，过滤得滤液，合并两次滤液，浓缩得水提液。
66.本发明通过对原料药同时采用醇提和水提工艺，从而将脂溶性和水溶性有效成分进行科学组合，从而最大限度地提升了上述中药组合物的免疫调节、抑制肿瘤细胞、抗转移和抗耐药的治疗效果。
67.本发明的又一具体实施方式中，提供上述中药组合物在制备治疗肺癌的药物制剂中的应用。
68.本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗肺癌的药物制剂，所述药物制剂由上述中药组合物和药学上可接受的辅料制备而成。
69.所述药物制剂可以制成各种药物剂型，如口服液、汤剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂或吸入剂等各种适于临床应用的制剂类型。
70.所述药物制剂中药学上可接受的辅料包括但不限于稀释剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、结合剂、流动剂、复合形成剂、塑化剂、着色剂、甜味剂、黏度增强剂、保存剂或抗氧化剂中的一种或多种。
71.本发明的又一具体实施方式中，
72.所述稀释剂包括但不限于山梨醇、甘露醇、淀粉、乳糖、粉状或微晶纤维素、二钙磷酸盐，三钙磷酸盐等；
73.所述填充剂包括但不限于羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、胶化淀粉等；
74.所述崩解剂包括但不限于干淀粉、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素等；
75.所述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠或微粉硅胶等。
76.本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗肺癌的方法，所述方法包括：向受试
者施用治疗有效剂量的上述药物组合物或上述药物制剂。
77.所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物(如小鼠、人等)。
78.所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。
79.必须认识到，本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。
80.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
81.药膏和制剂制备实施例：
82.实施例1：根据本发明公开的配方和制备方法，发明人通过以下过程制得实施例1的中药材提取物：将灵芝、丹参、百部、矮地茶等四种药材粉碎成粗粉，分别称取灵芝600克、丹参1000克、百部300克、矮地茶1500克，加入8倍量的70％乙醇，加热回流提取两次，每次1小时，过滤得滤液，合并两次滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至适量；醇提后的药渣加入6倍量的去离子水，加热回流提取两次，每次1小时，过滤得滤液，合并两次滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至适量；然后将醇提液与水提液合并，再次用旋转蒸发仪减压浓缩成药膏。
