1.本发明属于养生酒技术领域，具体涉及一种验证养生酒对睡眠及皮肤水合率影响的方法。
背景技术：
2.随着社会的发展和人们生活水平的提高，人们不再仅仅满足对事物的要求。现今社会中女士逐渐加强了对自己形象的管理，各种美容场所大量出现。然而女士每次进行美容都会耗费大量时间，且保持时间有限。因此市场上出现许多的针对女性的养生酒，可以改善女士睡眠和皮肤水合率，从而提供皮肤质量。但是该类养生酒缺乏对应的验证方法，无法证明其对睡眠及皮肤水合率的影响。
技术实现要素：
3.本发明的目的在于提供一种验证养生酒对睡眠及皮肤水合率影响的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种验证养生酒对睡眠及皮肤水合率影响的方法，具体包括如下步骤：
5.(1)、准备spf级km实验小鼠30只，18～22g，雌雄各半；
6.(2)、分组和给药：将所有小鼠随机分为3组，即空白对照组、养生酒高剂量组和养生酒低剂量组，每组10只，将实验小鼠先适应性喂养一周；给养生酒高剂量组喂食49.4ml/kg的养生酒，养生酒低剂量组喂食24.7ml/kg的养生酒，且均以0.2ml/10g/只灌胃给药，空白组灌胃给予等量生理盐水，每天一次，连续给药20天；给药期间各组自由饮水，定量进食；
7.(3)、体重检测：将实验期间，将小鼠饲养于独立通风小鼠笼中，每笼5只，保证一定的实验环境，每天定量给食、蒸馏水供自由获取，适应性喂养1周；期间及时补充饲料及饮用水，及时更换垫料、消毒清洁鼠笼，保持生存环境适宜；定期观察实验动物一般情况，每隔5天称量并记录小鼠体重；
8.(4)、小鼠脑组织样品制备：小鼠脱颈处死后，迅速置于冰台上，先将小鼠背部表皮剥掉，然后用钩镊在眼眶处固定大鼠颅骨，用组织剪将颅骨和颈椎连接处剪断；用剪刀头部伸入枕骨大孔，朝向同侧眼眶方向，贴着骨头剪到眼眶处，用左手持钩镊插入大鼠的眼眶固定颅骨，用弯钳直接夹住枕骨大孔处的骨头，将头骨掀起，使脑组织暴露，用小剪刀剪断脑神经，小心取脑，称重，以1：10比例加入于4℃预冷的生理盐水，用组织匀浆机研磨均匀，制成10％脑组织匀浆；使用高速冷冻离心机于4℃条件下3000r/min离心15min，吸取上清液；采用elisa试剂盒检测上清液中神经递质ne、5-ht水平；
9.(5)、相关因子测定：以空白孔调零，用酶标仪在450nm波长下依次测量各孔的吸光度(od值)；分别以ne、5-ht标准品的浓度为横坐标，od值为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程；再根据样品的od值通过相应回归方程计算出ne、5-ht浓度；
10.(6)、烘箱法检测皮肤含水率：剪取小鼠1cm
×
1cm背部皮肤，用剪刀将背部鼠毛仔
细剪除，刮去浅黄色的皮下脂肪组织，以电子天平称取湿重，再放入烘箱中于80℃烘干12小时，称干重，计算皮肤含水百分率＝(湿重-干重)/湿重
×
100％；
11.(7)、皮肤组织样品制备：将小鼠背部皮肤经4℃预冷生理盐水反复漂洗，除去皮下脂肪和其它结缔组织，滤纸拭干，称重，各50mg左右，然后反复冻融3次，使其完全破碎，加入生理盐水制成10％的皮肤匀浆，离心后取其上清液，采用elisa法测定皮肤中ha含量；
12.(8)、相关因子测定：以空白孔调零，用酶标仪在450nm波长下依次测量各孔的吸光度(od值)；分别以ne、5-ht标准品的浓度为横坐标，od值为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程；再根据样品的od值通过相应回归方程计算出ha浓度；
13.(9)、根据体重检测结果、小鼠脑组织内ne、5-ht水平、皮肤含水率、皮肤透明质酸(ha)含量测定结果判断养生酒对睡眠及皮肤水合率的影响。
14.优选的，所述(3)中的实验环境为：温度为25℃，相对湿度58％－65％，照明维持12h明/12h暗周期。
15.优选的，所述(4)中的elisa试剂盒检测上清液中神经递质ne、5-ht水平的步骤包括：
16.步骤一、在室温环境下将各种试剂平衡30分钟以上，然后配制试剂；
17.步骤二、设置标准品孔和样品孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50ul；
