miR-221及其抑制剂用于制备调控肝脂肪沉积、肝纤维化或肝细胞癌的药物的制作方法

mir-221及其抑制剂用于制备调控肝脂肪沉积、肝纤维化或肝细胞癌的药物
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及mir-221及其抑制剂用于制备调控肝脂肪沉积、 肝纤维化或肝细胞癌的药物。需要说明的是，本发明是在申请号为201810952098.9的专利申 请基础上提出的分案。


背景技术：

2.微小rna(microrna，mirna)是非编码小rnas(长度通常为21
–
23个核苷酸)， 其通过结合特异性基因的3
′
非翻译区使靶基因翻译抑制和/或信使稳定性下降。目前发现的微 小rna数量超过2500个，新的微小rna候选基因仍在被发现，他们的表达方式往往是发 育和/或组织特异性的，虽然一些微小rna是整个机体内稳定表达的。mirna是重要的基因 调节因子，参与调控机体的各种基本过程，如细胞增殖与凋亡、分化，发育、器官发生、分 化、成型、代谢、应激反应、干细胞分化、神经发生、血管发生等。mirna基因不是随机排 列的，其中一些是成簇的(cluster)，而且簇生排列的基因常常协同表达。mir-221/222是在 脊椎动物高度保守的聚集在x染色体上的一对mirna，因为它们都具有一致的种子区，因此， 这两种微小rna调控类似的靶基因组。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的是提供mir-221及其抑制剂用于制备调控肝脂肪沉积、肝纤维化和肝 细胞癌的药物。
4.优选地，所述mir-221及其抑制剂作为检测靶点。
5.mir-221具有如seq id no:l中所示的核苷碱基序列。
6.mir-221的前体具有如seq id no:3所示的核苷碱基序列。
7.本发明提供的一种化合物，包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由15至25 个连接核苷组成并靶向mir-221，且所述核苷的碱基序列与seq id no:1、seq id no:2、seqid no:3或seq id no:4的核苷碱基序列互补。
8.优选地，所述化合物中经修饰的寡核苷酸由15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或25个连接核苷中任一种组成并靶向mir-221，且所述核苷的碱基序列与seq id no:1、seqid no:2、seq id no:3或seq id no:4的核苷碱基序列互补。
9.优选地，所述寡核苷酸包括具有如seq id no:5、seq id no:6或seq id no:7所示的 核苷碱基序列。
10.优选地，所述经修饰的寡核苷酸还包含至少一种经修饰的糖；更优选地，每个所述经修 饰的糖独立地选自2
’‑
o-甲氧基乙基糖、2
’‑
氟代糖、2
’‑
o-甲基糖和双环糖部分。
11.优选地，所述经修饰的寡核苷酸还包含至少一个经修饰的核苷间键合；更优选地，每个 所述经修饰的核苷间键合为硫代磷酸酯核苷间键或硫代磷酸酯核苷间键。
12.本发明中所述化合物在制备用于如下用途的药物中的用途：(i)降低受试者的肝
脏脂肪浸 润水平；或(ii)预防或延缓受试者的肝脏胶原蛋白纤维沉积出现；或(iii)预防或延缓受试者的 肝细胞癌的发生。
13.优选地，所述受试者患有代谢综合征、肥胖症、糖尿病血脂异常、高脂血症、高甘油三 脂血症、高脂肪酸血症和高胰岛素血症的至少一种代谢紊乱；和/或肝细胞癌；更优选地，所 述受试者的代谢紊乱包括升高的血脂水平、升高的血清转氨酶水平、肝脏b超轻度-重度脂肪 肝、肝脏纤维化改变、升高的糖异生、胰岛素抵抗、减低的葡萄糖耐量和过量的体脂肪中至 少一种。
14.优选地，所述药物用于(i)改善受试者的肝脏脂肪浸润；或(ii)预防或延缓受试者的肝脏胶 原蛋白纤维沉积出现；或(iii)预防或延缓受试者的肝细胞癌的发生。
15.优选地，所述药物通过抑制mir-221的活性降低肝脏脂肪浸润、降低纤维化程度、预防 或降低肝细胞恶性增殖、降低血浆胆固醇水平、降低血清转氨酶和改善胰岛素抵抗实现；和/ 或通过抑制mir-221的活性降低受试者的糖异生实现。
16.优选地，所述药物以上述化合物为活性成分，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。
17.优选地，所述药物的施用方式包括静脉内施用、皮下施用、口服施用或肠胃外施用。
18.优选地，所述药物中所述经修饰的寡核苷酸的应用剂量为25-800mg/kg。
19.本发明的药物组合物，包括所述包含经修饰的寡核苷酸的化合物，还包括药学上可接受 的辅料或辅助性成分；优选地，所述经修饰的寡核苷酸为无菌冻干的寡核苷酸，其应用剂量 为25-800mg/kg。
20.本发明的mir-221检测靶点试剂盒，包括所述的检测mir-221表达水平的引物，还包括 所述包含经修饰的寡核苷酸的化合物。
21.补充说明
22.寡核苷酸的核苷碱基序列与seq id no:1、2、3或4的核苷碱基序列完全互补；或者寡 核苷酸的核苷碱基序列与seq id no:1、2、3或4的核苷碱基序列至少95％互补；或者寡核 苷酸的核苷碱基序列与seq id no:1、2、3或4的核苷碱基序列至少90％互补；寡核苷酸的 核苷碱基序列与seq id no:1、2、3或4的核苷碱基序列至少85％互补；或者寡核苷酸的核 苷碱基序列与选自seq id no:1、2、3或4的核苷碱基序列没有错配；或者寡核苷酸的核苷 碱基序列与选自seq id no:1、2、3或4的核苷碱基序列具有一个错配；或者寡核苷酸的核 苷碱基序列与选自seq id no:1、2、3或4的核苷碱基序列具有不超过一个错配；或者寡核 苷酸的核苷碱基序列与选自seq id no:1、2、3或4的核苷碱基序列具有不超过两个错配。
23.寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷间键合；或者寡核苷酸包含至少两个经修饰的核苷 间键合；或者寡核苷酸包含至少三个经修饰的核苷间键合；或者寡核苷酸的每个核苷间键合 都是经修饰的核苷间键合；或者寡核苷酸的第一个核苷间键合和最后一个核苷间键合是经修 饰的核苷间键合；或者至少一个经修饰的核苷间键合是硫代磷酸酯核苷间键合；或者寡核苷 酸的每个核苷都包含经修饰的糖；或者寡核苷酸包含至少三个包含经修饰的糖的核苷；或者 寡核苷酸包含至少两个包含经修饰的糖的核苷；或者寡核苷酸包含至少一个包含经修饰的糖 的核苷；或者寡核苷酸的每个核苷都包含2
’‑
o-甲氧基乙基糖；或
者寡核苷酸包含多个含有2
’‑
o-甲氧基乙基糖的核苷和多个含有2
’‑
氟代糖修饰的核苷；或者每个经修饰的糖独立地选自 2
’‑
o-甲氧基乙基糖、2
’‑
氟代糖、2
’‑
o-甲基糖和双环糖部分；或者双环糖部分是lna；或者 该化合物包含与寡核苷酸连接的缀合物；或者该缀合物是胆固醇。
24.经修饰的寡核苷酸具有以下修饰：每个核苷都是2
’‑
o-甲基核苷，前两个5’核苷间键合均 为硫代磷酸酯，四个3’末端核苷间键合中的每一个都是硫代磷酸酯，其余的核苷间键合均为 磷酸二酯且3’末端核苷经由碱基脯氨醇键合与胆固醇连接。
25.寡核苷酸的核苷碱基序列包含seq id no:5、6或7的核苷碱基序列；或者寡核苷酸的 核苷碱基序列由seq id no:5、6或7的核苷碱基序列组成。
26.通过抑制mir-221的活性降低肝脏胆固醇水平、降低血清转氨酶和改善胰岛素抵抗实现； 或者通过抑制mir-221的活性降低受试者的肝脏胶原纤维沉积实现；或者通过抑制mir-221 的活性抑制肝脏细胞恶性增殖实现。
27.本发明提供用于治疗肝脏脂肪性肝炎、肝纤维化和肝细胞癌及相关的病状的方法，其包 括施用包含靶向mir-221的寡核苷酸的化合物。
28.本发明提供用于降低受试者的肝脏胆固醇沉积及血浆胆固醇水平的方法，其包括对受试 者施用包含由12至30个连接核苷所组成并具有与mir-221互补或与mir-221的前体互补的 核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物，和由此降低受试者的肝脏胆固醇沉积及血浆胆固醇水平； 或者对受试者施用包含由7至12个连接核苷所组成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的 寡核苷酸的化合物，和由此降低受试者的肝脏胆固醇沉积及血浆胆固醇；或者受试者具有升 高的血浆胆固醇水平；或者受试者具有轻度到重度的的肝脏脂肪沉积；所述方法包括选择具 有轻度到重度的的脂肪肝或升高的血浆胆固醇水平的受试者；或者血浆胆固醇是ldl-胆固醇 和/或vldl-胆固醇。
29.本发明提供用于降低受试者的血清转氨酶水平的方法，其包括对受试者施用包含由7至 12个连接核苷所组成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物，由此降低 受试者的血清转氨酶水平；或者受试者具有升高的血清转氨酶水平；或者方法包括测量受试 者的血清转氨酶水平；或者所述方法包括选择具有升高的血清转氨酶水平的受试者。
30.本发明提供用于降低受试者的肝脏纤维化的方法，其包括对受试者施用包含由12至30 个连接核苷所组成并具有与mir-221互补或与mir-221的前体互补的核苷碱基序列的寡核苷 酸的化合物，和由此降低受试者的肝脏纤维化；或者受试者具有升高的肝脏纤维化水平指数； 或者对受试者施用包含由7至12个连接核苷所组成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的 寡核苷酸的化合物由此降低受试者的肝脏纤维化水平。
31.本发明提供用于在处于血脂水平升高的风险中的受试者中预防或延缓肝脏脂肪浸润水平 升高的方法，其包括对受试者施用包含由12至30个连接核苷所组成并具有与mir-221互补 或与mir-221的前体互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物由此预防或延缓受试者的肝脏 脂肪浸润水平升高出现；或者对受试者施用包含由7至12个连接核苷所组成并具有与 mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物由此预防或延缓受试者的肝脏脂肪浸润水 平升高出现。
32.本发明提供用于改善受试者的胰岛素敏感度的方法，其包括对受试者施用包含由
12至30个连接核苷所组成并具有与mir-221互补或与mir-221的前体互补的核苷碱基序列的寡核 苷酸的化合物由此改善受试者的胰岛素敏感度；或者受试者具有胰岛素抵抗；或者所述方法 包括选择具有胰岛素抵抗的受试者；或者对受试者施用包含由7至12个连接核苷所组成并具 有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物由此改善受试者的胰岛素敏感度。
