一种具有美白功效的组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及护肤品技术领域，确切地说是一种具有美白功效的组合物及其制备方法。


背景技术：

2.人会受到各种内外因素的影响(例如身体劳累、心理压力大、内分泌失调、环境污染等)，导致皮肤出现暗沉、色素沉着等现象，因此美白是皮肤护理最重要的主题之一。女性对于美白的追求就像人类对于光明的追求一样从未停止，美白也是一个由内而外的护理工程，要想美白，首先要选择一套适合自己的美白产品。
3.现有的化妆品美白效果较差，并不能有效的改善肤色，因此，开发出一种具有显著皮肤美白功效的产品是很有意义的。所以，目前，在化妆品产品中采用的美白添加剂机制较为单一，局限性大，不利于广泛的推广和普及。为了研发出功效更突出的美白化妆品，则需要多种机制的综合运用来更好的达到美白肌肤的目的。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种充分补给细胞营养物质、淡化黑色素的具有美白功效的组合物。
5.上述目的通过以下方案实现：
6.一种具有美白功效的组合物，其特征在于，其是由下述重量百分比的原料制得：芝麻籽油1-3％，水解大豆蛋白0.4-0.6％，鲸蜡硬脂醇0.8-1.2％，酵母菌溶胞物提取物10-12％，干细胞外泌体9-15％，石斛提取物9-11％，三乙醇胺0.4-0.8％、葡萄糖酸钠0.4-0.7％、金属硫蛋白9-11ppm，氯化锌19-21mm，余量为水。
7.所述的具有美白功效的组合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
8.(1)在石斛提取物中加入适量水，加热至30-45℃搅拌5-10min后，得石斛提取物水溶液；
9.(2)在石斛提取物水溶液中加入三乙醇胺、氯化锌、葡萄糖酸钠，离心，去上清液后，干燥，得到石斛络合物料备用；
10.(3)芝麻籽油、水解大豆蛋白、鲸蜡硬脂醇、适量水投入搅拌锅中，加热至70-80℃，再加入酵母菌溶胞物提取物、干细胞外泌体，均质机均质3-5min；
11.(4)在步骤(3)均质后的物料中加入石斛络合物料以及其余原料，于30-45℃搅拌均匀，冷却，出料，即得。
12.所述的具有美白功效的组合物的制备方法，其特征在于：
13.步骤(1)在石斛提取物加入相当于其重量1-2倍的水，
14.所述的具有美白功效的组合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)离心的速度为5000r/min，离心时间为10-30min。
15.所述的具有美白功效的组合物的制备方法，其特征在于：
16.均质的速度为1200-18000r/min。
17.本发明的有益效果为：
18.(1)本发明提供的一种具有美白功效的组合物，与其他的产品相比，本发明通过干细胞外泌体能帮助促进胶原蛋白生长能力，修复老化断裂的胶原弹性纤维纳米级的磷脂囊泡中包裹着数百种蛋白质，微小rna等活性分子，通过激活皮肤内源性细胞，改善皮肤色素沉淀、黯淡无光等衰老问题；芝麻籽油有保湿、滋润的作用；水解大豆蛋白具有极强的保湿作用，有助于诱导肌肤产生透明质酸，俗称玻尿酸，是理想的天然保湿因子，女性体内促进肌肤组织新陈代谢和维修功能的自然成分；鲸蜡硬脂醇对皮肤起锁水保湿的作用；酵母菌溶胞物提取物它能够改善肌肤5大问题：黯淡无光、色素沉积、粗糙干燥、水油不均、松弛细纹，具有充分补给细胞营养物质、淡化黑色素、美白肤色、舒缓肌肤、促进修复能力、抗氧化、促进胶原蛋白合成的作用；金属硫蛋白能抗紫外线、清除色素。
19.(2)本发明提供的制备方法，制备效率高，安全稳定，具有广阔的应用前景。
20.(3)本发明利用石斛提取物水溶液中加入三乙醇胺、氯化锌、葡萄糖酸钠，将石斛提取物与复配物料络合，更容易使得营养成分被肌肤吸收，取得了比不进行复配络合反应更好的美白效果。
具体实施方式
21.实施例1、
22.一种具有美白功效的护肤组合物，其是由下述重量百分比的原料制得：水余量，芝麻籽油2％，水解大豆蛋白0.5％，鲸蜡硬脂醇1％，酵母菌溶胞物提取物11％，干细胞外泌体9％，石斛提取物10％，三乙醇胺0.4％、葡萄糖酸钠0.6％、10ppm金属硫蛋白，20mm氯化锌。