18.步骤三、样品孔先加待测样本10ul，再加样本稀释液40ul；空白孔不加；
19.步骤四、除空白孔外，标准品孔和样本孔加入辣根过氧化氢酶(hrp)标记的检测抗体100ul，用封口膜封住反应孔，37℃敷育60min；
20.步骤五、倒掉液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；
21.步骤六、每孔加入底物a、b各50ul，37℃避光显色15-30分钟；
22.步骤七、依序每孔加入终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
23.步骤八、选取含有波长450nm的酶标仪测量所有孔的光密度，即为od值。
24.优选的，所述(7)中的elisa法测定皮肤中ha含量的步骤包括：
25.步骤一、在室温环境下将各种试剂平衡30分钟以上，然后配制试剂；
26.步骤二、设置标准品孔和样品孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50ul；
27.步骤三、样品孔先加待测样本10ul，再加样本稀释液40ul；空白孔不加；
28.步骤四、除空白孔外，标准品孔和样本孔加入辣根过氧化氢酶(hrp)标记的检测抗体100ul，用封口膜封住反应孔，37℃敷育60min；
29.步骤五、倒掉液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；
30.步骤六、每孔加入底物a、b各50ul，37℃避光显色15-30分钟；
31.步骤七、依序每孔加入终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
32.步骤八、选取含有波长450nm的酶标仪测量所有孔的光密度，即为od值。
33.本发明的技术效果和优点：本方法可以科学、有效、全面的校验养生酒睡眠及皮肤水合率的影响效果。
具体实施方式
34.实施例
35.一种验证养生酒对睡眠及皮肤水合率影响的方法，具体包括如下步骤：
36.(1)、准备spf级km实验小鼠30只，18～22g，雌雄各半；
37.(2)、分组和给药：将所有小鼠随机分为3组，即空白对照组、养生酒高剂量组和养生酒低剂量组，每组10只，将实验小鼠先适应性喂养一周；给养生酒高剂量组喂食49.4ml/kg的养生酒，养生酒低剂量组喂食24.7ml/kg的养生酒，且均以0.2ml/10g/只灌胃给药，空白组灌胃给予等量生理盐水，每天一次，连续给药20天；给药期间各组自由饮水，定量进食；
38.(3)、体重检测：将实验期间，将小鼠饲养于独立通风小鼠笼中，每笼5只，保持温度为25℃，相对湿度58％－65％，照明维持12h明/12h暗周期，每天定量给食、蒸馏水供自由获取，适应性喂养1周；期间及时补充饲料及饮用水，及时更换垫料、消毒清洁鼠笼，保持生存环境适宜；定期观察实验动物一般情况，每隔5天称量并记录小鼠体重；
39.(4)、小鼠脑组织样品制备：小鼠脱颈处死后，迅速置于冰台上，先将小鼠背部表皮剥掉，然后用钩镊在眼眶处固定大鼠颅骨，用组织剪将颅骨和颈椎连接处剪断；用剪刀头部伸入枕骨大孔，朝向同侧眼眶方向，贴着骨头剪到眼眶处，用左手持钩镊插入大鼠的眼眶固定颅骨，用弯钳直接夹住枕骨大孔处的骨头，将头骨掀起，使脑组织暴露，用小剪刀剪断脑神经，小心取脑，称重，以1：10比例加入于4℃预冷的生理盐水，用组织匀浆机研磨均匀，制成10％脑组织匀浆；使用高速冷冻离心机于4℃条件下3000r/min离心15min，吸取上清液；采用elisa试剂盒检测上清液中神经递质ne、5-ht水平，具体检测步骤为：
40.步骤一、在室温环境下将各种试剂平衡30分钟以上，然后配制试剂；
41.步骤二、设置标准品孔和样品孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50ul；
42.步骤三、样品孔先加待测样本10ul，再加样本稀释液40ul；空白孔不加；
43.步骤四、除空白孔外，标准品孔和样本孔加入辣根过氧化氢酶(hrp)标记的检测抗体100ul，用封口膜封住反应孔，37℃敷育60min；