33.本发明提供用于在处于患上膜岛素抵抗的风险中的受试者中预防或延缓胰岛素抵抗出现 的方法，其包括对受试者施用包含由12至30个连接核苷所组成并具有与mir-221互补或与 mir-221的前体互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物由此预防或延缓受试者的胰岛素抵 抗出现；或者所述方法包括选择处于患上胰岛素抵抗的风险中的受试者；或者对受试者施用 包含由7至12个连接核苷所组成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物 由此预防或延缓受试者的胰岛素抵抗出现。
34.本发明提供用于预防或抑制受试者的肝细胞癌发生的方法，其包括对受试者施用包含由 12至30个连接核苷所组成并具有与mir-221互补或与mir-221的前体互补的核苷碱基序列 的寡核苷酸的化合物由此抑制肝癌发生；或者受试者的血脂水平升高；或者受试者为轻至重 度脂肪肝患者；或者受试者为轻至重度肝脏纤维化患者；或者所述方法包括选择肝癌的受试 者。由7至12个连接核苷所组成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物 由此抑制肝细胞癌发生。
35.在本发明提供的上述任何方法中，受试者可能患有脂代谢紊乱、脂肪肝、肝纤维化或肝 细胞癌。
36.本发明提供用于在处于患上脂代谢紊乱、脂肪肝、肝纤维化或肝细胞癌的风险中的受试 者中预防或延缓至少一种表征出现的方法，其包括对受试者施用包含由12至30个连接核苷 所组成并具有与mir-221互补或与mir-221的前体互补的核苷碱基序列的经修饰寡核苷酸的 化合物由此预防或延缓受试者的脂代谢紊乱、脂肪肝、肝纤维化或肝细胞癌出现；或者对受 试者施用包含由7至12个连接核苷所组成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的经修饰寡 核苷酸的化合物由此预防或延缓受试者的脂代谢紊乱，脂肪肝，肝纤维化或肝细胞癌出现。
37.本发明提供用于治疗受试者的脂代谢紊乱、脂肪肝、肝纤维化或肝细胞癌中至少一种表 征的方法，其包括对患者施用包含由12至30个连接核苷所组成并具有与mir-221互补或与 mir-221的前体互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物由此治疗脂代谢紊乱，脂肪肝，肝 纤维化或肝细胞癌；或者对患者施用包含由7至12个连接核苷所组成并具有与mir-221互补 的前体互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物由此治疗脂代谢紊乱，脂肪肝，肝纤维化或 肝细胞癌。
38.至少一种代谢紊乱为糖尿病前期、糖尿病、代谢综合征、肥胖、糖尿病性血脂异常、高 血脂症、高甘油三脂血症、高脂肪酸血症、高胆固醇血症。
39.施用包括肠胃外施用，或者肠胃外施用包括静脉内施用或皮下施用，或者施用包括口服 施用。施用包括施用至少一种另外的疗法，或者至少一种另外的疗法是降低血脂的试剂，或 者降低血脂的试剂选自影响脂质合成、代谢和廓清的药物(烟酸及其衍生物，氯贝丁酯类及 苯氧乙酸类，羟甲基戊二酸单酰辅酶a(hmg-coa)还原酶抑制药)、影响胆固醇及胆酸吸 收的药物(胆酸整合剂，普罗布考[probucol])、多烯脂肪酸类药物。至少一种另外
的疗法是 降低脂质的试剂，或者至少一种另外的疗法与所述化合物同时施用，或者至少一种另外的疗 法的施用频率比所述化合物高；或者至少一种另外的疗法的施用频率比所述化合物低；或者 至少一种另外的疗法是在施用化合物之后施用；或者至少一种另外的疗法是在施用化合物之 前施用；或者至少一种另外的疗法和所述化合物共同施用。
[0040]
该化合物是以药物组合物形式来施用，所述药物组合物以上述化合物为活性成分，还包 括药学上可接受的辅料或辅助性成分。
[0041]
本发明提供用于鉴定需要治疗的受试者的方法，其包括将从受试者获得的样本中的微小 rna的量与阴性对照的量相比较，其中微小rna是mir-221，且其中从受试者获得的样本 中的升高的mir-221水平表明受试者需要用包含与mir-221互补的经修饰的寡核苷酸的化合 物来治疗。样本是肝脏样本，或者样本是血清样本。受试者处于患上脂肪性肝炎，肝纤维化 或肝细胞癌的风险中，或者受试者疑似患有脂肪性肝炎，肝纤维化或肝细胞癌，或者受试者 是用包含具有与mir-221互补或与其前体互补的核苷碱基的经修饰寡核苷酸的化合物来治 疗。本发明的技术方案和实施方案结合附图、说明书和权利要求书而显而易见。
附图说明
[0042]
除非另外指明，否则野生型雄性c57bl/6小鼠(≌20g)是用pbs、抗 mir-221/222(l
×
12.5mg/kg)、抗mir-221/222(2
×
12.5mg/kg)、抗mir-221/222(2
×
15/kg)来注射， 而雄性ob/ob(45g)小鼠是用pbs、抗mir-221/222(1
×
15mg/kg)、抗mir-221/222(2
×
15mg/kg) 来注射。在全部附图中，抗mir治疗的标记如下表中所述。
[0043]
表1经修饰的寡核苷酸
[0044][0045]
图l为mir-221/222在脂肪性肝炎模型中被上调；对照饮食(control diet)、蛋氨酸-胆碱 缺乏饮食(mcd diet)小鼠(n＝3)的肝脏的总rna上的mir-221/222的rna表达水平；对 照饮食(ctrl)、高脂饮食(hfd)小鼠(n＝3)的肝脏的总rna上的mir-221/222的rna 表达水平；
[0046]
图2为mir-221/222肝脏特异性敲除小鼠的构建；利用mir-221/222的loxp转基因小鼠与白蛋白启动子驱动的alb-cre小鼠交配获得了肝细胞特异性敲除mir-221/222的小鼠模型(liver-specificmir-221/222knockout，mir-221/222lko)；对照小鼠及mir-221/222lko肝脏组织realtime-pcr结果显示mir-221和mir-222在肝脏中敲除成功(n＝3)；
[0047]
图3为mcd小鼠模型肝细胞内mir-221/222缺失可导致肝脏内胆固醇、甘油三酯等脂肪沉积减少，胰岛素敏感性增强；对照小鼠及mir-221/222lko肝脏组织的透射电镜图像和油红o染色显示肝细胞敲除mir-221/222可以减少肝脏脂肪沉积；
[0048]
图4为mir-221/222lko小鼠肝脏内炎症因子表达降低，炎症细胞聚集减少；mcd饮食模型中对照小鼠及mir-221/222lko肝脏组织realtime-pcr结果显示炎症因子il-1β，tnfα及il-6表达水平明显下降；肝脏切片h&e染色显示炎症细胞浸润明显减轻；
[0049]
图5为mir-221/222lko小鼠肝脏内胶原纤维沉积增加，胶原蛋白家族成员表达增加；肝脏天狼星红和麦松染色显示与对照组小鼠相比，mcd饮食mir-221/222lko小鼠肝脏中阳性染色面积减少；q-pcr检测显示mir-221/222lko小鼠肝脏中胶原蛋白家族成员表达降低；
[0050]
图6为腺病毒ad-mir-221/222感染mir-221/222lko小鼠肝脏使肝脏脂质沉积增加；在mir-221/222lko小鼠中用腺病毒表达mir-221/222，发现尾静脉腺病毒ad-mir-221/222注射可以使小鼠肝脏重新表达mir-221/222；表达mir-221/222的小鼠肝脏体重比，肝脏甘油三脂均比对照小鼠升高；
[0051]
图7为mir-221/222lko小鼠感染腺病毒ad-mir-221/222加重肝脏纤维化；mir-221/222lko小鼠尾静脉注射腺病毒ad-mir-221/222和对照ad-gfp，天狼星红和麦松染色显示mir-221/222lko小鼠重新表达mir-221/222后天狼星红和麦松染色阳性面积增加，表明胶原纤维沉积面积增加；
[0052]
图8为mir-221/222inhibitors具有很好的体外抑制效果；利用锁核酸lockednucleicacids(lna
tm
)修饰技术合成了mir-221/222inhibitors(lna-i-mir-221，lna-i-mir-222)；通过体外小鼠肝癌细胞系hepa1-6转染nc，lna-i-mir-221和lna-i-mir-22250nm及100nm两个浓度，q-pcr检测显示lna-i-mir-221，lna-i-mir-222具有特异且较好的抑制mir-221和mir-222的效果；与对照相比，lna-i-mir-221和lna-i-mir-222可以显著上调靶基因p27及timp3的蛋白水平；
[0053]
图9为lna-i-mir-221和lna-i-mir-222在体内具有较好的抑制mir-221和mir-222的作用；我们将lna-i-mir-221和lna-i-mir-222腹腔注射mcd饮食小鼠，发现lna-i-mir-221和lna-i-mir-222具有较好的体内抑制mir-221和mir-222的作用；对照小鼠腹腔注射nc，lna-i-mir-221和lna-i-mir-222(1，4，8，15，21天)，同时给予mcd饮食，25天时取小鼠肝脏鉴定mir-221和mir-222的表达水平，mir-221/222lko小鼠作为阳性对照；
[0054]
图10为lna-i-mir-221和lna-i-mir-222注射可以显著减轻mcd饮食引起的肝脏炎症因子的表达水平，减轻炎症浸润；lna-i-mir-221和lna-i-mir-222注射后小鼠肝脏il6，tnf，il1b和adgre1的mrna水平降低；
[0055]
图11为lna-i-mir-221和lna-i-mir-222注射可以显著减轻mcd饮食引起肝脏胶原蛋白家族成员表达升高；lna-i-mir-221和lna-i-mir-222注射后小鼠肝脏sma，col1a1，
col3a1 和col5a3的mrna水平降低；
[0056]
图12为mir-221和mir-222在人纤维化肝脏组织中升高；正常对照人肝脏组织，轻度肝 脏纤维化组织和重度肝脏纤维化组织中mir-221和mir-222表达水平逐渐升高。
具体实施方式
[0057]
在公开和描述本发明的组合物和方法之前，应了解本发明所使用的术语仅出于描述特定 实施方案的目的，并不旨在限制。必须指出，除非上下文明确地另外指明，否则在说明书和 附加权利要求书中使用的单数形式“一”和“该”包括多个指示物。
[0058]
定义
[0059]“代谢紊乱”是指以体内一种或多种代谢过程改变或失调为特征的症候群，是导致糖尿病 心脑血管疾病的危险因素。代谢紊乱包括(但不限于)肥胖、2型糖尿病、代谢综合征、糖 尿病前期、1型糖尿病、糖尿病血脂异常和高胰岛素血症。
[0060]“肥胖”是一种由多种因素引起的慢性代谢性疾病。以体内脂肪细胞的体积和细胞数增加 导致体脂占体重的百分比异常增高并在某些局部过多沉积为特点。体脂肪量(或肥胖)既包 括整个身体的脂肪分布，又包括脂肪组织堆积的大小。通过皮肤褶测量、腰围与臀围比率或 诸如超声、计算机断层扫描或磁共振成像的技术可以估算体脂肪的分布。临床用体重指数 (bmi)来评价，为28或更高的个体被认为是肥胖的。
[0061]“2型糖尿病”是指以胰岛素抵抗和相对胰岛素缺乏为特征的糖尿病。流行病学研究表明， 肥胖、高热量饮食、体力活动不足及增龄是2型糖尿病最主要的环境因素，高血压、血脂异 常等因素也会增加患病风险。