23.所述的具有美白功效的组合物的制备方法，包括以下步骤：
24.(1)在石斛提取物中加入相当于其重量1倍的水，加热至4℃搅拌10min后，得石斛提取物水溶液；
25.(2)在石斛提取物水溶液中加入三乙醇胺、氯化锌、葡萄糖酸钠，5000r/min离心10min，去上清液后，干燥，得到石斛络合物料备用；
26.(3)芝麻籽油、水解大豆蛋白、鲸蜡硬脂醇、适量水投入搅拌锅中，加热至80℃，再加入酵母菌溶胞物提取物、干细胞外泌体，均质机中18000r/min均质5min；
27.(4)在步骤(3)均质后的物料中加入石斛络合物料以及其余原料，于35℃搅拌均匀，冷却，出料，即得。
28.实施例2、
29.一种具有美白功效的护肤组合物，其是由下述重量百分比的原料制得：水余量，芝麻籽油2％，水解大豆蛋白0.5％，鲸蜡硬脂醇1％，酵母菌溶胞物提取物11％，干细胞外泌体10％，石斛提取物11％，三乙醇胺0.5％、葡萄糖酸钠0.6％、10ppm金属硫蛋白，20mm氯化锌。
30.所述的具有美白功效的组合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
31.(1)在石斛提取物中加入相当于其重量1倍的水，加热至4℃搅拌10min后，得石斛提取物水溶液；
32.(2)在石斛提取物水溶液中加入三乙醇胺、氯化锌、葡萄糖酸钠，5000r/min离心10min，去上清液后，干燥，得到石斛络合物料备用；
33.(3)芝麻籽油、水解大豆蛋白、鲸蜡硬脂醇、适量水投入搅拌锅中，加热至80℃，再加入酵母菌溶胞物提取物、干细胞外泌体，均质机中18000r/min均质5min；
34.(4)在步骤(3)均质后的物料中加入石斛络合物料以及其余原料，于35℃搅拌均匀，冷却，出料，即得。
35.实施例3、
36.一种具有美白功效的组合物，其是由下述重量百分比的原料制得：芝麻籽油2％，水解大豆蛋白0.4％，鲸蜡硬脂醇1.2％，酵母菌溶胞物提取物10％，干细胞外泌体11％，石斛提取物11％，三乙醇胺0.4％、葡萄糖酸钠0.7％、金属硫蛋白11ppm，氯化锌19mm，余量为水。
37.所述的具有美白功效的组合物的制备方法，包括以下步骤：
38.(1)在石斛提取物中加入相当于其重量1倍的水，加热至4℃搅拌10min后，得石斛提取物水溶液；
39.(2)在石斛提取物水溶液中加入三乙醇胺、氯化锌、葡萄糖酸钠，5000r/min离心10min，去上清液后，干燥，得到石斛络合物料备用；
40.(3)芝麻籽油、水解大豆蛋白、鲸蜡硬脂醇、适量水投入搅拌锅中，加热至80℃，再加入酵母菌溶胞物提取物、干细胞外泌体，均质机中18000r/min均质5min；
41.(4)在步骤(3)均质后的物料中加入石斛络合物料以及其余原料，于35℃搅拌均匀，冷却，出料，即得。
42.实施例4、
43.一种具有美白功效的组合物，其特征在于，其是由下述重量百分比的原料制得：芝麻籽油2％，水解大豆蛋白0.6％，鲸蜡硬脂醇1.2％，酵母菌溶胞物提取物12％，干细胞外泌体12％，石斛提取物11％，三乙醇胺0.7％、葡萄糖酸钠0.5％、金属硫蛋白11ppm，氯化锌20mm，余量为水。
44.所述的具有美白功效的组合物的制备方法，包括以下步骤：
45.(1)在石斛提取物中加入相当于其重量1倍的水，加热至4℃搅拌10min后，得石斛提取物水溶液；
46.(2)在石斛提取物水溶液中加入三乙醇胺、氯化锌、葡萄糖酸钠，5000r/min离心10min，去上清液后，干燥，得到石斛络合物料备用；
47.(3)芝麻籽油、水解大豆蛋白、鲸蜡硬脂醇、适量水投入搅拌锅中，加热至80℃，再加入酵母菌溶胞物提取物、干细胞外泌体，均质机中18000r/min均质5min；
48.(4)在步骤(3)均质后的物料中加入石斛络合物料以及其余原料，于35℃搅拌均匀，冷却，出料，即得。
49.1.促细胞增殖活性检验
50.试剂配制
51.完全培养液 量取小牛血清100ml，加培养液定容至1000ml。
52.维持培养液 量取小牛血清4ml，加培养液定容至1000ml。
