一种桂花提取物及其制备方法和护肤应用与流程

1.本发明属于植物提取研究领域，具体涉及一种桂花提取物的制备方法及护肤应用。


背景技术：

2.桂花(osmanthus fragrans lour.)，系木犀科常绿灌木或小乔木，桂花在我国已有2500年的栽培历史。桂花除供观赏、美食外，根、花和果实都可药用除病，性温、味辛、无毒，有化痰、散淤、健脾益肾、舒筋活络的功能。明代李时珍著的《本草纲目》中早有记载：桂花能“治百病，养精神，和颜色，为诸药先聘通使，久服轻身不老，面生光华、媚好常如童子”。《说文解字》在解释“桂”字时说它是“百药之父”。祖国医学认为，桂花性温味辛，具有健胃、化痰、生津、散痰、平肝的作用。现代医药研究证明：桂花含有大量的黄酮、齐墩果酸、熊果酸，这些物质均具有抗氧化、抗损伤作用。至今为止，对桂花的研究利用多集中于其挥发性芳香组分，尚未见到从桂花中提取该有效物质并进行药理研究的报道。基于以上原因，本发明对桂花中有效物质的制备工艺进行了详细研究。
3.专利(cn105832603a)公开了一种桂花提取物的制备方法，步骤包括：1)选取干桂花为原料，进行粉碎；2)加入步骤1)所得原料质量的5-20倍的溶剂，在25-95℃下，搅拌提取桂花提取液30-180分钟，过滤；3)将步骤2)所得桂花提取液离心，纯化，收集滤过液；
4.4)将滤过液浓缩至浸膏比重为1.10-1.30，得到桂花提取浸膏；5)对所述桂花提取浸膏进行干燥，得到桂花提取物。但该发明仅通过水或低浓度乙醇对桂花进行提取，提取杂质较多，后续分离纯化困难，整体应用性不佳。专利(cn110787218a)公开了一种桂花提取物的提取工艺，步骤如下：步骤一，粉碎干燥：将新鲜的桂花真空干燥，粉碎后过筛，得到桂花粉末；步骤二，萃取超声：将桂花粉末浸没在氯仿和乙醇溶液的混合溶液中回流萃取，得到萃取液，再向萃取液中加入乙醇溶液，进行超声处理，离心后取上层清液，得到提取液；步骤三，过滤浓缩：对提取液进行过滤，将过滤去渣后的滤液水浴浓缩，纯化后得到浓缩液；步骤四，灭菌干燥：将浓缩液进行超高压灭菌，再经过冷冻干燥和筛分后，即可得到桂花提取物。该发明仅通过氯仿和乙醇对桂花进行提取，虽然获得的桂花提取物具有良好的抑菌活性，但《化妆品安全技术规范(2015版)》中明确规定：氯仿属于化妆品禁用组分，限制了其在化妆品领域的应用。
5.目前，桂花提取物尚未广泛应用于化妆品或护肤品领域，开发一种活性成分含量高、质量可控、整体应用性广的桂花提取物制备方法，并将所得桂花提取物应用于护肤品领域，对桂花的深度开发及广泛应用具有重要意义。


技术实现要素：

6.基于上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的问题是提供一种桂花提取物及其制备方法。该桂花提取物具有抑制非酶糖基化、抵御肌肤光老化、抑制黑色素分泌、提亮肤色和焕白等功效，可将其应用于抗衰老和/或抗光老化和/或美白护肤品和/或化妆品中；
7.本发明制备方法提高了桂花毛蕊花糖苷和红景天苷得率，制得的桂花提取物活性成分含量高。
8.本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方式来实现的：
9.本发明第一方面提供了一种桂花提取物。
10.根据本发明，所述桂花提取物通过闪式提取联合热回流提取工艺制备。
11.根据本发明，所述桂花提取物通过包括以下步骤的制备方法制备：
12.1)原料预处理；
13.2)将步骤1)预处理所得桂花按一定料液比加入提取溶剂中进行闪式提取，得桂花闪式提取液；
14.3)将步骤2)所得桂花闪式提取液进行热回流提取。
15.根据本发明，所述步骤2)中料液比为1:10-1:30(m/v)，例如可以是1:10(m/v)、1:11(m/v)、1:12(m/v)、1:15(m/v)、1:20(m/v)、1:25(m/v)、1:30(m/v)，以及上述数值之间的点值。
16.根据本发明，所述步骤2)中提取溶剂为乙醇溶液。
17.根据本发明，所述步骤2)中乙醇溶液体积分数为40-95％，例如可以是40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％，以及上述数值之间的点值。
18.根据本发明一些具体实施方式，所述步骤2)中乙醇溶液浓度为60-95％。
19.根据本发明，所述步骤2)中闪式提取电压为75-100v，例如可以是75v、85v、90v、95v、100v，以及上述数值之间的点值。