[0062]“糖尿病前期”，糖尿病的发展分为三个阶段，第一个阶段叫做“高危人群”，第二个阶 段叫“糖尿病前期”，第三个阶段叫做“糖尿病”。糖尿病前期是指受试者空腹血糖》6.1毫 摩尔/升，或者餐后两小时血糖》7.8毫摩尔/升，但是没有达到糖尿病的诊断标准。
[0063]“脂肪性肝炎”是指继发于大泡性肝细胞脂肪变的肝炎。根据病因可分为酒精性脂肪性肝 炎和非酒精性脂肪性肝炎。两者的肝组织学改变基本相似，均表现为在肝脂肪变性的基础上， 出现肝细胞气球样变、小叶内中性粒细胞为主的混合性炎症细胞浸润。部分脂肪性肝炎尚伴 有马洛里(mallory)小体和细胞周围纤维化及中央静脉周围纤维化。
[0064]“非酒精性脂肪肝病(nafld)”是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂 肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代 谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(sfl)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)及其相关肝硬 化。
[0065]“非酒精性脂肪性肝炎(nash)”又称代谢性脂肪性肝炎，是病理变化与酒精性肝炎相似 但无过量饮酒史的临床综合征，好发于中年特别是超重肥胖个体。非酒精性脂肪性肝炎与肥 胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高脂血症等代谢紊乱关系密切，其主要特征为肝细胞大泡性 脂肪变伴肝细胞损伤和炎症，严重者可发展为肝硬化，尚无特殊治疗措施。
[0066]“酒精性脂肪性肝炎(ash)”是指长期大量饮酒引起的以脂肪在肝脏中堆积，以及肝 脏中的炎症和癫痕为特征的病状。
[0067]“脂肪肝的b超诊断i”：1.肝区近场回声弥漫性增强(强于肾脏和脾脏)，远场回声逐渐 衰减；2.肝内管道结构显示不清；3.肝脏轻至中度肿大，边缘角圆钝；4.彩色多普勒血
流 显象提示肝内彩色血流信号减少或不易显示.但肝内血管走向正常；5.肝右叶包膜及横膈回 声显示不清或不完整。具备上述第l项及第2～4项中一项者为轻度脂肪肝；具备上述第l项 及第2-4项中两项者为中度脂肪肝；具备上述第l项以及2～4项中两项和第5项者为重度脂 肪肝。
[0068]“代谢综合征”是指人体的蛋白质、脂肪、碳水化合物等物质发生代谢紊乱的病理状态， 是一组复杂的代谢紊乱症候群，是导致糖尿病心脑血管疾病的危险因素。多种代谢紊乱集于 一身，包括肥胖、高血糖、高血压、血脂异常、高血黏、高尿酸、高脂肪肝发生率和高胰岛 素血症。
[0069]“胰岛素敏感度”是指细胞响应于胰岛素的作用而吸收葡萄糖的能力。
[0070]“胰岛素抵抗”是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的 分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。胰岛素抵抗易导致代谢综合征和2 型糖尿病。
[0071]“改善胰岛素抵抗”是指增加细胞产生正常的胰岛素反应的能力。在某些实施方案中，改 善肝细胞中的胰岛素抵抗，导致肝细胞中的葡萄糖储存增加。
[0072]“糖尿病血脂异常”或“具有血脂异常的2型糖尿病”是指以2型糖尿病、hdlc减少、血 清甘油三脂升高和小且密的ldl颗粒升高为特征的病状。
[0073]“脂肪变性”是指细胞浆内甘油三酯(中性脂肪)的蓄积称为脂肪变或脂肪变性，多发生 于代谢旺盛、耗氧多的组织，如肝细胞等。
[0074]“葡萄糖耐量测试”或“gtt”是指是一种葡萄糖负荷试验，用以了解胰岛β细胞功能和机 体对血糖的调节能力，是诊断糖尿病的确诊试验，广泛应用于临床实践中。“ipgtt”是指在 腹膜内注射葡萄糖后进行gtt。“ogtt”是指在口服葡萄糖后进行gtt。在某些实施方案中， gtt是用来测试糖尿病前期。在某些实施方案中，gtt是用来鉴定患有糖尿病的受试者。在 某些实施方案中，gtt是用来鉴定处于患上糖尿病的风险中的受试者。在某些实施方案中， gtt是用来鉴定患有胰岛素抵抗的受试者。
[0075]“胰岛素耐量测试(itt)”是指通过对低血糖水平压力的激素反应来测量胰岛素敏感度的 测试。正常人于静脉注射胰岛素(0.1μu/kg体重)后15～30min，其血糖浓度比空腹时下降 50％；在60～90min内应恢复到空腹血糖水平。在某些实施方案中，itt是用来测试糖尿病 前期。在某些实施方案中，itt是用来鉴定患有糖尿病的受试者。在某些实施方案中，itt 是用来鉴定处于患上糖尿病的风险中的受试者。在某些实施方案中，itt是用来鉴定有胰岛 素抵抗的受试者。
[0076]“抗mir”是指具有与某微小rna互补的核苷碱基序列且靶向此微小rna的寡核苷酸。 在某些实施方案中，抗mir是经修饰的寡核苷酸。
[0077]“受试者”是指经选择用于治疗或疗法的人或非人动物。
[0078]“处于患上......的风险”是指受试者倾向于患上某种病状或疾病。在某些实施方案中，处于 患上病状或疾病风险中的受试者表现出病状或疾病的一个或多个症状，但所述症状的程度比 可诊断为该病状或疾病的所需程度低。在某些实施方案中，处于患上病状或疾病的风险中的 受试者表现出病状或疾病的一个或多个症状，但并没有表现出诊断为该病状或疾病的足够数 量的症状。
[0079]“施用”是指将试剂或组合物提供给受试者，并且包括(但不限于)由医疗专业人员
施用 和自我施用。
[0080]“皮下施用”是指在皮肤正下方施用。
[0081]“静脉内施用”是指施用至静脉内。
[0082]“肠胃外给药”是指通过注射或输液的施用。肠胃外给药包括(但不限于)皮下施用、静 脉内施用或肌内施用。
[0083]“共同施用”是指至少两种试剂以同时在受试者体内显示药理作用的任何方式施用受试 者。共同施用并不需要两种试剂以单一药物组合物、以相同剂型，或由相同施用途径施用。 试剂发挥效应的时间不必是相同的。所述效应仅需要重叠一段时间而不需要共同延续。
[0084]“疗法”是指疾病治疗方法。在某些实施方案中，疗法包括(但不限于)化疗、手术切除、 肝脏移植和/或化疗栓塞。
[0085]“治疗”是指一种或多种用于治愈或改善疾病的特定疗法的应用。在某些实施方案中，具 体疗法是施用一种或多种药剂。
[0086]“改善”是指减轻病状或疾病的至少一个指标的严重程度。指标的严重程度可由本领域技 术人员己知的主观或客观测量来确定。在某些实施方案中，改善包括延缓或减缓病状或疾病 的一个或多个指标的进展。
[0087]“预防”是指在处于患上疾病或病状风险中的受试者中预防病状或疾病的进展。在某些实 施方案中，处于患上疾病或病状风险中的受试者接受与已经患有疾病或病状的受试者所接受 的治疗类似的治疗。
[0088]“延缓”是指在处于患上疾病或病状风险中的受试者中延缓病状或疾病的进展。在某些实 施方案中，处于患上疾病或病状风险中的受试者接受与已经患有疾病或病状的受试者所接受 的治疗类似的治疗。
[0089]“治疗剂”是指用于治愈、改善或预防疾病的药剂。
[0090]“剂量”是指在单一施用中提供的药剂的指定数量。在某些实施方案中，当需要皮下施用 时，所需剂量的必要体积不便于由单次注射来提供。在此类实施方案中，可使用两次或更多 次注射以实现所需的剂量。在某些实施方案中，剂量可通过两次或更多次注射来施用，以使 在个体中的注射部位反应最小化。
[0091]“剂量单位”是指所提供的药剂的形式。在某些实施方案中，剂量单位是含有冻干寡核苷 酸的小瓶。在某些实施方案中，剂量单位是含有复原的寡核苷酸的小瓶。
[0092]“治疗有效量”是指为动物提供了治疗效果的药剂的量。
[0093]“药物组合物”是指适合于施用给个体的包括药剂的物质的混合物。例如，药物组合物可 包括无菌水溶液。
[0094]“药剂”是指在施用给受试者时提供治疗效果的物质。
[0095]“活性药物成分”是指药物组合物中的可提供预期效果的物质。
[0096]“改善的肝功能”是指肝功能向正常范围的变化。在某些实施方案中，通过测量受试者血 清中分子来评估肝功能。例如，在某些实施方案中，改善的肝功能是通过血液肝脏转氨酶水 平下降来测量的。
[0097]“可接受的安全特征”是指在临床上可接受界限内的副作用模式。
[0098]“副作用”是指除预期效果以外的可归因于治疗的生理反应。在某些实施方案中，
特异性核糖核酸酶对pri-mir裂解的产物。
[0121]“茎环序列”是指具有发夹结构并包含成熟mirna序列的rna。前体mirna序列和茎环 序列可重叠。茎环序列的实例可见于称为mirbase的mirna数据库 (http://microrna.sanger.ac.uk/)。
[0122]“pri-mirna”或“pri-mir”是指具有发夹结构的非编码rna，其为双链rna特异性核糖核 酸酶drosha的底物。
[0123]“mirna前体”是指源于基因组dna的转录物，并且其包含含有一个或多个mirna序列 的非编码、结构化rna。例如，在某些实施方案中，mirna前体为前体mirna。在某些实 施方案中，mirna前体为pri-mirna。
[0124]“mir-221”是指具有seq id no:l(accuggcauacaauguagauuu)中所示的核苷碱 序列的成熟mirna。
[0125]“mir-222”是指具有seq id no:2(agcuacaucuggcuacugggu)中所示的核苷碱基 序列的成熟mirna。
[0126]“mir-221-1茎环序列”是指具有seq idno:3(ugaacauccaggucuggggcaugaaccuggcauacaauguagauuucugugu ucguuaggcaacagcuacauugucugcuggguuucaggcuaccuggaaacauguuc uc)中所示的核苷碱基序列的mir-221前体。
[0127]“mir-222-1茎环序列”是指具有seq idno:4(gcugcuggaagguguagguacccucaauggcucaguagccaguguagauccu gucuuucguaaucagcagcuacaucuggcuacugggucucugauggcaucuucuag cu)中所示的核苷碱基序列的mir-222前体。
[0128]“mir-221/222”是指具有seq id no:1或seq id no:2核苷碱基序列的微小rna。
[0129]“单顺反子转录物”是指包含单个mirna序列的mirna前体。
[0130]“多顺反子转录物”是指含有两个或更多个mirna序列的mirna前体。
[0131]“种子序列”是指从成熟mirna序列的5’端起的2至6个或2至7个核心核苷酸。
[0132]“包含由多个连接核苷组成的寡核苷酸的化合物”是指包含具有指定数量的连接核苷的寡 核苷酸的化合物。因此，该化合物可能包含另外的取代基或缀合物。除非另外说明，否则该 化合物不包含除那些所述核苷之外的任何另外的核苷。
[0133]“寡核苷酸”是指连接核苷的聚合物，其中每个可以彼此独立地经修饰或未经修。
[0134]“寡聚化合物”是指包含经连接的单体亚基的聚合物的化合物。
[0135]“天然存在的核苷间键合”是指核苷之间的3＇至5＇磷酸二酯键。