53.消化液：称取乙二胺四乙酸二钠0.2g、氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.152g、磷酸二氢钾0.2g、胰蛋白酶2.5g，加纯化水溶解并定容至1000ml，过滤除菌。
54.噻唑蓝(mtt)溶液：称取mtt粉末0.10g，加pbs 20ml使溶解，经0.22μm滤膜过滤除
菌。4℃避光保存。
55.pbs：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加纯化水溶解并定容至1000ml，经121℃15分钟灭菌。
56.细胞株：balb/c 3t3细胞。
57.rhegf国家标准品：6800iu/支，冻干粉；
58.试验操作
59.标准品制备：取50μl标准品于450μl完全培养液中进行10倍稀释，重复操作直至稀释100倍。取735μl 100倍稀释标准品于265μl完全培养液中进行1.36倍稀释。取136倍稀释液在96孔细胞培养板中，从1︰4开始依次做4倍递增梯度稀释(具体操作步骤为首先于96孔细胞培养板中加入150μl完全培养液，取50μl 1000倍稀释的供试品溶液加入96孔板中第1列，吹打稀释。充分稀释后于第1列孔中抽取50μl于第2列孔，吹打稀释。充分稀释后于第2列孔中抽取50μl于第3列孔，吹打稀释。重复上述操作，直至第10列)，共做10个稀释度(1～10孔)，每个稀释度同时设置一个复孔。
60.重组人表皮生长因子供试品制备：取100μl供试品于900μl完全培养液中进行10倍稀释，重复操作直至稀释1000倍。取1000倍稀释液在96孔细胞培养板中，从1︰4开始依次做4倍递增梯度稀释(具体操作步骤为首先于96孔细胞培养板中加入150μl完全培养液，取50μl 1000倍稀释的供试品溶液加入96孔板中第1列，吹打稀释。充分稀释后于第1列孔中抽取50μl于第2列孔，吹打稀释。充分稀释后于第2列孔中抽取50μl于第3列孔，吹打稀释。重复上述操作，直至第10列)，共做10个稀释度(1～10孔)，每个稀释度同时设置一个复孔。
61.注：样品预稀释倍数根据其活性值进行调整。
62.测定方法
63.①
balb/c 3t3细胞株用完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0
×
10
5-5.0
×
105个细胞，传代后24～36小时用于生物学活性测定。
64.②
弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞用完全培养液配成每1ml含5.0
×
104～8.0
×
104个细胞的细胞悬液，接种于96孔板中，接种过程中不停摇匀，保持每孔接种数相同，每孔100μl,于37℃、5％二氧化碳条件下培养。
65.③
24小时后换成维持培养液。置37℃、5％二氧化碳培养24小时。
66.④
制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100μl。置37℃、5％二氧化碳培养64～72小时。
67.⑤
mtt比色法：每孔加入mtt溶液20μl,于37℃、5％二氧化碳培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入dmso 100μl,混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，570nm为试验波长测定吸光度，记录测定结果。
68.数据处理
69.将各个样品及标准品的od值数据进行四参数拟合。
70.结果计算
71.试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。
72.供试品工作效价计算公式u＝预稀释倍数*4c(c为四参数方程中c值)
73.供试品校正效价并按下式计算结果：
74.校正效价(iu/ml)＝pr*ds*es/dr*er
75.式中pr为标准品生物学活性，iu/ml；
76.ds为试供品预稀释倍数；
77.es为试供品相当于标准品半效数的稀释倍数；