83.实施例2：根据本发明公开的配方和制备方法，发明人通过以下过程制得实施例2的中药材提取物：将灵芝、丹参、百部、矮地茶等四种药材粉碎成粗粉，分别称取灵芝1200克、丹参1500克、百部750克、矮地茶1000克，加入8倍量的90％乙醇，加热回流提取两次，每次1小时，过滤得滤液，合并两次滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至适量；醇提后的药渣加入6倍量的去离子水，加热回流提取两次，每次1小时，过滤得滤液，合并两次滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至适量；然后将醇提液与水提液合并，再次用旋转蒸发仪减压浓缩成药膏。
84.实施例3：根据本发明公开的配方和制备方法，发明人通过以下过程制得实施例3的中药材提取物：将灵芝、丹参、百部、矮地茶等四种药材粉碎成粗粉，分别称取灵芝1200克、丹参1500克、百部900克、矮地茶3000克，加入8倍量的100％乙醇，加热回流提取两次，每次1小时，过滤得滤液，合并两次滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至适量；醇提后的药渣加入6倍量的去离子水，加热回流提取两次，每次1小时，过滤得滤液，合并两次滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至适量；然后将醇提液与水提液合并，再次用旋转蒸发仪减压浓缩成药膏。
85.实施例4：将实施例1中所制备的药膏与100克聚维酮k30、600克乳糖、200克微晶纤维素ph 101混合均匀，采用湿法制粒或流化床制粒，制粒结束后干燥15分钟。过40目筛整粒，再称取60克交联聚维酮xl
‑
10和10克硬脂酸镁，加入上述颗粒中，混合均匀。直接填充至药包或填充至胶囊或压片，即得所述的最终制剂。片剂产品如有必要，可包薄膜衣。
86.实施例5：将实施例2中所制备的药膏与125克聚维酮k30、762.5克乳糖、250克微晶纤维素ph 101混合均匀，采用湿法制粒或流化床制粒，制粒结束后干燥15分钟。过40目筛整粒，再称取75克交联聚维酮xl
‑
10和12.5克硬脂酸镁，加入上述颗粒中，混合均匀。直接填充至药包或填充至胶囊或压片，即得所述的最终制剂。片剂产品如有必要，可包薄膜衣。
87.实施例6：将实施例3中所制备的药膏与200克羟丙甲基纤维素e15、1220克乳糖、400克微晶纤维素ph 101混合均匀，采用湿法制粒或流化床制粒，制粒结束后干燥15分钟。过40目筛整粒，再称取120克交联聚维酮xl
‑
10和20克硬脂酸镁，加入上述颗粒中，混合均匀。直接填充至药包或填充至胶囊或压片，即得所述的最终制剂。片剂产品如有必要，可包薄膜衣。
88.体外疗效研究实施例：
89.实施例7：抑制人肺癌a549细胞增殖体外研究。将不同浓度的灵丹百茶方实施例1所制备的药膏(0、25,、50、100、200、400μg/ml)作用于a549细胞(细胞浓度为3
×
104/ml)24、48、72小时后，采用mtt实验检测改良方对人肺腺癌a549细胞增殖的抑制作用。如图1所示，灵丹百茶方药膏能够明显地抑制肺癌a549细胞的增殖，且具有浓度和时间依赖性，作用24、48、72小时的ic
50
值分别为330.2
±
9.5、125.3
±
7.2、56.0
±
3.2μg/ml。
90.实施例8：诱导人肺癌a549细胞凋亡体外研究。为了探讨灵丹百茶方是否诱导a549细胞凋亡，将实施例2所制备的灵丹百茶方药膏(0、50、100、200μg/ml)作用于a549细胞(细胞浓度为1
×
105/ml)48小时后，先采用dapi染色的方法于显微镜下观察了细胞的形态学。由图2a可知，未处理的a549细胞数量较多，染色均一且轮廓清晰，不同浓度的灵丹百茶方处理后，a549细胞出现了典型的凋亡特征的形态改变，染色质浓缩聚集出现凋亡小体如红色箭头所示。后续进一步采用annexin v
‑