[0136]“天然糖”是指在dna(2'-h)或rna(2'-oh)中存在的一种糖。
[0137]“天然核苷碱基”是指相对于其天然存在形式未经修饰的核苷碱基。
[0138]“核苷间键合”是指相邻核苷之间的共价键。
[0139]“连接核苷”是指由共价键连接的核苷。
[0140]“核苷碱基”是指能够与另一核苷碱基非共价配对的杂环部分。
[0141]“核苷”是指与糖连接的核苷碱基。
[0142]“核苷酸”是指具有与核苷的糖部分共价连接的磷酸根的核苷。
[0143]“修饰寡核苷酸”是指相对于天然存在的末端、糖、核苷碱基和/或核苷间键合具有一个或 多个修饰的寡核苷酸。
[0144]“单链的修饰寡核苷酸”是指未与互补链杂交的寡核苷酸。
[0145]“修饰核苷间键合”是指由天然存在的核苷间键合的任何变化。
[0146]“硫代磷酸酷核苷间键合”是指核苷之间的键，其中一个非桥接原子是硫原子。
[0147]“修饰核苷碱基”是指不同于天然核苷碱基的任何替代和/或变化。
[0148]“修饰糖”是指不同于天然糖的替换和/或任何变化。
[0149]
‘
2＇-o-甲基糖”或“2'-ome糖”是指2＇位置处具有o-甲基修饰的糖。
[0150]
‘
2＇-o-甲氧基乙基糖”或“2'-moe糖”是指2＇位置处具有o-甲氧基乙基修饰的糖。
[0151]“2＇-o-氟”或“2'-f”是指2＇位置处具有氟修饰的糖。
[0152]“5-甲基胞嘧啶”是指附接至5＇位置的经甲基修饰的胞嘧啶。
[0153]“双环糖部分”是指通过桥接两个非成对环原子来修饰的糖。
[0154]“2＇-o-甲氧基乙基核苷”是指具有2＇-o-甲氧基乙基糖修饰的2＇-修饰核苷。
[0155]“2＇-氟核苷”是指具有2＇-氟代糖修饰的2＇-修饰的核苷。
[0156]“2＇-o-甲基核苷”是指具有21-o-甲基糖修饰的2＇-修饰的核苷。
[0157]“双环核苷”是指具有双环糖部分的2＇-修饰的核苷。
[0158]“基序”是指寡核苷酸中的经修饰和/或未经修饰的核苷碱基、糖和/或核苷间键合的模式。
[0159]“完全修饰的寡核苷酸”是指每个核苷碱基、每个糖和/或每个核苷间键合为经修饰的。
[0160]“均匀修饰的寡核苷酸”是指在整个修饰寡核苷酸中每个核苷碱基、每个糖和/或每个核苷 间键合具有相同的修饰。
[0161]“间隙体(gapmer)”是指具有定位于两个连接核苷的外部区域之间的连接核苷的内部区 域的修饰寡核苷酸，其中核苷的内部区域所包含的糖部分不同于每个核苷的外部区域的糖部 分。
[0162]“间隙片段(gapsegment)”是定位于外部区域之间的间隙体的内部区域。
[0163]“翼片段”是定位于内部区域的5＇或3＇末端的间隙体的外部区域。
[0164]“对称间隙体”是指每个外部区域的每个核苷包括相同的糖修饰。
[0165]“非对称间隙体”是指一个外部区域的每个核苷包含第一种糖修饰，而另一个外部区域的 每个核苷包含第二种糖修饰。
[0166]“稳定化修饰”是指相对于由磷酸二酯核苷间键合连接的2＇-脱氧核苷所提供的稳定性， 使得经修饰的寡核苷酸在核酸酶存在下的稳定性得到增强的核苷修饰。例如，在某些实施方 案中，稳定化修饰是稳定化核苷修饰。在某些实施方案中，稳定化修饰是核苷间键合修饰。
[0167]“稳定化核苷”是指相对于由2＇-脱氧核苷提供的稳定性，为寡核苷酸提供增强的核酸酶 稳定性的经修饰核苷。在一个实施方案中，稳定化核苷是2＇-修饰核苷。
[0168]“稳定化核苷间键合”是指相对于由磷酸二酯核苷间键合提供的稳定性，为寡核苷酸提供 改进的核酸酶稳定性的核苷间键合。在一个实施方案中，稳定化核苷间键合是硫代磷酸酯核 苷间键合。
[0169]
如本发明所示，施用与mir-221互补的寡核苷酸减少肝脏脂肪沉积水平、肝脏炎症浸润 和肝脏胶原蛋白沉积，预防和/或延缓肝细胞癌的发生。在脂肪性肝炎的动物模型中观察到这 些效应。与mir-221中的任何一个或两个互补的寡核苷酸可用于实现本发明所述
的表型结果。
[0170]
施用包括与mir-221或其前体互补的寡核苷酸的化合物可能导致一个或多个临床上期望 的结果。此类临床上期望的结果包括(但不限于)降低肝脏脂肪沉积、降低肝脏炎症浸润、 降低肝脏纤维化水平、降低肝脏肿瘤发生。
[0171]
本发明提供降低肝脏脂肪沉积、降低肝脏炎症浸润、降低肝脏纤维化水平、降低肝脏肿 瘤发生的方法和组合物。本发明还提供治疗、预防或延缓与脂肪肝、胰岛素敏感度降低和血 浆胆固醇增加有关的代谢紊乱出现的方法；或者代谢紊乱包括(但不限于)糖尿病前期、2 型糖尿病、代谢综合征、肥胖、糖尿病血脂异常、高血糖和高胰岛素血症；或者患有代谢紊 乱的受试者也患有脂肪肝疾病；或者脂肪肝疾病包括(但不限于)非酒精性脂肪肝疾病、酒 精性脂肪肝疾病和非酒精性脂肪性肝炎。
[0172]
本发明提供降低受试者肝脏脂肪沉积的方法，其包括向受试者施用包含由12至30个连 接核苷组成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物。
[0173]
本发明提供降低受试者肝脏脂肪沉积的方法，其包括向受试者施用包含由7至12个连接 核苷组成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物。
[0174]
本发明提供的方法包括b超检测肝脏脂肪浸润水平。可在包含由12至30个连接核苷组 成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物施用前和/或后，b超检测肝脏 脂肪浸润水平。
[0175]
在受试者禁食至少8小时时，b超检测肝脏脂肪浸润水平；或者受试者具有轻度脂肪肝； 或者受试者被鉴定为轻度脂肪肝，这种鉴定通常是由医疗专业人员进行的。或者代谢紊乱的 受试者患有中度脂肪肝；或者根据受试者的肝脏浸润水平鉴定出受试者患有中度脂肪肝，中 度脂肪肝的诊断通常是由医疗专业人员进行。或者受试者患有重度脂肪肝；或者根据受试者 的肝脏浸润水平鉴定出受试者患有重度脂肪肝，诊断通常是由医疗专业人员进行。
[0176]
本发明提供的方法包括在施用包含由12至30个连接核苷组成并具有与mir-221互补的 核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物之前监测肝脏脂肪浸润水平，或者本发明提供的方法包括 在施用包含由12至30个连接核苷组成，并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸 的化合物之后测量肝脏脂肪浸润水平。
[0177]
用于降低肝脏脂肪浸润水平的方法包括将受试者的肝脏影像学表现降低至诸如中华医学 会肝脏病学分会或世界卫生组织的医疗机构所确定的正常肝脏影像学表现。
[0178]
本发明提供降低受试者肝脏纤维化的方法，其包括向受试者施用包含由12至30个连接 核苷组成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物；或者本发明提供降低 受试者肝脏纤维化的方法，其包括向受试者施用包含由7至12个连接核苷组成并具有与 mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物。
[0179]
本发明提供的方法包括肝脏瞬时弹性探测(fibroscan)检测肝脏纤维化水平。可在包含 由12至30个连接核苷组成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物施用 前和/或后，fibroscan检测肝脏纤维化水平；或者在受试者禁食至少8小时时，fibroscan检 测肝脏脂肪浸润水平；或者受试者具有轻度肝脏纤维化；或者受试者被鉴定为轻度肝脏纤维 化，这种鉴定通常是由医疗专业人员进行的；或者代谢紊乱的受试者患有中度肝脏纤维化； 或者根据受试者的肝脏瞬时弹性图谱鉴定出受试者患有中度肝脏纤维
化，中度肝脏纤维化的 诊断通常是由医疗专业人员进行；或者受试者患有重度肝脏纤维化；或者根据受试者的肝脏 瞬时弹性图谱鉴定出受试者患有重度肝脏纤维化，诊断通常是由医疗专业人员进行。
[0180]
本发明提供的方法包括在施用包含由12至30个连接核苷组成并具有与mir-221互补的 核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物之前监测肝脏瞬时弹性图谱；或者本发明提供的方法包括 在施用包含由12至30个连接核苷组成，并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸 的化合物之后测量肝脏瞬时弹性图谱。
[0181]
用于降低肝脏纤维化水平的方法包括将受试者的肝脏影像学表现降低至诸如中华医学会 肝脏病学分会或世界卫生组织的医疗机构所确定的正常肝脏影像学表现。
[0182]
施用每周至少进行至少一次；或者施用每两周进行一次；或者施用每三周进行一次；或 者施用每四周进行一次.施用频率可由医疗专业人员设置。
[0183]
降低受试者肝细胞癌发生的方法其包括向受试者施用包含由12至30个连接核苷组成并 具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物，或者包括向受试者施用包含由7 至12个连接核苷组成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物。
[0184]
本发明提供的方法包括b超检测肝脏肿瘤发生情况。可在包含由7至30个连接核苷组 成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物施用前和/或后，b超检测肝脏。
[0185]
本发明提供用于降低受试者的血浆胆固醇的方法，其包括向受试者施用包含由12至30 个连接核苷组成并具有与mir-221或其前体互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物；或者 包括向受试者施用包含由7至12个连接核苷组成并具有与mir-221的核苷碱基序列的寡核苷 酸的化合物；或者受试者具有升高的血浆胆固醇；或者受试者被鉴定为具有升高的血浆胆固 醇；或者施用降低了血浆胆固醇；或者血浆胆固醇是血浆ldl-胆固醇；或者血浆胆固醇是血 浆vldl-胆固醇。
[0186]
本发明提供用于改善受试者的胰岛素抵抗的方法，其包括向受试者施用包含由12至30 个连接核苷组成并具有与mir-221其前体互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物；或者受 试者具有胰岛素抵抗；或者所述方法包括选择具有胰岛素抵抗的受试者。
[0187]
本发明提供用于改善受试者的胰岛素抵抗的方法，其包括向受试者施用包含由7至12个 连接核苷组成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物；或者血糖水平升 高的受试者具有胰岛素抵抗；或者患有脂肪肝的受试者具有胰岛素抵抗。
[0188]