20.根据本发明，所述步骤2)中提取时间为30-60s，例如可以是30s、35s、40s、45s、50s、55s、60s，以及上述数值之间的点值。
21.根据本发明，所述步骤3)中热回流提取温度为55-80℃，例如可以是55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，以及上述数值之间的点值。
22.根据本发明，所述步骤3)中热回流提取时间为1.0-2.0h，例如可以是1.0h、1.1h、1.2h、1.3h、1.5h、1.8h、2.0h，以及上述数值之间的点值。
23.根据本发明的一些具体实施方式，步骤1)所述原料预处理包括粉碎。
24.根据本发明，以桂花原料质量计，通过本发明步骤3)所述桂花提取物中毛蕊花糖苷得率为6.0％-9.5％，红景天苷得率为0.6％-0.85％。
25.根据本发明一些具体实施方式，以桂花原料质量计，通过本发明步骤3)所述桂花提取物制备工艺所得毛蕊花糖苷得率为6.2％-9.3％，红景天苷得率为0.63％-0.82％。
26.根据本发明，所述桂花提取物的制备方法还包括：
27.4)将步骤3)所得桂花提取液加入预处理好的大孔树脂柱，洗脱，收集洗脱液，干燥，得桂花提取物。
28.根据本发明，通过本发明步骤4)所述桂花提取物制备工艺所得桂花提取物中毛蕊花糖苷含量为48.0％-52.5％，红景天苷含量为5.0％-6.0％。
29.根据本发明一些具体实施方式，通过本发明步骤4)所述桂花提取物制备工艺所得桂花提取物中毛蕊花糖苷含量为48.0％-52.1％，红景天苷含量为5.1％-5.75％。
30.根据本发明，所述步骤4)中大孔树脂柱型号为d101或ab-8。
31.根据本发明，所述步骤4)中洗脱液为水和/或95％乙醇溶液。
32.根据本发明，所述步骤4)中还包括大孔吸附树脂活化及再生，具体方法为：将大孔吸附树脂中分别放入95％乙醇浸泡12h，随后装入层析柱(长约1/2-2/3处)。随后用水洗涤至固含为0，以除去树脂中的有机物；然后配制4％的hcl溶液，并加入层析柱中，浸泡树脂3h(液面达树脂上方2cm左右)，随后用水洗涤至ph值为7左右(洗至中性)，置换除去树脂中的带正电荷杂质；然后配制4％的naoh溶液，重复上述操作，置换除去树脂中的带负电荷杂质。
33.根据本发明的一些具体实施方式，步骤1)所述原料预处理包括粉碎。
34.本发明第二方面提供一种本发明第一方面所述桂花提取物的制备方法。
35.根据本发明，所述制备方法包括以下步骤：
36.1)原料预处理；
37.2)将步骤1)预处理所得桂花按1:10-1:30(m/v)料液比加入40-95％乙醇溶液中，在提取电压75-100v条件下闪式提取30-60s，得桂花闪式提取液；
38.3)将步骤2)所得桂花闪式提取液在提取温度为55-85℃条件下热回流提取1.0-2.0h。
39.根据本发明，所述步骤2)中料液比为1:10-1:30(m/v)，例如可以是1:10(m/v)、1:11(m/v)、1:12(m/v)、1:15(m/v)、1:20(m/v)、1:25(m/v)、1:30(m/v)，以及上述数值之间的点值。
40.根据本发明，所述步骤2)中提取溶剂为乙醇溶液。
41.根据本发明，所述步骤2)中乙醇溶液体积分数为40-95％，例如可以是40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％，以及上述数值之间的点值。
42.根据本发明一些具体实施方式，所述步骤2)中乙醇溶液体积分数为60-95％。
43.根据本发明，所述步骤2)中闪式提取电压为75-100v，例如可以是75v、85v、90v、95v、100v，以及上述数值之间的点值。
44.根据本发明，所述步骤2)中提取时间为30-60s，例如可以是30s、35s、40s、45s、50s、55s、60s，以及上述数值之间的点值。
45.根据本发明，所述步骤3)中热回流提取温度为55-80℃，例如可以是55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，以及上述数值之间的点值。
46.根据本发明，所述步骤3)中热回流提取时间为1.0-2.0h，例如可以是1.0h、1.1h、1.2h、1.3h、1.5h、1.8h、2.0h，以及上述数值之间的点值。