44.步骤五、倒掉液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；
45.步骤六、每孔加入底物a、b各50ul，37℃避光显色15-30分钟；
46.步骤七、依序每孔加入终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
47.步骤八、选取含有波长450nm的酶标仪测量所有孔的光密度，即为od值。
48.优选的，所述(7)中的elisa法测定皮肤中ha含量的步骤包括：
49.步骤一、在室温环境下将各种试剂平衡30分钟以上，然后配制试剂；
50.步骤二、设置标准品孔和样品孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50ul；
51.步骤三、样品孔先加待测样本10ul，再加样本稀释液40ul；空白孔不加；
52.步骤四、除空白孔外，标准品孔和样本孔加入辣根过氧化氢酶(hrp)标记的检测抗体100ul，用封口膜封住反应孔，37℃敷育60min；
53.步骤五、倒掉液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；
54.步骤六、每孔加入底物a、b各50ul，37℃避光显色15-30分钟；
55.步骤七、依序每孔加入终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
56.步骤八、选取含有波长450nm的酶标仪测量所有孔的光密度，即为od值；
57.(5)、相关因子测定：以空白孔调零，用酶标仪在450nm波长下依次测量各孔的吸光度(od值)；分别以ne、5-ht标准品的浓度为横坐标，od值为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程；再根据样品的od值通过相应回归方程计算出ne、5-ht浓度；
58.(6)、烘箱法检测皮肤含水率：剪取小鼠1cm
×
1cm背部皮肤，用剪刀将背部鼠毛仔细剪除，刮去浅黄色的皮下脂肪组织，以电子天平称取湿重，再放入烘箱中于80℃烘干12小时，称干重，计算皮肤含水百分率＝(湿重-干重)/湿重
×
100％；
59.(7)、皮肤组织样品制备：将小鼠背部皮肤经4℃预冷生理盐水反复漂洗，除去皮下脂肪和其它结缔组织，滤纸拭干，称重，各50mg左右，然后反复冻融3次，使其完全破碎，加入生理盐水制成10％的皮肤匀浆，离心后取其上清液，采用elisa法测定皮肤中ha含量，具体测定步骤为：
60.步骤一、在室温环境下将各种试剂平衡30分钟以上，然后配制试剂；
61.步骤二、设置标准品孔和样品孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50ul；
62.步骤三、样品孔先加待测样本10ul，再加样本稀释液40ul；空白孔不加；
63.步骤四、除空白孔外，标准品孔和样本孔加入辣根过氧化氢酶(hrp)标记的检测抗体100ul，用封口膜封住反应孔，37℃敷育60min；
64.步骤五、倒掉液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；
65.步骤六、每孔加入底物a、b各50ul，37℃避光显色15-30分钟；
66.步骤七、依序每孔加入终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
67.步骤八、选取含有波长450nm的酶标仪测量所有孔的光密度，即为od值；
68.(8)、相关因子测定：以空白孔调零，用酶标仪在450nm波长下依次测量各孔的吸光度(od值)；分别以ne、5-ht标准品的浓度为横坐标，od值为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程；再根据样品的od值通过相应回归方程计算出ha浓度；
69.(9)、根据体重检测结果、小鼠脑组织内ne、5-ht水平、皮肤含水率、皮肤透明质酸(ha)含量测定结果判断养生酒对睡眠及皮肤水合率的影响。
70.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。