本发明提供用于治疗受试者的代谢紊乱的方法，其包括向受试者施用包含由12至30个 连接核苷组成并具有与mir-221及其前体互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物；或者受 试者患有代谢紊乱；或者受试者被鉴定为患有代谢紊乱；或者代谢紊乱包括(但不限于)糖 尿病前期、2型糖尿病、代谢综合征、肥胖或糖尿病血脂异常、高血糖和高胰岛素血症；或 者受试者经诊断患有一种或多种代谢紊乱。在实施医学领域技术人员所熟知的医学测试后， 受试者可被诊断出患有代谢紊乱。
[0189]
本发明提供用于治疗受试者的代谢紊乱的方法，其包括向受试者施用包含由7至12个连 接核苷组成，并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物。
[0190]
本发明提供用于预防受试者的代谢紊乱出现的方法，其包括向受试者施用包含由
12至 30个连接核苷组成并具有与mir-221或其前体互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物；或 者受试者处于患上代谢紊乱的风险中；或者受试者被鉴定为处于患上代谢紊乱的风险中；或 者代谢紊乱是糖尿病前期、2型糖尿病、代谢综合征、肥胖或糖尿病血脂异常、高血糖、高 胰岛素血症。
[0191]
本发明提供用于预防受试者的代谢紊乱出现的方法，其包括向受试者施用包含由7至12 个连接核苷组成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物。
[0192]
本发明提供用于延缓受试者的代谢紊乱出现的方法，其包括向受试者施用包含由12至 30个连接核苷组成并具有与mir-221或其前体互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物；或 者受试者处于患上代谢紊乱的风险中；或者受试者被鉴定为处于患上代谢紊乱的风险中；或 者代谢紊乱包括(但不限于)糖尿病前期、2型糖尿病、代谢综合征、肥胖或糖尿病血脂异 常、高血糖和高胰岛素血症。
[0193]
本发明提供用于延缓受试者的代谢紊乱出现的方法，其包括向受试者施用包含由7至12 个连接核苷组成并具有与mir-221互补的核苷碱基序列的寡核苷酸的化合物。
[0194]
受试者患有一种或多种代谢紊乱，或者受试者经诊断患有一种或多种代谢紊乱。在实施 医学领域技术人员所熟知的医学测试后，受试者可被诊断出患有代谢紊乱。
[0195]
受试者对治疗的反应可通过与用于诊断代谢紊乱的那些测试类似的测试(包括血脂水平、 血肝功水平、血糖水平测试、葡萄糖耐量测试和hbalc测试)来评估。对治疗的反应也可通 过将治疗后的测试结果与治疗前的测试结果比较来进行评估。
[0196]
mir-221的活性通过使用微小rna海绵(micrornasponge)来抑制，所述微小rna海绵 包括具有与mir-221互补的核苷碱基的一个或多个序列。“微小rna海绵”是指由强启动予表 达的转录物形式的微小rna的竞争性抑制剂，其包含所关注的微小rna的多个串联结合位 点。当将编码这些海绵的载体引入细胞中时，海绵至少与化学修饰的反义寡核苷酸同样强烈 地使微小rna靶去抑制。其特异性地抑制具有互补七价种子的微小rna，以使得单个海绵 可以用来阻断整个微小rna种子家族，微小rna种子家族包括mir-221。
[0197]
某些化合物
[0198]
本发明提供的化合物用于治疗脂肪性肝炎，肝脏纤维化和预防延缓肝细胞癌的发生，或 者化合物包括寡核苷酸，或者化合物由寡核苷酸组成，或者寡核苷酸是经修饰的寡核苷酸。
[0199]
某些核苷碱基序列
[0200]
本发明所列的核苷碱基序列(包括但不限于实施例和序列表中的那些核苷碱基序列)与 核酸的任何修饰无关。因此，由seq id no定义的核酸可独立地包含对一个或多个糖部分、 对一个或多个核苷间键合和/或对一个或多个核苷碱基的一个或多个修饰。
[0201]
寡核苷酸具有与mir-221的核苷碱基序列(seq id no:1)互补的核苷碱基序列；或者 寡核苷酸具有包含核苷碱基序列cagcagacaatgtagc(seq id no:5)的核苷碱基序列； 或者寡核苷酸具有由核苷碱基序列agtagccagatgtagc(seq id no:6)组成的核苷碱基 序列；或者寡核苷酸包含与mir-221之间共同的种子序列互补的核苷碱基序列。本发明所述 的具有任何长度的寡核苷酸可包含种子匹配序列。
[0202]
经修饰的寡核苷酸的核苷碱基序列包含核苷碱基序列cagcagacaatgtagc(seq idno:5)，其与mir-221(seq id no:l)的核苷酸互补；或者经修饰的寡核苷酸的核苷碱基序列
包 含核苷碱基序列agtagccagatgtagc(seq id no：6)，其与的核苷酸互补。具有包含核 苷碱基序列(seq id no:5和6)的寡核苷酸己被证明能够抑制mir-221的活性。这些经修饰的 寡核苷酸中的某些寡核苷酸在每个核苷处具有lna糖修饰。
[0203]
虽然附随本技术的序列表按需要将每个核苷碱基序列确定为“rna”或“dna”，但是实际 上，这些序列可以用化学修饰的任意组合来修饰。本领域技术人员将易于了解用来描述修饰 寡核苷酸的像“rna”或“dna＇’这样的名称在某种程度上是任意的。例如，包含含有2'-oh 糖部分和胸腺嘧啶碱基的核苷的寡核苷酸可以被描述为具有经修饰的糖的dna(2'-oh替代 dna的天然2＇-h)，或描述为具有经修饰的碱基的rna(胸腺嘧啶(甲基化尿嘧啶)替代 rna的天然尿嘧啶)。
[0204]
本发明所提供的核酸序列(包括但不限于序列表中的那些核酸序列)预期包括含有天然 或修饰rna和/或dna的任意组合的核酸，包括但不限于具有修饰核苷碱基的核酸。通过进 一步举例，并且没有限制地，具有核苷碱基序列“tgtagc”的寡聚化合物包括具有此类核苷 碱基序列(不论经修饰或未经修饰)的任何寡聚化合物，其包括(但不限于)此类包含rna 碱基的化合物，诸如那些具有序列“tgtagc”的化合物和那些具有一些dna碱基和一些rna 碱基的化合物，诸如“tgtagc”，以及具有其他修饰碱基的寡聚化合物，诸“tmegtagc”， 其中meg表示包含甲基的鸟嘌呤碱基。
[0205]
某些修饰寡核苷酸
[0206]
寡核苷酸由21至24个连接核苷组成；或者寡核苷酸由19至24个连接核苷组成，或者 寡核苷酸由15至30个连接核苷组成，或者寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，或者寡核 苷酸由7至11个连接核苷组成，或者寡核苷酸由7至25个连接核苷组成。
[0207]
本发明提供的寡核苷酸可包含对核苷碱基、糖和/或核苷间键合的一个或多个修饰，并由 此成为经修饰的寡核苷酸。因为经修饰的核苷碱基、糖和/或核苷间键合可获得期望的特性， 例如增强的细胞摄取、对于其靶向寡核苷酸的增强的亲和力或在核酸酶存在下的提高的稳定 性，所以它们优于未经修饰的形式。
[0208]
经修饰的寡核苷酸包含一个或多个修饰核苷，或者经修饰的核苷是稳定化核苷。稳定化 核苷的一个实例是经糖修饰的核苷；或者经修饰的核苷是经糖修饰的核苷；或者糖修饰核苷 可以进一步包含天然或经修饰的杂环碱基部分和/或天然或经修饰的核苷间键合，并可包含与 糖修饰无关的进一步修饰；或者糖修饰核苷是2
’‑
修饰核苷，其中糖环在来自天然核糖或2
’‑ꢀ
脱氧核糖的2
’‑
碳处修饰。
[0209]
某些寡核苷酸基序
[0210]
适合于本发明的修饰寡核苷酸的基序包含(但不限于)完全修饰、均匀修饰、定位修饰 和间隙体。可设计具有包括均匀修饰基序的完全修饰基序的修饰寡核苷酸用来靶向成熟 mirna。可选地，可设计具有包括均匀修饰基序的完全修饰基序的修饰寡核苷酸用来靶向 pri-mirna或前体mirna的某些位点，以阻止将mirna前体加工成成熟的mirna。具有完 全修饰基序或均匀修饰基序的修饰寡核苷酸是mirna活性的有效抑制剂。
[0211]
某些另外的疗法
[0212]
脂肪性肝炎，肝纤维化和肝细胞癌的治疗可能包含超过一种疗法。本发明提供用于治疗 脂肪性肝炎，肝纤维化和肝细胞癌的方法，其包括向有需要的受试者施用包含与mir-221和/ 或其前体互补的寡核苷酸的化合物，并且还包括施用至少一种另外的药剂；或
730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、 785mg、790mg、795mg和800mg。药物组合物包含选自以下的修饰寡核苷酸剂量：25mg、 50mg、75mg、l00mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg、 700mg和800mg。
[0218]
某些实施方案中，药剂是无菌冻干的修饰寡核苷酸，其用合适的稀释剂(例如注射用无 菌盐水)复原。复原的产品在用盐水稀释后以皮下注射或静脉输注的形式施用。冻干药物产 品由寡核苷酸组成，在制备过程中，在用酸或碱调整至ph值7.0-9.0的注射用盐水中制备寡 核苷酸，然后将其冻干。冻干的修饰寡核苷酸可以是25-800mg的寡核苷酸。应了解，这包含 25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、425、450、 475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775和800mg的修饰冻 干寡核苷酸。冻干药物产品可包装在2ml的i型透明玻璃小瓶(硫酸铵处理)中，用溴化丁 基橡胶塞塞住，并用铝flip-off外盖密封。
[0219]
本发明提供的药物组合物可另外含有通常存在于药物组合物中的其他辅助成分，其具有 本领域中确定的使用量。举例来说，组合物可包含另外的相容性药学活性材料，例如，局部 麻醉剂或消炎剂或可包含用于物理配制本发明组合物的各种剂型的另外的材料，如染料、调 昧剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，此类材料在添加时不应不当地 干扰本发明组合物组分的生物活性。配方可经杀菌，并且(如果需要的话)与不以有害方式 与配方的寡核苷酸相互作用的助剂混合，所述助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、 乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。
[0220]
脂质部分己以多种方法用于核酸疗法中。在第一种方法中，将核酸引入由阳离子脂质和 中性脂质的混合物制成的预制脂质体或脂质复合物(lipoplex)中。在另一种方法中，在没有中 性脂质存在的情况下，形成具有单或聚阳离子脂质的dna复合物；或者选择脂质部分以增 加药剂在特定细胞或组织中的分布。或者使用英脱利匹特注射液(intralipid)来制备包含 寡核苷酸的药物组合物。英脱利匹特注射液是经制备用于静脉内施用的脂肪乳状液。它由10％ 大豆油、1.2％蛋黄磷脂、2.25％甘油和注射用水组成。此外，己加入氢氧化纳以调整ph值， 使最终产物的ph值范围为6至8.9。
[0221]
或者本发明提供的药物组合物包含一种或多种修饰寡核苷酸和一种或多种赋形剂；或者 赋形剂选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘 性石蜡、羟基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