47.根据本发明的一些具体实施方式，步骤1)所述原料预处理包括粉碎。
48.根据本发明，所述桂花提取物的制备方法还包括过滤。
49.根据本发明一些具体实施方式，所述制备方法中过滤滤板为h70纸板，直径0.3-0.5μm。
50.根据本发明，以桂花原料质量计，通过本发明步骤3)所述桂花提取物制备工艺所得毛蕊花糖苷得率为6.0％-9.5％，红景天苷得率为0.6％-0.85％。
51.根据本发明一些具体实施方式，以桂花原料质量计，通过本发明步骤3)所述桂花提取物制备工艺所得毛蕊花糖苷得率为6.2％-9.3％，红景天苷得率为0.63％-0.82％。
52.本发明第三方面提供一种本发明第一方面和/或第二方面所述桂花提取物的制备方法。
53.根据本发明，所述制备方法包括以下步骤：
54.1)原料预处理；
55.2)将步骤1)预处理所得桂花按1:10-1:30(m/v)料液比加入40-95％乙醇溶液中，在提取电压75-100v条件下闪式提取30-60s，得桂花闪式提取液；
56.3)将步骤2)所得桂花闪式提取液在提取温度为55-85℃，热回流提取1.0-2.0h，得桂花提取液；
57.4)将步骤3)所得桂花提取液加入预处理好大孔树脂柱，用水和/或95％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，干燥得桂花提取物。
58.根据本发明，所述步骤2)中料液比为1:10-1:30(m/v)，例如可以是1:10(m/v)、1:11(m/v)、1:12(m/v)、1:15(m/v)、1:20(m/v)、1:25(m/v)、1:30(m/v)，以及上述数值之间的点值。
59.根据本发明，所述步骤2)中提取溶剂为乙醇溶液。
60.根据本发明，所述步骤2)中乙醇溶液体积分数为40-95％，例如可以是40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％，以及上述数值之间的点值。
61.根据本发明一些具体实施方式，所述步骤2)中乙醇溶液体积分数为60-95％。
62.根据本发明，所述步骤2)中闪式提取电压为75-100v，例如可以是75v、85v、90v、95v、100v，以及上述数值之间的点值。
63.根据本发明，所述步骤2)中提取时间为30-60s，例如可以是30s、35s、40s、45s、50s、55s、60s，以及上述数值之间的点值。
64.根据本发明，所述步骤3)中热回流提取温度为55-80℃，例如可以是55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，以及上述数值之间的点值。
65.根据本发明，所述步骤3)中热回流提取时间为1.0-2.0h，例如可以是1.0h、1.1h、1.2h、1.3h、1.5h、1.8h、2.0h，以及上述数值之间的点值。
66.根据本发明，所述步骤4)中大孔树脂柱型号为d101或ab-8。
67.根据本发明，所述步骤4)中洗脱液为水和/或95％乙醇溶液。
68.根据本发明，所述步骤4)中还包括大孔吸附树脂洗涤，具体方法为：将大孔吸附树脂中分别放入95％乙醇浸泡12h，随后装入层析柱(长约1/2-2/3处)。随后用水洗涤至固含为0，以除去树脂中的有机物；然后配制4％的hcl溶液，并加入层析柱中，浸泡树脂3h(液面高出树脂上方2cm左右)，随后用水洗涤至ph值为7左右(洗至中性)，置换除去树脂中的带正电荷杂质；然后配制4％的naoh溶液，重复上述操作，置换除去树脂中的带负电荷杂质。
69.根据本发明的一些具体实施方式，步骤1)所述原料预处理包括粉碎。
70.根据本发明，所述桂花提取物的制备方法还包括过滤。
71.根据本发明一些具体实施方式，所述制备方法中过滤滤板为h70纸板，直径0.3-0.5μm。
72.根据本发明，通过本发明步骤4)所述桂花提取物制备工艺所得桂花提取物中毛蕊花糖苷含量为48.0％-52.5％，红景天苷含量为5.0％-6.0％。
73.根据本发明一些具体实施方式，通过本发明步骤4)所述桂花提取物制备工艺所得桂花提取物中毛蕊花糖苷含量为48.0％-52.1％，红景天苷含量为5.1％-5.75％。
74.本发明第四方面提供本发明第一方面所述桂花提取物和/或本发明第二方面和/或第三方面所述制备方法制备得到的桂花提取物在护肤品中的应用。
75.根据本发明，所述桂花提取物在制备具有抗衰老护肤品和/或化妆品中的应用。