fitc/pi双染法经流式细胞术检测灵丹百茶方对a549细胞凋亡的影响。结果如图2b和2c所示，用不同浓度的灵丹百茶方处理a549细胞后，早期凋亡和晚期凋亡的细胞的数量均显著增加，与未处理对照组有显著差异，对细胞的凋亡诱导作用呈浓度依赖性。200μg/ml的灵丹百茶方处理后，细胞的总凋亡比率从5.2％(对照组)上升到34.9％。由此表明，灵丹百茶方作用后可诱导a549细胞凋亡。
91.实施例9：抑制人肺癌a549细胞迁移体外研究。首先将实施例3所制备的灵丹百茶方药膏(0、25、50、100μg/ml)与抗人肺癌a549细胞(细胞浓度为2
×
105/ml)共培养48；采用transwell迁移实验进行迁移研究，为避免增殖抑制作用的干扰，提前将药物干预a549细胞48h后加入transwell小室。如图3所示，与未处理的细胞相比，不同浓度的灵丹百茶方处理后，a549细胞迁移到小室底部表面的数量均显著减少，差异具有统计学意义(p<0.01)，25、50、100μg/ml的灵丹百茶方作用后，细胞迁移到下室的相对百分比分别下降至75.4％、53.6％、31.0％。进一步证明灵丹百茶方可抑制a549细胞的迁移能力，且这种抑制作用呈浓度依赖性。
92.实施例10：抑制人肺癌a549细胞侵袭体外研究。侵袭实验与迁移实验不同之处在于transwell小室的底部铺有一层matrigel基质胶，模拟人体细胞外基质(ecm)，具有侵袭能力的肿瘤细胞通过分泌基质金属蛋白酶(mmps)降解ecm后才可穿越至小室底部，因此穿越至小室底部的细胞数量可用来评价细胞的侵袭能力。将不同浓度的实施例1所制备的灵丹百茶方药膏(0、25、50、100μg/ml)与a549细胞(细胞浓度为2
×
105/ml)培养48小时后，采用transwell法开展侵袭实验，为避免增殖抑制作用的干扰，提前将药物干预a549细胞48小时后加入transwell小室。结果如图4所示，不同浓度的灵丹百茶方作用后，a549细胞的侵袭能力明显降低，25μg/ml的灵丹百茶方处理组与未处理的细胞没有显著性差异(p>0.05)，随着灵丹百茶方浓度的增加，对a549细胞侵袭能力的抑制作用愈加明显，50、100μg/ml的灵丹百茶方处理组有统计学意义(p<0.01)。
93.实施例11：抑制p
‑
gp外排抗耐药体外研究。灵丹百茶方抗耐药的疗效是通过测量表达p
‑
gp的high
‑
five昆虫细胞粗膜中的atp酶水解活性来确定的。将不同浓度(0、50、100、150、200μm)的实施例2所制备的灵丹百茶方药膏在昆虫细胞粗膜(100μ蛋白/ml)中培养，使用比色法测量在37℃下20分钟释放的无机磷酸盐的量，p
‑
gp外排活性被记录为钒酸盐敏感的atp酶水解活性。如图5所示，随着灵丹百茶方药物浓度的增加，atp酶水解活性增加，而p
‑
gp外排活性降低，进而起到抗耐药作用。
94.体内疗效研究实施例：
95.实施例12：lewis肺癌小鼠模型的制备。小鼠适应环境一周后，皮下接种lewis肺癌细胞(llc)构建lewis肺癌模型，步骤如下：取指数生长期的llc细胞，经0.25％的胰蛋白酶消化后，用无菌pbs洗涤，1000rpm离心3分钟，弃掉上清细胞沉淀重悬于无菌pbs溶液并调节细胞浓度为2.5
×
106个/ml，置于冰上备用。用75％酒精擦拭小鼠右上肢腋下皮肤，用1ml胰岛素针吸取0.2ml细胞悬液，皮下注射接种于小鼠右侧前肢腋下，制成lewis肺癌小鼠模型，全程严格无菌操作40分钟内完成。
96.实施例13：lewis肺癌小鼠给药实验。接种后的第二天，将c57bl/6j小鼠随机分为四组，模型对照组(mc)18只，将实施例2所制备的灵丹百茶方药膏均匀地分散于含0.5％羧甲基纤维素钠(cmc
‑