[0222]
或者本发明提供的药物组合物是液体(例如，悬浮液、剂和/或溶液)；或者液体药物组 合物使用本领域己知的成分制备，所述成分包括(但不限于)水、乙二醇、油、醇、调味剂、 防腐剂和着色剂。
[0223]
本发明提供的药物组合物使用已知技术制备，所述技术包括(但不限于)混合、溶解、 制粒、糖衣丸制造、磨细、乳化、封装、包埋或压片处理。
[0224]
或者本发明提供的药物组合物是固体(例如，粉末、片剂和/或胶囊)；或者包含一种或 多种寡核苷酸的固体药物组合物使用本领域己知的成分制备，所述成分包括(但不限于)淀 粉、糖、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。
[0225]
或者本发明提供的药物组合物制备为贮库(depot)制剂。某些此类储存制剂通常比非贮 库制剂更具有长效性；或者此类制剂通过植入(例如，皮下或肌内)或肌内注射来施用；或 者贮库制剂使用合适的聚合物或疏水性材料(例如可接受的油中的乳状液)或离子
交换树脂 制备，或制备成难溶的衍生物，例如，难溶的盐。
[0226]
或者本发明提供的药物组合物包含递送系统。递送系统的实例包括(但不限于)脂质体 和乳状液。某些递送系统可用于制备某些药物组合物，包括那些包含疏水性化合物的组合物； 或者使用某些有机溶剂，如二甲亚砜。
[0227]
或者本发明提供的药物组合物包含一种或多种经设计用来将一种或多种本发明药剂递送 到特定组织或细胞类型的组织特异性递送分子。例如，或者药物组合物包含涂有组织特异性 抗体的脂质体。
[0228]
或者本发明提供的药物组合物包含缓释系统。此类缓释系统的非限制性实例是一个固体 疏水性聚合物的半渗透性基质；或者取决于其化学性质，缓释系统可在几个小时、几天、几 周或几个月内释放药剂。
[0229]
或者本发明提供的药物组合物经制备用于口服；或者通过将一种或多种包含寡核苷酸的 化合物与一种或多种药学上可接受的载体组合来配制药物组合物。某些此类载体能够将药物 组合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆液、混悬剂等，供 受试者口服；或者供口服的药物组合物通过将寡核苷酸和一种或多种固体赋形剂混合来获得。 合适的赋形剂包括(但不限于)填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇：纤维素 制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄胶、甲基纤维素、羟丙 基甲基纤维素、羧甲基纤维素纳和/或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)；或者将这种混合物任选地研 磨，并且任选地添加助剂；或者形成药物组合物以获得片剂片芯或糖衣丸丸芯；或者加入崩 解剂(例如，交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，如海藻酸纳)。
[0230]
或者糖衣丸丸芯具有包衣；或者可使用浓缩的糖溶液，其可远地含有阿拉伯树胶、滑石 粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及合适的有机溶剂或 溶剂混合物。可将染料或色素添加到片剂或糖衣丸包衣中。
[0231]
供口服的药物组合物为由明胶制成的推入配合式胶囊。某些此类推入配合式胶囊包含与 一种或多种填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石粉或硬脂酸模)以及 任边的稳定剂混合的一种或多种本发明药剂；或者口服药物组合物为由明胶和增塑剂(如甘 油或山梨醇)制成的密封软胶囊。在某些软胶囊中，本发明的一种或多种药剂被溶解或悬浮 于合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可添加稳定剂。
[0232]
药物组合物经制备用于口腔施用。某些此类药物组合物为以传统方式配制的片剂或锭剂。
[0233]
或者药物组合物经制备以通过注射(例如，静脉内、皮下、肌内等)进行施用；或者药 物组合物包含载体，并在例如水或生理相容的缓冲剂(如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐 水缓冲剂)的水溶液中配制；或者包含其他成分(例如，辅助溶解或作为防腐剂的成分)； 或者使用适当的液体载体、悬浮剂等来制备注射用悬浮液。用于注射的某些药物组合物以单 位剂型存在，如置于安中或在多剂量容器中。用于注射的某些药物组合物为油性或水性媒介 物中的悬浮液、溶液或乳状液，并可能包含调配剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。适合用 于注射用的药物组合物中的某些溶剂包括(但不限于)亲脂性溶剂和脂肪油(如芝麻油)、 合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三脂的和脂质体。水性注射悬浮液可能含有增加悬浮液粘 度的材料，如羧甲基纤维素纳、山梨醇或右旋糖酐。任选地，此类悬浮液也可能包含合适的 稳定剂或增加药剂溶解度的试剂以制备高度浓缩的溶液。
[0234]
或者药物组合物经制备用于经粘膜施用；或者适合于待渗透的屏障的渗透剂可在制剂中 使用。此类渗透剂一般为本领域已知的。
[0235]
或者药物组合物经制备用于通过吸入施用。用于吸入的某些此类药物组合物制备成加压 包装或雾化器中的气溶胶喷雾剂形式。某些此类药物组合物包含推进剂，例如二氯二氟甲烷、 三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在使用加压气溶胶的某些实施方 案中，剂量单位可以由递送经计量数量的阀门来确定；或者可配制用于在吸入器或吹入器中 使用的胶囊和药筒。某些此类制剂包含本发明药剂和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉 末混合物。
[0236]
或者本发明提供的药物组合物包含治疗有效量的寡核苷酸。治疗有效量足以防止、减轻 或缓解疾病的症状或延长正在接受治疗的受试者的生存。治疗有效量的测定在本领域技术人 员的能力范围内。
[0237]
本发明提供的一种或多种修饰寡核苷酸被配制为前体药物。在体内施用后，前体药物化 学转换成生物学、药学或治疗上更具有活性的形式的寡核苷酸；或者因为前体药物比相应的 活性形式更容易施用，所以它们是有用的。例如，在某些情况下，前体药物可比相应的活性 形式具有更高的生物利用度(例如，通过口服施用)。在某些情况下，与相应的活性形式相 比，前体药物可具有改善的溶解度；或者与相应的活性形式相比，前体药物的水溶性较小。 在某些情况下，在水溶性不利于移动的情况下，此类前药具有优越的跨细胞膜输送能力；或 者前体药物是酯；或者施用后酯代谢性水解成羧酸。在某些情况下，含有羧酸的化合物为相 应的活性形式；或者前体药物包含与酸根结合的短肽(聚氨基酸)；或者肽在施用后裂解， 以形成相应的活性形式。
[0238]
某些试剂盒
[0239]
本发明还提供试剂盒，包含检测靶点mir-221的表达水平，mirna靶向的mrna和/或 蛋白质水平以及施用修饰寡核苷酸后的mirna反义抑制效应；经修饰寡核苷酸的本发明的 一种或多种的化合物，其中检测靶点试剂盒包含检测mir-221特异性引物，靶向的mrna引 物，靶向的蛋白抗体，检测试剂，可以用于检测血清样本或组织样本的cdna文库以及蛋白。 mirna的反义抑制通过测量mirna靶的mrna和/或蛋白质水平来评估。寡核苷酸的核苷 碱基序列与mir-221是互补的。与mir-221互补的化合物可为任何本发明所述的化合物，并 可以具有本发明所述的任何修饰；或者与mir-221互补的化合物可以存在于小瓶中。多个(如 10个)小瓶可以出现在例如配药包中；或者小瓶经制造以便于注射器进入。试剂盒还可以包 含使用检测靶点与mir-221互补的化合物的说明书。
[0240]
试剂盒可用于将与mir-221互补的化合物施用给受试者。在这种情况下，除了与mir-221 互补的化合物以外，试剂盒可进一步包含以下一个或多个：注射器、酒精棉签、棉花球和/或 纱布垫；或者与mir-221互补的化合物可以存在于预充式注射器(如单剂量注射器，其具有 例如27号的1/2英寸针与护针器)中，而不是在小瓶中。多个(如10个)预充注射器可以 出现在例如配药包中。试剂盒还可以包含检测靶点与施用mir-221互补的化合物的说明书。
[0241]
某些实验模型
[0242]
本发明提供在实验模型中使用和/或测试本发明的修饰寡核苷酸的方法。本领域技术人员 能够选择和修改用于此类实验模型的实验方案以评价本发明的药剂。
[0243]
一般来说，修饰的寡核苷酸首先在培养细胞中测试。合适的细胞类型包括与需要在体内 向其递送寡核苷酸的细胞类型有关的细胞类型。例如，适用于本发明所述的研究方法中的细 胞类型包括原代肝细胞、hepg2细胞。
[0244]
在培养细胞中评估寡核苷酸干扰mirna活性的程度；或者可通过测量mirna水平来评 估mirna活性的抑制。可选地，可测量经预测或经验证的mirna靶的水平。mirna活性 的抑制可导致mirna靶的mrna和/或蛋白质增加。此外，可测量某些表型结果。例如，适 当的表型结果包括脂质和胶原蛋白沉积，肿瘤发生率等。
[0245]
适用于本发明所述的测试方法的实验动物模型包括：mcd饮食小鼠(用于脂肪性肝炎的 模型)、ccl4小鼠(用于脂肪性肝炎的模型)和高脂肪喂食的c57bl6/j小鼠。
[0246]
提供以下实施例以更充分地说明本发明的一些实施案。然而，这些实例绝不应解释为对 本发明的宽泛范围的限制。纵观实施例，除非另外指明，统计学显著性如下所示：*＝p《0.05； **＝p《0.01；***＝p《0.001。
[0247]
实施例1：微小rna在肝脏组织中的表达
[0248]
为了鉴定参与肝脏脂代谢，炎症浸润和纤维化形成的微小rna，针对微小rna表达对 肝脏组织进行了筛选。通过分析，以鉴定在mcd饮食小鼠，ccl4处理小鼠和高脂肪饮食诱 导的肥胖c57bl6/j小鼠的肝脏中失调的微小rna，这三种小鼠都是脂肪性肝炎的动物模型。 发现一对保守和广泛表达的微小rna mir-221和mir-222(参见图1)在这些模型的肝脏中被 上调。q-pcr结果显示在mcd饮食小鼠肝脏中，mir-221和mir-222分别上调了2-3倍，在 高脂肪饮食诱导肥胖小鼠肝脏中，mir-221和mir-222分别上调了1-2倍(参见表4)。
[0249]
表4：mir-221和mir-222在mcd饮食小鼠和高脂肪饮食诱导肥胖小鼠肝脏中上调。
[0250] 对照饮食mcd饮食对照饮食高脂饮食相对的mir-221表达值12.1411.75相对的mir-222表达值12.8311.6
[0251]
在健康个体、非酒精性脂肪肝疾病(nafld)和非酒精性脂肪性肝炎(nash)的人患者 的肝活检中分析微小rna表达。在患有nafld和nash的受试者肝脏样本中，mir-221/222 和mir-221/222的水平增加(参见表5)
[0252]