76.根据本发明，所述桂花提取物在制备具有抗光老化护肤品和/或化妆品中的应用。
77.根据本发明，所述桂花提取物在制备具有美白护肤品和/或化妆品中的应用。
78.根据本发明，所述护肤品和/或化妆品剂型例如可以是膏霜类、粉剂类、水剂类、乳液类、凝胶类、块状粉或固体类等，不做具体限制。
79.根据本发明，所述护肤品和/或化妆品例如可以是面霜、护肤水、精华、面膜等，不做具体限制。
80.本发明有益效果：
81.(1)本发明通过闪式提取联合热回流工艺制备桂花提取物，该制备方法提高了桂花毛蕊花糖苷和红景天苷得率，制备得到的桂花提取物中活性成分含量高。
82.(2)本发明制备的桂花提取物具有抑制非酶糖基化、抵御肌肤光老化、抑制黑色素分泌、提亮肤色和焕白等功效，可将其应用于抗衰老和/或抗光老化和/或美白护肤品和/或化妆品中。
附图说明
83.图1是桂花提取物抑制非酶糖基化检测结果；
84.图2是hff-1细胞的相对细胞活率曲线；
85.图3是hff-1细胞的细胞形态学观察结果；
86.图4是桂花提取物的col-i表达检测结果；
87.图5是b16-f10细胞的相对细胞活率曲线；
88.图6是b16-f10细胞的细胞形态学观察结果；
89.图7是桂花提取物抑制黑色素分泌检测结果。
具体实施方式
90.下面结合具体实例对本发明进行进一步阐述，但本发明并不局限于此。
91.本领域的普通技术人员应当认识到，本发明并不限于上述实施例，任何对本发明的变换、变型都落入本发明的保护范围。
92.下面实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述的实验材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
93.下列实施例中，原料：桂花(市售)；供应商：北京仟草中药饮片有限公司。
94.1、毛蕊花糖苷含量的测试方法：
95.采用hplc法测试桂花提取物中的毛蕊花糖苷含量。
96.1.1试验材料
97.磷酸、乙腈、甲醇、毛蕊花糖苷、三级用水。
98.1.2试验设备
99.hplc、分析天平、移液枪、漩涡混合器。
100.1.3试验方法
101.1.3.1样品处理
102.样品以50％甲醇稀释至1％进行后续试验。
103.1.3.2试验条件
104.表1试验条件
[0105][0106]
1.4结果计算
[0107]
以毛蕊花糖苷标准溶液的色谱峰平均峰面积为横坐标，理论浓度(μg/ml)为纵坐标作图并进行线性回归，得到标准曲线的回归方程为：y＝0.0587x-3.2196，r2＝0.9999，式中y和x分别是进样液中毛蕊花糖苷的含量(μg/ml)及其峰面积，根据标准曲线方程进行样品中毛蕊花糖苷的含量计算。
[0108]
2、红景天苷含量的测试方法：
[0109]
采用hplc法测试桂花提取物中的红景天苷含量。
[0110]
2.1试验材料
[0111]
甲醇、红景天苷、三级用水。
[0112]
2.2试验设备
[0113]
hplc、分析天平、移液枪、漩涡混合器。
[0114]
2.3.试验方法
[0115]
2.3.1样品处理
[0116]
样品用50％甲醇稀释至2mg/ml。
[0117]
2.3.2试验条件
[0118]
表2试验条件
[0119][0120]
1.4结果计算
[0121]
以红景天苷标准溶液的色谱峰平均峰面积为横坐标，理论浓度(μg/ml)为纵坐标作图并进行线性回归，得到标准曲线的回归方程为y＝0.2013x-0.0602，r2＝1.0000，式中，
y和x分别是进样液中红景天苷的含量(μg/ml)及其峰面积，根据标准曲线方程进行样品中红景天苷含量计算。
[0122]
实施例1-4
[0123]
1)原料预处理：将桂花粉碎；
[0124]
2)闪式提取：将步骤1)预处理桂花按1:20(m/v)料液比加入40-95％乙醇溶液中，在提取电压75v条件闪式提取60s，得桂花闪式提取液；
[0125]
3)热回流提取：将步骤2)桂花闪式提取液在提取温度75℃条件下热回流提取2.0h，过滤得桂花提取物。
[0126]
实施例1-4闪式提取联合热回流提取工艺具体提取溶剂如表3所示。
[0127]
表3提取溶剂参数优化
[0128][0129]
实施例5-7
[0130]
1)原料预处理：将桂花粉碎；
[0131]
2)闪式提取：将步骤1)预处理桂花按1:20(m/v)料液比加入80％乙醇溶液中，在提取电压75v条件闪式提取60s，得桂花闪式提取液；