na)的水溶液，灌胃给药，体积为0.1ml/10g；灵丹百茶方低、高剂量组(cmfe
‑
l、cmfe
‑
h)各18只，分别灌胃给予200mg/kg、400mg/kg的灵丹百茶方，体积为0.1ml/10g；以上三组中8只小鼠用于生存期实验，剩余10只用于抑瘤作用研究。阳性对照环磷酰胺组(ctx)10只，腹腔注射给予环磷酰胺30mg/kg。上述四组实验小鼠每天给药一次，连续21天。
97.实施例14：对lewis肺癌小鼠体重影响研究。给药期间每隔2天称量小鼠体重并记录。在实验期间记录各组小鼠的体重，绘制体重曲线如图6所示。在实验期间，灵丹百茶方(cmfe)给药各组小鼠的体重均有不同程度的增加。在给药结束后，与模型对照组(mc)相比，没有太大的变化，而阳性对照环磷酰胺组(ctx)小鼠体重在实验初期有所下降，后期有所增加但增长较缓慢，仍明显低于各组。这表明小鼠对灵丹百茶方有较好的顺应性，在给药剂量下灵丹百茶方具有较好的安全性。
98.实施例15：对lewis肺癌小鼠毒性研究。为了评价灵丹百茶方在小鼠体内的肝肾毒性，检测lewis肺癌小鼠血清中肝功能和肾功能的生化因子指标alt、ast、bun和cr的含量。结果如图7所示，灵丹百茶方低和高剂量(cmfe
‑
l和cmfe
‑
h)给药后，小鼠血清中的alt、ast、bun和cr的含量与模型对照组(mc)相比均没有显著性差异(p>0.05)。由以上结果可知灵丹百茶方对小鼠的肝脏和肾脏没有造成明显损伤。
99.实施例16：抑瘤功效研究。为了评价灵丹百茶方(cmfe)对lewis肺癌小鼠肿瘤生长的作用，在给药结束后，于小鼠眼眶静脉丛取血，取血后将小鼠脱颈处死，剥离肿瘤和主要脏器并称重，计算各组抑瘤率。取一部分肿瘤组织和肝肾组织于4％多聚甲醛中固定，用于石蜡包埋，其余瘤组织经液氮速冻后保存于﹣80℃冰箱中。各组小鼠的平均瘤重如图8所示，模型对照组的平均瘤重为2.31
±
0.65克，经200、400mg/kg的灵丹百茶方灌胃给药治疗后小鼠的平均瘤重均明显减小，灵丹百茶方低和高(cmfe
‑
l和cmfe
‑
h)组的平均瘤重分别为1.13
±
0.41和0.75
±
0.33克，对lewis肺癌小鼠的抑瘤率分别为51.2％和67.4％，环磷酰胺组的平均瘤重最小，抑瘤率为74.3％。随着灵丹百茶方剂量的增加，抑瘤作用显著增强(p＜
0.05)，具有剂量依赖性，这说明低、高剂量的灵丹百茶方均能显著抑制lewis肺癌小鼠肿瘤的生长。
100.实施例17：生存期研究。记录除正常对照组外其余各组8只小鼠的生存时间，从小鼠接种llc细胞开始直至小鼠自然死亡。结果如图9所示，模型对照组(mc)小鼠最早出现死亡现象，平均时间为35.1
±
4.5天，中位生存时间为36.0天。灵丹百茶方低和高剂量组(cmfe
‑
l和cmfe
‑
h)小鼠的平均时间分别为43.6
±
3.9天和49.4
±
3.3天，中位生存时间分别为44.0天和50.0天，与模型对照组相比均明显延长。灵丹百茶方低、高剂量组小鼠的生命延长率分别为24.2％和40.7％。
101.实施例18：抑制lewis肺癌自发性肺转移研究。将动物脱颈椎处死后，打开胸腔完整的将肺脏取出，然后用bouin液固定，24小时后观察，肺组织呈黄色，肿瘤转移灶呈白色类圆形隆起。如图10所示，模型对照组(mc)、灵丹百茶方低和高剂量组(cmfe
‑
l和cmfe
‑
h)小鼠肺转移灶发生率分别为100％、80％和50％。mc组小鼠肺转移灶形成较多且大，灵丹百茶方低和高剂量组中肺表面肺结节的平均数量均明显减少(p<0.001)，灵丹百茶方低和高剂量组的肺转移抑制率分别为59.2％和78.6％。此外，h&e染色结果显示，与mc组相比，高、低剂量的灵丹百茶方给药后，肺组织中炎性细胞浸润和肺泡间隔增厚的情况均明显减轻。由此表明，灵丹百茶方对lewis肺癌肿瘤肺转移具有明显的抑制作用。