78.dr为标准品预稀释倍数；
79.er为标准品半效量的稀释倍数；
[0080][0081]
本次实验结果表明本发明所涉及的组合物具有促细胞增长活性。
[0082]
2.羟自由基清除活性检验
[0083]
实验原理：检测原理是h2o2/fe2+通过fenton反应产生羟自由基，将fe2+氧化为fe3+，产生的亚磺酸与偶氮染料反应生成偶氮岚，以酶标仪测定420nm处吸光度，在一定范围内颜色深浅与产生的羟自由基成正比，通过分析捕获产生的羟自由基可计算出自由基清除率或清除能力。
[0084]
实验材料：北京雷根，货号to1131，规格100t。
[0085]
试剂a：oh lysis buffer，2
×
250ml，室温保存。
[0086]
试剂b：oh assay buffer，50ml，室温避光保存。
[0087]
试剂c：h2o2基液，1ml，室温保存。
[0088]
试剂d：oh显色液，100ml，4℃避光保存。
[0089]
试剂e：fenton基液，50ml，室温避光保存。
[0090]
试剂f：oh萃取液，200ml，室温保存。
[0091]
操作步骤
[0092]
样品处理
[0093]
a、准备样品:
[0094]
①
植物样品:取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净,擦干,切碎,迅速称取,按1.5g样品:4.5ml oh lysis buffer的比例，加入oh lysis buffer后匀浆或研磨,室温静置4h,3000g离心30min，上清液即为羟自由基粗提液,4"c保存备用。
[0095]
②
血浆、血清和尿液样品:血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，4℃保存，用于羟自由基(:oh)的检测。
[0096]
③
高活性样品:如果样品中含有较高浓度的羟自由基(:oh)，可以使用oh lysis buffer进行恰当的稀释。
[0097]
b、配制oh assay buffer工作液
[0098]
取适量的oh assay buffer和h2o2基液按oh assay buffer:h2o2基液＝10ml:15μl的比例混合,即为oh assay buffer工作液,4℃避光保存1周有效。
[0099]
c、配制oh萃取洗涤液
[0100]
取适量的蒸馏水和oh萃取液，按蒸馏水:oh萃取液＝23:1的比例混合，即为oh萃取洗涤液。
[0101]
d、oh加样
[0102]
按照下表设置对照管、测定管，溶液应按照顺序依次加入,并注意避免产生气泡。如果样品中的羟自由基(oh)浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。
[0103]
测定操作
[0104]
oh加样试剂顺序
[0105][0106]
oh测定
[0107]
加入1.6ml oh萃取液，轻轻混匀，静置分层，丢弃下层相,取上层有机相。加入新配制的2.4ml oh萃取洗涤液，静置分层，上层液即为羟自由基待测液。取96孔板,将对照管、测定管的溶液加入至96孔板中，以蒸馏水调零,酶标仪测定对照孔、测定孔420nm处吸光度(a
对照
、a
测定
)。
[0108]
计算
[0109]
组织样品oh清除率(％)＝(a
对照-a
测定
)/a对照x100％
[0110]
式中:a
对照
＝对照管的吸光度
[0111]a测定
＝测定管的吸光度
[0112]
注意事项
[0113]
1、实验材料应尽量新鲜,如取材后不能立即检测，应存于4℃。
[0114]
2、在萃取过程中混匀即可,不要剧烈振荡,以免发生乳化。如果出现轻微乳化,可通过离心去除。
[0115]
3、测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。。
[0116]
4、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定,但应考虑分光光度计的最小检测体积。
[0117]
5、如果加入oh萃取液萃取时，效果不佳，可按oh萃取液:甲苯＝3:1的比例配制新的oh萃取液,以此萃取液进行萃取。