[0132]
3)热回流提取：将步骤2)桂花闪式提取液在提取温度80℃条件下热回流提取1.0-2.0h，过滤得桂花提取物。
[0133]
实施例5-7闪式提取联合热回流提取工艺具体热回流提取时间如表4所示。
[0134]
表4热回流时间参数优化
[0135][0136]
实施例8-10
[0137]
1)原料预处理：将桂花粉碎；
[0138]
2)闪式提取：将步骤1)预处理桂花按1:20(m/v)料液比加入95％乙醇溶液中，在提取电压75v条件闪式提取60s，得桂花闪式提取液；
[0139]
3)热回流提取：将步骤2)桂花闪式提取液在提取温度55-75℃条件下热回流提取2.0h，过滤得桂花提取物。
[0140]
实施例8-10闪式提取联合热回流提取工艺具体热回流提取温度如表5所示。
[0141]
表5热回流提取温度参数优化
[0142][0143]
对比例1(闪式提取联合高压灭菌工艺)
[0144]
桂花粉碎后，按料液比1:20(m/v)加入纯水，在提取电压75v条件下闪式提取60s，使用高压灭菌锅121℃提取2.0h，过滤得桂花提取物。
[0145]
对比例2(超声辅助乙醇提取法)
[0146]
桂花粉碎后，按料液比1:20(m/v)加入80％乙醇为提取溶剂，在提取电压75v条件下闪式提取60s，使用超声设备75℃提取2.0h，过滤得桂花提取物。
[0147]
实验结果：
[0148]
取原料桂花粉碎，以乙醇溶液提取溶剂，通过实施例和对比例工艺制备桂花提取物，并计算桂花毛蕊花糖苷、红景天苷含量，测试结果如表6所示：
[0149]
表6桂花中毛蕊花糖苷、红景天苷含量
[0150]
序号毛蕊花糖苷含量(％)红景天苷含量(％)实施例16.20.65实施例27.90.69实施例38.90.74实施例48.30.79实施例57.40.73实施例69.30.81实施例79.20.82实施例87.40.63实施例97.70.67实施例108.30.79对比例15.10.11对比例27.30.56
[0151]
以毛蕊花糖苷含量和红景天苷含量为研究目标，采用闪式提取联合热回流提取工艺，考察不同乙醇浓度、料液比、闪式提取时间、闪式提取电压、热回流提取温度、热回流提取时间对桂花中目标黄酮含量的影响，优化出适宜的工艺参数为：乙醇体积分数60-95％，料液比1:10-1:30(m/v)，闪式提取时间30-60s，闪式提取电压75-100v，热回流提取温度55-80℃，热回流提取时间1.0-2.0h，在该条件下，桂花中毛蕊花糖苷、红景天苷含量分别为7.4％-9.3％、0.67％-0.82％。
[0152]
综上可知，闪式提取联合热回流提取法可显著提高桂花中活性成分毛蕊花糖苷、红景天苷的含量，且效果优于闪式联合高压提取和超声辅助乙醇提取法。
[0153]
实施例11-12
[0154]
1)原料预处理：将桂花粉碎；
[0155]
2)闪式提取：将步骤1)预处理桂花按1:20(m/v)料液比加入80％乙醇溶液中，在提
取电压为75v条件下闪式提取30s，得桂花闪式提取液；
[0156]
3)热回流提取：将步骤2)桂花闪式提取液在提取温度75℃条件下热回流提取1.0-2.0h，过滤得桂花提取液。
[0157]
4)大孔吸附树脂纯化：将步骤3)中桂花提取液，加入预处理好的d101或ab-8大孔树脂柱，用水和95％乙醇溶液梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，干燥得桂花提取物。
[0158]
实施例11-12闪式提取联合热回流提取工艺和大孔吸附树脂纯化工艺具体大孔树脂柱型号如表7所示。
[0159]
表7大孔树脂柱型号优化
[0160]
序号树脂型号洗脱液实施例11ab-895％乙醇实施例12d10195％乙醇
[0161]
实验结果：
[0162]
取原料桂花粉碎，以乙醇溶液提取溶剂，通过实施例11-12工艺制备桂花提取物，并测试桂花毛蕊花糖苷、红景天苷含量，测试结果如表8所示：
[0163]
表8桂花提取物中活性成分含量
[0164]
序号毛蕊花糖苷含量(％)红景天苷含量(％)实施例1148.05.75实施例1252.15.10
[0165]