表5：人受试者的肝脏样本中的mir-221和mir-222表达
[0253][0254]
实施例2：敲除mir-221和mir-222缓解动物的肝脏脂肪累积，炎症浸润和胶原沉积， 纤维化形成
[0255]
mcd饮食小鼠常用作脂肪性肝炎的模型。因此，在对照小鼠和mir-221/222敲除小鼠中 建立mcd饮食模型评估mir-221/222对脂肪性肝炎的作用。mir-221/222在ko小鼠肝脏中 的敲除效果评估(参见表6)。
[0256]
表6：对照小鼠和mir-221/222-lko小鼠肝脏中的mir-221和mir-222表达水平
[0257] 对照小鼠mir-221/222-lko小鼠mir-221相对表达值10.15mir-222相对表达值10.11
[0258]
敲除mir-221和mir-222降低mcd饮食小鼠肝脏脂肪沉积(图3)。mir-221/222-lko 小鼠给予mcd饮食6周，肝脏切片油红染色油红面积统计发现敲除mir-221和mir-222显 著减少mcd饮食所致的肝脏脂滴量(表)。mir-221/222-lko小鼠给予mcd饮食6周，肝 脏切片透射电镜统计脂滴面积显示mir-221/222敲除显著降低mcd饮食所致的肝细胞脂滴量 (表7)。
[0259]
表7：mir-221/222敲除小鼠和对照小鼠在mcd饮食模型中脂滴量分析
[0260] 对照小鼠mir-221/222-lko小鼠油红o染色脂滴相对量10.26透射电镜脂滴相对量10.21
[0261]
敲除mir-221和mir-222降低mcd饮食小鼠肝脏炎症浸润(图4)。mir-221/222-lko 小鼠给予mcd饮食6周，肝脏组织检测炎症因子的表达水平，发现il-1β，tnfα及il-6表 达水平明显下降(表8)；炎症细胞markerf4/80的表达水平明显下降(表9)；肝脏切片h&e 染色显示炎症细胞浸润明显减少(图4)。
[0262]
表8：mir-221/222敲除小鼠和对照小鼠在mcd饮食模型中肝脏炎症因子il-1β，tnfα及il-6 表达水平
[0263] 对照小鼠mir-221/222-lko小鼠il-1β相对表达量10.46tnfα相对表达量10.53il-6相对表达量10.37
[0264]
表9：mir-221/222敲除小鼠和对照小鼠在mcd饮食模型中肝脏炎症细胞markerf4/80表达 水平
[0265] 对照小鼠mir-221/222-lko小鼠f4/80相对表达量10.26f4/80相对蛋白水平10.31
[0266]
敲除mir-221和mir-222降低mcd饮食小鼠肝脏胶原纤维沉积(图5)。mir-221/222-lko 小鼠给予mcd饮食6周，肝脏切片天狼星红染色和masson染色统计胶原纤维着色阳性面积 统计，发现敲除mir-221和mir-222可以显著降低mcd饮食引起的肝脏胶原纤维沉积(表 10)。mir-221/222-lko小鼠给予mcd饮食6周，肝脏组织测定胶原组织的主要成分羟基 脯氨酸(hydro
×
yproline)含量，发现敲除mir-221和mir-222可以显著降低mcd饮食引起 的肝脏羟基脯氨酸量(表11)。mir-221/222-lko小鼠给予mcd饮食6周，肝脏组织检测 肝脏组织胶原蛋白家族成员的表达水平，发现col1a1，col1a2及col3a1表达水平明显下降 (表12)；星状细胞markerα-sma的表达水平明显下降(表13)；肝脏切片透射电镜显示肝脏 细胞见胶原纤维沉积明显减少(图5)。
[0267]
表10：mir-221/222敲除小鼠和对照小鼠在mcd饮食模型中肝脏天狼星红和masson染色指 示胶原纤维阳性面积分析
[0268] 对照小鼠mir-221/222-lko小鼠
天狼星红染色阳性面积(％)1.430.4masson染色阳性面积(％)1.450.48
[0269]
表11：mir-221/222敲除小鼠和对照小鼠在mcd饮食模型中肝脏组织羟基脯氨酸含量分析
[0270] 对照小鼠mir-221/222-lko小鼠hydro
×
yproline含量(ng/mgliver)265.8173.2
[0271]
表12：mir-221/222敲除小鼠和对照小鼠在mcd饮食模型中肝脏胶原蛋白家族col1a1，col1a2 和col3a1表达水平
[0272] 对照小鼠mir-221/222-lko小鼠col1a1表达相对量10.37col1a2表达相对量10.31col3a1表达相对量10.42
[0273]
表13：mir-221/222敲除小鼠和对照小鼠在mcd饮食模型中肝脏星状细胞markerα-sma表达 水平
[0274] 对照小鼠mir-221/222-lko小鼠α-sma相对表达量10.34α-sma相对蛋白水平10.38
[0275]
敲除mir-221和mir-222降低mcd饮食小鼠肝脏损伤，降低转氨酶水平， mir-221/222-lko小鼠给予mcd饮食6周，测定小鼠血清中丙氨酸转氨酶水平，发现敲除 mir-221和mir-222降低mcd饮食引起的肝脏损伤，降低丙氨酸转氨酶水平(表14)。
[0276]
表14：mir-221/222敲除小鼠和对照小鼠在mcd饮食模型中血清丙氨酸转氨酶水平。
[0277] 对照小鼠mir-221/222-lko小鼠血清alt水平73.259.5
[0278]
实施例3：mir-221/222过表达恶化mcd饮食导致的脂肪性肝炎，加重肝脏脂肪累积， 炎症浸润和胶原沉积，纤维化形成
[0279]
腺病毒ad-mir-221/222感染mir-221/222lko小鼠肝脏使肝脏重新表达mir-221/222。 使用过表达mir-221/222的腺病毒ad-mir-221/222和对照腺病毒ad-gfp(滴度1*10
11
)尾 静脉注射(200微升/只)年龄为8周的mir-221/222lko小鼠，同时喂养mcd饮食6周。6 周后检测小鼠肝脏组织mir-221/222的表达，发现ad-mir-221/222可使敲除小鼠肝脏内 mir-221/222表达升高(表15)。
[0280]
表15：mir-221/222lko小鼠尾静脉注射ad-mir-221/222和ad-gfp，喂养6周mcd饮食 后，肝脏组织mir-221/222的表达
[0281]
[0282]
腺病毒ad-mir-221/222感染mir-221/222lko小鼠肝脏使肝脏脂质沉积增加。 mir-221/222lko小鼠重新表达mir-221/222并使用mcd饮食诱导脂肪性肝炎模型后，小鼠 肝脏体重比，肝脏甘油三脂均比对照小鼠升高(表16和17)。
[0283]
表16：mir-221/222lko小鼠尾静脉注射ad-mir-221/222和ad-gfp，喂养6周mcd饮食 后，肝脏体重比
[0284][0285]
表17：mir-221/222lko小鼠尾静脉注射ad-mir-221/222和ad-gfp，喂养6周mcd饮食 后，肝脏甘油三脂和胆固醇水平
[0286][0287][0288]
腺病毒ad-mir-221/222感染mir-221/222lko小鼠肝脏使肝脏炎症浸润增加；
[0289]
mir-221/222lko小鼠重新表达mir-221/222并使用mcd饮食诱导脂肪性肝炎模型后，小鼠 肝脏组织炎症因子及炎症细胞markerf4/80表达水平均比对照小鼠组升高(表18)。
[0290]
表18：mir-221/222lko小鼠尾静脉注射ad-mir-221/222和ad-gfp，喂养6周mcd饮食 后，肝脏组织炎症因子il-1β，tnfα和il-6及炎症细胞markerf4/80表达水平
[0291][0292]
腺病毒ad-mir-221/222感染mir-221/222lko小鼠肝脏使肝脏纤维化增加。 mir-221/222lko小鼠重新表达mir-221/222并使用mcd饮食诱导脂肪性肝炎模型后，小鼠 肝脏胶原蛋白沉积面积增加(图7，表19)。
[0293]
表19：mir-221/222lko小鼠尾静脉注射ad-mir-221/222和ad-gfp，喂养6周mcd饮食 后，肝脏组织胶原蛋白沉积面积(天狼星红染色和masson染色)分析
[0294]
每一处具有硫代磷酸酯修饰，以及具有通过羟基脯氨醇键合连接到3＇末端的胆固醇。
[0307]
对照抗mir-ctrl具有核苷碱基序列acgtctatacgccca(seqidno:7)，在每个糖处具有2
’‑
o-甲基修饰、在前4个核苷间键合中的每一处具有硫代磷酸酯修饰、最后2个核苷间键合中的每一处具有硫代磷酸酯修饰，以及具有通过羟基脯氨醇键合连接到3＇末端的胆固醇。因为mir-221和mir-222有核苷酸不同，所以抗mir-ctrl相对于与mir-221和mir-222均错配。
[0308]
除非另外指明，实验小鼠是8周龄对照雄性小鼠和8周龄mir-221/222lko雄性小鼠；并且mcd饮食小鼠是自8周龄起摄入mcd饮食6周的雄性小鼠。对小鼠抗mir-221(5
×
25mg/kg)、抗mir-222(5
×
25mg/kg)、抗mir-221+222(5
×
12.5+12.5mg/kg)或抗mir-ctrl(5
×
25mg/kg)。
[0309]
对照小鼠接受5次25mg/kg的抗mir-221或抗mir-222或者5次12.5mg/kg抗mir-221+222腹腔内注射。施用抗mir-ctrl作为对照治疗。mir-221和mir-222的rna表达分析表明，抗mir-221/222使肝脏中的mir-221/222沉默，而对无关的微小rna的表达没有影响。参见图9，表22。
[0310]
治疗后，测试小鼠alt水平，抗mir-221/222的治疗没有造成明显的毒性(用抗mir-221、抗mir-222、抗mir-221+222或抗mir-ctrl治疗的小鼠中分别为～20iu/l、～21iu/l、～19iu/l、～20iu/l)。
[0311]
实施例5：antimir-221/222可以有效的抑制mcd饮食小鼠肝脏的mir-221/222表达水平(图9，表23)
[0312]
对照小鼠随机分为4组，每组在1，4，8，15，和22天分别给予腹腔注射25mg/kglna-i-mir-nc，lna-i-mir-221，lna-i-mir-222或12.5mg/kglna-i-mir-221和12.5mg/kglna-i-mir-222(lna-i-mir-221+222)，同时在第1天开始给予mcd饮食。最后一次给予antimir一周后，收获小鼠，分析小鼠肝脏中mir-221/222的表达水平(表23)
[0313]
表23：antimir-221/222腹腔注射mcd饮食小鼠后，小鼠肝脏中mir-221/222的表达水平。
[0314][0315]
antimir-221/222可以有效的抑制mcd饮食小鼠肝脏的脂质沉积，炎症浸润(图10)。mcd饮食小鼠给予antimir-221/222，最后一次注射antimir一周后，收获小鼠，分析小鼠肝脏中血清及肝脏脂质水平，肝脏的脂质沉积，炎症浸润水平(表24)。
[0316]
表24：antimir-221/222腹腔注射mcd饮食小鼠后，小鼠肝脏中tg水平，炎症因子il-1β，tnfα和il-6表达水平以及炎症细胞markerf4/80表达水平