[0118]
6、fenton基液和oh萃取液有一定的腐蚀性和气味,请在通风橱中小心操作。
[0119]
7、前期实验结果表明重组人金属硫蛋白发挥羟自由基清除活性的浓度范围为0.5～10μg/ml，羟自由基清除活性最高时的浓度约为1.0μg/ml。
[0120]
实验结果
[0121]
样品配方实施例1实施例2实施例3实施例3对照管od值1.2391.4071.3381.3381.213清除率2.1％16.0％10.3％11.0％/
[0122]
本次实验结果表明本发明所涉及的组合物具有羟自由基清除活性。
[0123]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明具有皮肤美白作用的组合物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等任何改进，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0124]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0125]
3.化妆品美白功效测定
[0126]
实验目的：本试验是在细胞水平研究本公司生产的化妆品原料在美白方面的功效，通过对胞内酪氨酸酶活力的抑制试验，检测本公司产品的美白效果。
[0127]
实验原理：酪氨酸酶是黑色素合成途径中的限速酶，它主要通过影响酪氨酸转化成多巴，以及多巴氧化为多巴醌来影响黑色素的生成。一些美白剂如曲酸及其衍生物和熊果苷等，通过抑制酪氨酸酶的活性来抑制黑色素的生成。研究表明，在体外对酪氨酸酶有良好抑制作用的添加剂，并不一定能抑制细胞内的酪氨酸酶。因此，使用黑色素细胞检测美白添加剂对细胞内酪氨酸酶活性的抑制效果已越来越引起人们的重视。
[0128]
试验材料
[0129]
细胞株：b16f10小鼠皮肤黑色素瘤细胞；
[0130]
tritonx-100、l-dopa(左旋多巴)
[0131]
其他材料与设备：胎牛血清和dmem培养基；
[0132]
96孔细胞培养板；200μl、1ml无菌枪头；青霉素-链霉素溶液；
[0133]
200μl、1ml移液器；mtt粉剂、dmso等。
[0134]
多功能酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、二氧化碳培养箱、恒温培养箱、冰箱等。
[0135]
试验方法
[0136]
1、细胞培养
[0137]
b16f10细胞购于中科院细胞库，用dmem高糖培养基(含体积分数为10％的胎牛血清，含体积分数为1％的青-链霉素溶液)在37℃，5％co2饱和湿度环境进行培养，当细胞生长至近融合状态时可进行细胞传代，一般培养3d后可用0.25％的胰蛋白酶传代一次。当细胞生长至对数期，用pbs清洗后，用0.25％胰蛋白酶消化，制备成细胞悬液，经过细胞计数板计数后，用培养基将细胞调整至适当浓度，接种于细胞板放入培养箱培养，每一次实验应采用同一传代细胞。
[0138]
2、胞内酪氨酸酶活力的测定
[0139]
将b16f10黑色素细胞以8
×
104个/ml的密度接种于96孔板中，24h后细胞贴壁，添加10μl不同浓度待测样品，每一浓度设置4个复孔，同时设置阳性对照组，阴性对照组用dmem液体培养基代替样品溶液。37℃、5％co2培养箱中培养48h后，弃上层清液。用ph7.4 pbs冲洗2次，每孔添加50μl含1％tritonx-100的pbs溶液，迅速置于-80℃冻存30min，随后室温融化使细胞完全破裂，37℃预温5min后，加入质量分数为1％的l-dopa溶液10μl，37℃反应2h，在酶标仪490nm处测其吸光度。
[0140]
按以下公式计算酪氨酸酶活性抑制率:
[0141]
酪氨酸酶抑制率＝1-(试验组平均吸光度-空白组平均吸光度)/(阴性对照组平均吸光度-空白组平均吸光度)
×
100％
[0142]
实验结果
[0143][0144]
本次实验结果表明本发明所涉及的组合物具有对细胞中酪氨酸酶活性的抑制作用，从而使最终黑色素合成量大大减少。