以毛蕊花糖苷含量和红景天苷含量为研究目标，采用闪式提取联合热回流提取工艺，考察不同乙醇浓度、料液比、闪式提取电压、闪式提取时间、热回流提取温度、热回流提取时间对桂花中目标活性成分含量的影响，优化出适宜的工艺参数为：乙醇体积分数60-95％，料液比1:10-1:30(m/v)，闪式提取时间30-60s，闪式提取电压75-100v，热回流提取温度55-80℃，热回流提取时间1.0-2.0h，大孔树脂型号为d101型或ab-8型，洗脱液为水/95％乙醇，此时桂花中毛蕊花糖苷含量、红景天苷含量分别为7.4％-9.3％、0.67％-0.82％，树脂纯化后桂花提取物中毛蕊花糖苷含量为48.0-52.1％、红景天苷含量为5.10-5.75％。
[0166]
综上可知，闪式提取联合热回流提取和大孔吸附树脂纯化工艺可显著提高桂花提取物中毛蕊花糖苷含量和红景天苷含量。
[0167]
试验例1：抑制非酶糖基化
[0168]
真皮层中胶原蛋白、弹性蛋白等结构蛋白被糖化后会发生交联硬化，失去弹性，同时，随着年龄增长体内的糖基化产生的代谢产物ages，导致皮肤松弛、发黄，甚至产生褐斑、老年斑等衰老症状。通过评估桂花提取物对非酶糖基化的抑制作用，评测其保护真皮层结构及抑制色素沉积能力。
[0169]
将0.5mol/l牛血清白蛋白溶液(bca)与20mg/ml果糖溶液等体积混合得到bca-果糖反应液。按表9顺序依次加入各种试剂，加完后涡旋混匀。37℃避光孵育5天，之后测试荧光强度，激发波长370nm，发射波长为440nm。根据荧光强度(rfu，relative fluorescence unit)，计算待测样品对于非酶糖基化反应的抑制程度，见公式(1)。
[0170]
[0171]
表9非酶糖基化试验实验分组及添加量
[0172]
组别待测样品(μl)pbs缓冲液(μl)bca-果糖反应液(μl)待测组2000200阴性对照0200200空白组2002000
[0173]
表10桂花提取物抑制非酶糖基化试验结果
[0174][0175]
桂花提取物抑制非酶糖基化功效如表10和图1所示，桂花提取物具有抑制非酶糖基化功效。当桂花提取物浓度大于0.002％时，桂花提取物对非酶糖基化抑制作用显著，优于对照组(1.0％vc乙基醚)，说明本发明桂花提取物可有效抑制非酶糖基化，保护真皮层结构蛋白，抑制色素沉积。
[0176]
试验例2：抗光损伤作用
[0177]
1、试验概述/原理
[0178]
皮肤衰老分为内源性老化和外源性老化。前者又称自然老化，是自然的程序性衰老过程。后者是由于外界环境因素如紫外、吸烟、吹风、接触化学物质导致的皮肤老化。其中紫外线辐射是外源性老化最主要的因素。当皮肤受到紫外线辐射后，细胞内会产生过量的活性氧，引起衰老相关基因表达，诱发炎症级联反应并降低弹性蛋白和胶原蛋白的表达量，导致皮肤出现松弛、皱纹等老化现象。
[0179]
在皮肤老化的过程中，细胞内mapk信号通路被激活。该通路抑制转化生长因子β(tgf-β)的表达同时上调基质金属蛋白酶(mmp)的水平，最终导致细胞中i型胶原蛋白(col-i)分泌量降低，引起皮肤老化。所以col-i的分泌量是反应皮肤衰老的最直观指标。
[0180]
本方法基于人皮肤成纤维细胞(hff-1)模型，通过测定光损伤后，产品对于i型胶原蛋白的影响，进而评估产品抗光老化功效。
[0181]
2、试验材料/设备
[0182]
2.1试验材料
[0183]
人皮肤成纤维细胞(hff-1)购自中国科学院干细胞库。
[0184]
胎牛血清(fbs，gibco)、dmem高糖培养基(dmem，gibco)、二甲基亚砜(dmso，sigma)、磷酸盐缓冲液(pbs，gibco)、维生素e(ve)、噻唑蓝(mtt，sigma)、人col-i elisa试剂盒(上海威奥)。
[0185]
2.2试验设备
[0186]
超净台(亚泰科隆)、倒置显微镜(leica)、二氧化碳培养箱(thermo)、电动助吸器(eppendorf)、酶标仪(tecan)、紫外辐照箱(中科博达)。
[0187]
3、试验方法
[0188]
3.1基于hff-1细胞的毒性检测
[0189]
本试验采用mtt法检测细胞活性，筛选细胞给样的最大安全浓度。试验设置阴性对照(培养基)、阳性对照(含10％dmso培养基)和调零孔(pbs)，样品浓度设置见表11，每个浓度设置3个重复孔。具体操作步骤如下：
[0190]
(1)接种：取对数生长期细胞消化后接种至96孔板，将培养板放置在37℃、5％的co2培养箱中孵育培养18-24h。
[0191]
(2)配液：按表11中浓度设置，配制不同浓度的受试物。
[0192]
表11样品细胞毒性浓度设定