102.实施例19：对lewis肺癌肿瘤组织中转移蛋白的研究。e
‑
cadherin和mmps与肿瘤的侵袭与转移密切相关，采用免疫组化和western blot法检测了肿瘤组织中转移相关的e
‑
cadherin、mmp
‑
2和mmp
‑
9蛋白的表达。如图11所示，与模型对照组(mc)相比，灵丹百茶方低和高剂量组(cmfe
‑
l和cmfe
‑
h)给药后肿瘤组织中e
‑
cadherin蛋白的表达明显增加，两个剂量组与模型对照组均有显著差异(p<0.01)。低、高剂量的灵丹百茶方给药后，肿瘤组织中mmp
‑
2和mmp
‑
9蛋白的表达均显著降低，与模型对照组有显著差异(p<0.05)。由此说明，灵丹百茶方可通过上调肿瘤组织中e
‑
cadherin的表达，抑制mmp
‑
2、mmp
‑
9蛋白的表达，从而抑制lewis肺癌模型中肿瘤的肺转移。
103.实施例20：对lewis肺癌小鼠脾t淋巴细胞增殖的研究。细胞免疫过程主要由t淋巴细胞介导完成，在机体抗肿瘤的过程中发挥抑制肿瘤细胞生长和杀伤肿瘤细胞的重要作用。使用cona诱导脾脏中t淋巴细胞的增殖，采用cck
‑
8法检测t淋巴细胞的增殖能力。结果如图12所示，模型对照组(mc)lewis肺癌小鼠脾脏中t淋巴细胞的增殖能力明显低于正常组(p<0.01)，说明荷瘤小鼠处于免疫抑制状态。而灵丹百茶方低和高剂量组(cmfe
‑
l和cmfe
‑
h)给药后可显著恢复lewis肺癌荷瘤小鼠脾脏中t淋巴细胞的增殖能力(p<0.05)，但仍低于正常对照组。由此说明，灵丹百茶方可以改善荷瘤小鼠的细胞免疫功能从而提高机体的抗肿瘤作用。
104.实施例21：增强lewis肺癌小鼠脾脏中nk细胞的杀伤活性研究。nk细胞通过多种方式参与机体抑制肿瘤生长的过程。如图13所示，lewis肺癌模型对照组(mc)小鼠脾脏中nk细胞活性明显低于正常对照组，而灵丹百茶方低和高剂量组(cmfe
‑
l和cmfe
‑
h)给药处理后荷瘤小鼠nk细胞的杀伤活性明显增强(p<0.01)，且随着灵丹百茶方给药剂量的增加，荷瘤小鼠nk细胞的杀伤活性增强效果愈加明显，灵丹百茶方高剂量组nk细胞活性比模型对照组提升了52.3％。
105.实施例22：对肿瘤组织中il
‑
2、ifn
‑
γ、il
‑
10和tgf
‑
β水平的影响。细胞因子在抗
肿瘤作用中扮演着重要的角色，il
‑
2和ifn
‑
γ等细胞因子可以有效激活机体的抗肿瘤免疫应答，在机体抗肿瘤过程中发挥积极作用。il
‑
10和tgf
‑
β是重要的负性免疫调节因子，抑制t细胞介导的抗肿瘤免疫反应，采用酶联免疫吸附法(elisa)测定lewis肺癌小鼠肿瘤组织匀浆中细胞因子的含量。如图14所示，而灵丹百茶方低和高剂量组(cmfe
‑
l和cmfe
‑
h)组肿瘤组织中il
‑
2的含量明显高于模型对照组(mc)，高剂量组差异存在统计学意义(p<0.05)，同样灵丹百茶方给药后可显著增加肿瘤组织中ifn
‑
γ的含量(p<0.01)。与lewis肺癌模型对照组(mc)相比较，灵丹百茶方组的肿瘤组织中il
‑
10和tgf
‑
β的表达均明显降低，具有显著差异(p<0.05)。以上结果表明，灵丹百茶方可调节肿瘤微环境中的细胞因子水平，从而在lewis肺癌模型中发挥抗肿瘤的作用。
106.应注意的是、以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明、但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换、而不脱离本发明技术方案的精神和范围。