[0317][0318][0319]
antimir-221/222可以有效的抑制mcd饮食小鼠肝脏的胶原蛋白沉积(表25)。mcd饮 食小鼠给予antimir-221/222，最后一次注射antimir一周后，收获小鼠，分析小鼠肝脏组织 中胶原蛋白沉积面积(天狼星红染色和masson染色)(表25)。发现antimir-221/222可以 有效的减少mcd模型小鼠中肝脏的胶原蛋白沉积。
[0320]
表25：antimir-221/222腹腔注射mcd饮食小鼠后，小鼠肝脏组织天狼星红染色和masson 染色面积分析
[0321][0322]
antimir-221/222可以有效的抑制mcd饮食小鼠肝脏的胶原蛋白家族成员表达，抑制星 状细胞激活(表26)。mcd饮食小鼠给予antimir-221/222，最后一次注射antimir一周后， 收获小鼠，分析小鼠肝脏组织中胶原蛋白家族成员表达水平(表26)。发现antimir-221/222 可以有效的抑制mcd模型小鼠中肝脏的胶原蛋白家族成员的表达，抑制星状细胞 markerα-sma的表达。
[0323]
表26：antimir-221/222腹腔注射mcd饮食小鼠后，小鼠肝脏组织胶原蛋白家族成员和星状 细胞marker分析
[0324][0325]
实施例6：mir-221/222在肝细胞中靶向调控timp3
[0326]
通过mirna靶基因预测(targetscan等)及生物信息学分析，初步锁定调控脂肪性肝炎 的timp3为候选靶基因。timp3是tace(tnf-α转换酶)活性的主要调节器，是炎症，纤 维化，非酒精性脂肪肝和肝癌的重要调节因子。timp3缺失小鼠发生tnf-α活性增加和肝损 伤不良反应引起的肝脏炎症。肝细胞特异性过表达timp3可通过调节adam17活性防止 nafld与肿瘤发生。巨噬细胞特异性过表达timp3可保护小鼠防止胰岛素抵抗，nash和 代谢性炎症的发生。
[0327]
mir-221/222在hepa1-6细胞中直接调控timp3 3’utr的转录水平。在hepa1-6细胞中转 染mir-221/222及timp3 3’utr的荧光素酶报告质粒或timp3 3’utr种子序列突变型的荧光 素酶报告质粒，利用双荧光素酶基因报告系统检测mir-221/222对timp3 3’utr的调控。发 现mir-221/222可以显著抑制timp3 3’utr野生型luciferase活性，对timp3 3’utr1个种子序 列突变型有部分抑制作用，而对timp3 3’utr2个种子序列突变型失去抑制作用(表27)。
[0328]
表27
[0329]
荧光素酶报告系统相对比值ncmir-221/222timp3-wt10.81timp3-mut110.90timp3-mut210.92timp3-mut1+211.08
[0330]
timp3在mcd饮食的mir-221/222lko小鼠肝脏中表达上调。8周对照及 mir-221/222lko小鼠给予6周mcd饮食，分析肝脏中timp3的表达水平，发现 mir-221/222lko小鼠肝脏中timp3的表达水平升高(表28)
[0331]
表28：6周mcd饮食对照及mir-221/222lko小鼠肝脏timp3的mrna和蛋白水平。
[0332] 对照小鼠mir-221/222-lko小鼠timp3相对表达量12.45timp3相对蛋白水平11.54
[0333]
mir-221/222lko小鼠重新腺病毒表达mir-221/222后，肝脏中timp3表达降低。 mir-221/222lko小鼠尾静脉注射腺病毒ad-mir-221/222或者对照ad-gfp，同时给予mcd 饮食。6周后分析肝脏中timp3的表达水平，发现腺病毒ad-mir-221/222注射组小鼠肝脏中 timp3的表达水平下降(表29)
[0334]
表29
[0335][0336]
hepa1-6细胞中转染lna-antimirs导致timp3表达上调。antimir-221/222(100nm)转 染小鼠肝癌细胞系hepa1-6，48小时后收集细胞，检测细胞中mir-221/222的timp3水平(表 30)。
[0337]
表30：hepa1-6细胞中转染nc，lna-i-mir-221和lna-i-mir-222(100nm)，48h后可以有 效的上调mir-221/222靶基因timp3的mrna和蛋白水平
[0338] nclna-i-mir-221lna-i-mir-222timp3相对表达量11.801.61timp3相对蛋白水平12.152.79
[0339]
antimir-221/222可以有效的上调mcd饮食小鼠肝脏的timp3表达水平(表30)。对照小 鼠随机分为4组，每组在1，4，8，15，22天分别给予腹腔注射25mg/kg lna-i-mir-nc， lna-i-mir-221，lna-i-mir-222或12.5mg/kg lna-i-mir-221和12.5mg/kg lna-i-mir-222 (lna-i-mir-221+222)，同时在第1天开始给予mcd饮食。最后一次给予antimir一周后， 收获小鼠，分析小鼠肝脏中timp3的表达水平(表31)。
[0340]
表31：antimir-221/222腹腔注射mcd饮食小鼠后，小鼠肝脏中timp3的表达水平
[0341][0342]
实施例7：实验方法
[0343]
统计分析所有条形图显示平均值
±
std。使用t-test计算显著性(*p《0.05；**p《0.01； ***p《0.001)。纵观实施例，除非另外指明，否则在表中表示统计学显著性：*p《0.05；**p《0.01； ***p《0.001。
[0344]
rna提取采用trizol试剂法(invitrogen)，从小鼠肝脏或hepa1-6细胞提取总rna，按 mirneasy minikit(qiagen)说明书进行。
[0345]
逆转录为cdna：操作按promega说明书进行，逆转录引物序列为u6：random primer， mir-221:5
’‑
gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacgaa accc-3’，
[0346]
mir-222:5
’‑
gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgac acccagt-3’。
[0347]
real-time pcr：根据逆转录引物序列，设计real-time pcr反应的上、
[0348]
下游引物，通过定量实时pcr，使用light cycler 480sybr green master i mi
×
(roche)， 测量mrna表达。转录水平相对于u6，gapdh或36b4归一化。
[0349]
荧光素酶活性的检测：小鼠timp3 3'utr序列以特异性引物进行pcr扩增，用适当的限 制酶插入prl-null空载体。将hepa1-6细胞在24孔板中培养，并且每个孔转染10ngprl-null-3-utr(非编码区)，100ng pgl3-control载体质粒。转染后24小时取细胞，测定荧光 素酶活性。根据制造商的步骤，使用双荧光素酶报告分析系统对这些值进行标准化。
[0350]
所有小鼠模型在spf级环境中繁殖饲养，维持12h光/暗循环，自由获取水和食物。 mir-221/222
flox/flox
小鼠与肝细胞特异性alb-cre小鼠交配，获得的杂合子小鼠 mir-221/222
flox/+-cre交配产生肝细胞特异性基因敲除小鼠mir-221/222
flox/flox-cre， mir-221/222-lko以及同窝对照小鼠。建立两种肝纤维化的小鼠模型，mir-221/222-lko和 对照小鼠喂蛋氨酸胆碱缺乏饮食(mcdd)或对照饮食6周以获得脂肪性肝炎的饮食模型， 第二种模型，mir-221/222-lko和对照小鼠腹腔注射ccl4或空白对照6周(0.5ml/kg，每周 两次)。所有用于实验的老鼠都是雄性的。所有的动物实验都是按照台湾卫生研究院公布的 实验动物的护理和使用指南进行的。
[0351]
腺病毒感染。使用ad5cmvk-npa的载体构建和包装过表达mir-221/222的腺病毒，以 表达绿色荧光蛋白的腺病毒为对照。给予mir-221/222-lko小鼠通过尾静脉注射腺病毒 1
×
10
11
(plaque-forming units/0.2ml pbs)。腺病毒注射未影响小鼠食欲。在腺病毒注射后第5 天处死小鼠。
[0352]
lna-antimirs体内注射：antimirs lna-i-mir-221(序列:cagcagacaatgtagc)是 16个dna/lna碱基的寡核苷酸，lna-i-mir-222(序列:agtagccagatgtagc)是15个 dna/lna碱基的错配寡核苷酸，lna-i-mir-nc(序列:acgtctatacgccca)作为对照。所 有这些寡核苷酸具有硫代修饰的骨干，hplc纯化后na
+
盐交换、冻干。对照小鼠随机分为4 组，每组在1，4，8，15和22天分别给予腹腔注射25mg/kg lna-i-mir-nc，lna-i-mir-221， lna-i-mir-222或12.5mg/kg lna-i-mir-221和12.5mg/kg lna-i-mir-222 (lna-i-mir-221+222)，同时在第1天开始给予mcd饮食。最后一次给予antimir一周后， 收获小鼠。
[0353]
肝组织学和免疫组织化学染色分析。肝脏组织在4％多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋。肝 切片，苏木精-伊红染色、马松染色溶液(饱和苦味酸天狼星红含有0.1％(重量/体积)直接 红80)。天狼星红阳性面积或马松阳性面积是由数字图像定量分析。结果用天狼星红或马松 的阳性面积百分比为表示。对脂滴积累检测，肝切片进行染色，采用油红o(sigma)根据标 准程序。免疫组化染色按标准步骤进行。这些图像是用奥林巴斯显微镜系统采集的。
[0354]
生化分析。血清和肝脏总胆固醇(tc)和甘油三酯(tg)采用市售试剂盒(biovision) 按照制造商的指示测定。血清丙氨酸氨基转移酶(alt)市售试剂盒(biovision)按照制造 商的指示测定。血糖测量使用血糖仪测定尾静脉血液。
[0355]
羟脯氨酸含量测定。用羟脯氨酸测定试剂盒(sigma)对胶原蛋白特异性氨基酸羟脯氨酸 进行比色测定。羟脯氨酸含量表示为ng羟脯氨酸每mg肝。
[0356]
超微结构分析。透射电子显微镜(tem)分析，新鲜肝脏样品(1立方毫米的体积)固 定于2.5％戊二醛、甲醛。随后，标本用2％四氧化锇固定1h。固定之后，组织通过一系列梯 度醇和环氧丙烷脱水，环氧树脂812包埋，获得超薄切片的切片。用亚甲蓝染色在硼酸钠， 醋酸双氧铀和柠檬酸铅分色，用optonem900透射电子显微镜拍照(zeiss)。
[0357]
细胞培养、感染和转染：将hepa1-6细胞在含10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素的dmem 培养基中培养，置于37℃，5％的co2潮湿的空气培养箱中。通过脂质体2000转染细胞。