[0193][0194]
(3)给样：细胞生长18-24h后弃掉上清，加入含不同浓度受试物的培养基，将培养板放置在37℃、5％的co2培养箱中孵育培养18-24h。
[0195]
(4)检测：细胞培养18-24h后，弃掉上清，加入配制并过滤好的mtt(0.5mg/ml)，轻轻混匀，37℃避光孵育4h。孵育结束后弃掉上清，每孔加150μl的dmso，震荡20min，用酶标仪读取od
540nm
值。
[0196]
(5)相对细胞活率计算公式：
[0197][0198]
3.2基于uva辐照hff-1细胞col-i表达检测
[0199]
(1)接种：将细胞接种至6孔板中，37℃，5％co2培养箱孵育18-24h。
[0200]
(2)配液：根据表12配制受试物和阳性对照。
[0201]
(3)给样：根据表12试验分组和浓度设置，待6孔板中细胞铺板生长18-24h后，进行分组给样，每组设3个复孔。组1中，空白对照与阴性对照组均加入含0.1％dmso的细胞培养基，阳性对照加入含有10μg/ml维生素e的细胞培养基；组2中，空白对照与阴性对照组均加入细胞培养基，样品组加入含有相应浓度样品的细胞培养基，于37℃，5％co2培养箱继续培养24h。
[0202]
表12试验分组和浓度设置
[0203][0204]
(4)照射：加样培养18-24h后，去除培养基，用预温的1ml pbs轻洗两次，去除清洗溶液，加入1ml pbs，根据组别设置，需照射的组别在30j/cm
2 uva剂量下进行照射。达到照射剂量后，去除孔中的pbs，以1ml预温的pbs轻洗一次，加入dmem培养基继续培养18-24h。
[0205]
(5)i型胶原蛋白含量检测：取上清液，用elisa试剂盒进行检测。
[0206]
(6)数据处理：试验中取得的各项数据经过excel软件进行处理与作图。用spss 17.0进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析(anova)，当p《0.05时判断为差异显著。
[0207]
4、试验结果
[0208]
4.1基于hff-1细胞的毒性检测结果
[0209]
细胞毒性检测结果见表13，相对细胞活率变化趋势如图2所示，细胞的形态学观察结果见图3。
[0210]
表13桂花提取物细胞毒性检测结果
[0211][0212]
细胞功效测试浓度选择标准：
[0213]
(1)相对细胞活率
±
sd＞85％(相对细胞活率均值介于85-90％(不包含90％)时，需与阴性对照组相比无显著性差异(p＞0.05)；
[0214]
(2)细胞形态，相比阴性对照组无明显变化；
[0215]
根据细胞毒性试验结果、结合细胞形态，选取实施例12桂花提取物在hff-1细胞上的给药浓度为0.004％、0.008％、0.016％。
[0216]
4.2基于uva辐照hff-1细胞col-i表达检测结果
[0217]
按照试验方法3.2步骤进行检测，检测结果如表14、图4所示。
[0218]
表14col-i表达检测结果
[0219][0220]
注：
▲▲
表示与sc(uva-，0.1％dmso)组相比，差异极显著，p《0.01；
[0221]
△△
表示与bc(uva-)组相比，差异极显著，p《0.01；
[0222]
#表示与sc(uva+，0.1％dmso)组相比，差异极显著，p《0.05；
[0223]
*表示与nc(uva+)组相比，差异显著，p《0.05。
[0224]
与uva无辐照(uva-)组相比，uva辐照(uva+)引起col-i表达量显著下降；而与sc(uva+，0.1％dmso)相比，pc(ve)组可显著提高col-i表达，表明本次试验体系成立。
[0225]
根据细胞毒性试验结果，选取实施例12桂花提取物在hff-1细胞上的给药浓度为0.004％、0.008％、0.016％。试验结果表明，与nc(uva+)组相比，实施例12桂花提取物在浓度为0.004％、0.008％、0.016％时，可显著提高col-i的表达，说明本发明桂花提取物可有效抵抗uva引起的ⅰ型胶原蛋白损失，保护皮肤真皮层结构，抵御肌肤光老化。
[0226]
试验例3：亮白肌肤作用
[0227]
基于小鼠皮肤黑色素瘤细胞(b16-f10)模型，通过桂花提取物对黑素含量的影响，评价其提亮肌肤的作用。
[0228]
1、试验概述/原理
[0229]
黑色素产生于皮肤基底层的黑色素细胞中，其生物合成过程需多种酶介导，酪氨酸酶是其中重要的一种酶，它能够将酪氨酸氧化为多巴，进一步氧化成多巴醌，在其他酶的作用下氧化聚合为黑色素。
[0230]
通过检测小鼠皮肤黑色素瘤细胞生成的黑色素多少，反映待测物对黑色素的抑制情况，进而评价其潜在的美白功效。
[0231]
2、试验材料/设备
[0232]
2.1试验材料
[0233]
小鼠皮肤黑色素瘤细胞(b16-f10)购自中国医学科学院基础学研究所细胞资源中心。
[0234]
胎牛血清(fbs，gibco)、dmem高糖培养基(dmem，gibco)、二甲基亚砜(dmso，sigma)、磷酸盐缓冲液(pbs，gibco)、α-熊果苷(源叶)、naoh(国药)、噻唑蓝(mtt，sigma)。
[0235]
2.2试验设备
[0236]
超净台(亚泰科隆)、倒置显微镜(leica)、二氧化碳培养箱(thermo)、电动助吸器(eppendorf)、细胞废液抽取泵(其林贝尔)、酶标仪(tecan)。
[0237]
3、试验方法
[0238]
3.1基于b16-f10细胞的毒性检测
[0239]
本试验采用mtt法检测细胞活性，筛选细胞给样的最大安全浓度。试验设置阴性对照(培养基)、阳性对照(含5％dmso培养基)和调零孔(pbs)，样品浓度设置见表15，每个浓度
设置3个重复孔。具体操作步骤如下：
[0240]
(1)接种：取对数生长期细胞消化后接种至96孔板，将培养板放置在37℃、5％的co2培养箱中孵育培养18-24h。
[0241]
(2)配液：按表15中浓度设置，配制不同浓度的受试物。
[0242]
表15样品细胞毒性浓度设定
[0243][0244]
(3)给样：细胞生长18-24h后弃掉上清，加入含不同浓度受试物的培养基，将培养板放置在37℃、5％的co2培养箱中孵育培养18-24h。
[0245]
(4)检测：细胞培养18-24h后，弃掉上清，加入配制并过滤好的mtt(0.5mg/ml)，轻轻混匀，37℃避光孵育4h。孵育结束后弃掉上清，每孔加150μl的dmso，震荡20min，用酶标仪读取od
540nm
值。
[0246]
(5)相对细胞活率计算公式：
[0247][0248]
3.2黑色素含量检测
[0249]
(1)接种：将细胞接种至6孔板中，37℃，5％co2培养箱孵育18-24h。
[0250]
(2)配液：根据表16配制受试物和阳性对照。
[0251]
(3)给样：根据表16试验分组和浓度设置，待6孔板中细胞铺板生长18-24h后，进行分组给样，每组设3个复孔，于37℃，5％co2培养箱继续培养3天。
[0252]
表16试验分组和浓度设置
[0253][0254]
(4)检测：细胞给药培养3天后分别测试细胞培养基和细胞中黑色素含量。
[0255]
(5)数据处理：试验中取得的各项数据经过excel软件进行处理与作图。用spss 17.0进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析(anova)，当p《0.05时判断为差异显著。
[0256]
4、试验结果
[0257]
4.1基于b16-f10细胞的毒性检测结果
[0258]
细胞毒性检测结果见表17，相对细胞活率变化趋势如图5所示，细胞的形态学观察结果见图6。
[0259]
表17实施例12桂花提取物细胞毒性检测结果
[0260][0261]
细胞功效测试浓度选择标准：
[0262]
(1)相对细胞活率
±
sd＞85％(相对细胞活率均值介于85-90％(不包含90％)时，需与阴性对照组相比无显著性差异(p＞0.05))；
[0263]
(2)细胞形态，相比阴性对照组无明显变化；
[0264]
根据细胞毒性试验结果、结合细胞形态，选取实施例12桂花提取物在b16-f10细胞上的给药浓度为0.008％、0.016％、0.031％。
[0265]
4.2黑色素含量检测结果
[0266]
按照试验方法4.2步骤进行检测，结果如表18、图7所示。
[0267]
表18黑色素含量检测结果
[0268][0269]
注：**表示与nc组相比，差异极显著，p《0.01。
[0270]
桂花提取物抑制黑色素分泌功效如表18和图7所示，在0.008％-0.031％下，实施例12的桂花提取物可显著抑制黑素的分泌量，其效果优于阳性对照(0.0125％熊果苷)，说明桂花提取物可显著抑制黑素的分泌量，有效提亮肌肤，改善肌肤暗沉。