Perifosine在制备抗汉滩病毒药物中的应用

perifosine在制备抗汉滩病毒药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种化合物的药物应用，具体涉及perifosine在制备抗汉滩病毒药物中的应用。


背景技术：

2.汉滩病毒(hantaan virus,htnv)属于布尼亚病毒目汉坦病毒科正汉坦病毒属，是一种单股负链rna病毒，其基因组根据大小可分为l、m、s三个片段，分别编码病毒的rna依赖的rna聚合酶(rdrp或l蛋白)、包膜糖蛋白gn和gc以及病毒的核衣壳蛋白np。1976年，韩国学者李镐汪于该国疫区汉滩河流域黑线姬鼠的肺组织中首次成功分离该病毒。目前对htnv的复制机制尚不清楚。
3.汉滩病毒是引起我国肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,hfrs)的主要病原体，hfrs是经鼠类等传播的一种急性病毒性传染病，该病毒传染性强，主要的传播途径有通过吸入污染的气溶胶或与啮齿动物的排泄物接触等传播给人类。我国是世界上受肾综合征出血热危害最严重的国家，该病在我国具有发病人数多、流行范围广、死亡率高的特点，对公众健康危害极大。根据2019年国家统计局公布数据，我国的hfrs病例多达9596例、发病率达0.69/10万，考虑到气候变化和个人免疫力等因素，重症hfrs的死亡率可高达15％。如何有效应对汉滩病毒所导致的高致死率和高传染性疾病是目前公共健康急需解决的重大科学问题。此外，尽管针对汉滩病毒感染已经进行了许多研究工作，但尚无特异性治疗药物，目前临床上主要的治疗手段仍以支持治疗为主，因此研发高效低毒的抗汉滩病毒药物具有极其重要的临床意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供perifosine在制备抗汉滩病毒药物中的应用，能够有效抑制汉滩病毒的复制和增殖，为肾综合征出血热的治疗提供药物基础。
5.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
6.perifosine在制备抗汉滩病毒药物中的应用。
7.所述perifosine的结构为：
[0008][0009]
所述perifosine在制备抑制汉滩病毒复制药物中的应用。
[0010]
所述所述perifosine在制备抑制汉滩病毒增殖药物中的应用。
[0011]
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0012]
本发明证实了perifosine可有效抑制汉滩病毒的复制，降低感染细胞的病毒载量，抑制病毒的增殖；此外，该化合物在发挥抗病毒作用的浓度下对细胞活力影响较小，可以作为一种高效低毒的抗汉滩病毒药物。
附图说明
[0013]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他实施例的附图。
[0014]
图1为加入perifosine的htnv感染细胞htnv
‑
np蛋白western blot检测结果；
[0015]
图2为加入perifosine的htnv感染细胞htnv
‑
np免疫荧光检测结果；
[0016]
图3为加入perifosine的htnv感染细胞病毒核酸水平检测结果；
[0017]
图4为加入不同浓度的perifosine a549细胞活力水平检测结果。
具体实施方式
[0018]
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
[0019]
本发明涉及了一种化合物的药物应用，该化合物为perifosine(krx
‑
0401，哌立福辛)，结构为：
[0020][0021]
本发明涉及了该化合物在制备抗汉滩病毒药物中的应用，经实验证明，该化合物能有效抑制汉滩病毒的复制和增殖，可以用于制备治疗肾综合征出血热的药物。
[0022]
以下为分析perifosine作为抗汉滩病毒药物效果的具体实验过程和相关数据分析：
[0023]
一、抑制htnv的激酶抑制剂筛选：
[0024]
(一)筛选
[0025]
将a549细胞消化后接种在96孔板中，每孔1
×
104个细胞，在5％co2、37℃培养箱中培养过夜，待细胞密度达到60％时进行病毒感染与化合物处理。化合物以工作浓度为10μm加入到病毒稀释液中，病毒感染复数(multiplicity of infection,moi)为1，两者同时作用于细胞，处理4h后去除上清，加入含有2％fbs的dmem培养液继续培养，每个化合物设置三个复孔。在感染后96小时(96hours post
‑
infection,96hpi)时进行免疫荧光实验，检测htnv核衣壳np抗原以确定病毒量。经筛选得到抑制htnv释放效果最佳的1个：perifosine(krx
‑
0401)。
[0026]
二、perifosine(krx
‑
0401)细胞水平抑制htnv释放的鉴定
[0027]
(一)western blot检测
[0028]
将a549细胞消化后传代至6孔板细胞培养板，待细胞密度达到60％时按moi＝1感染htnv，同时按不同化合物浓度加入细胞培养上清，混合均匀后置37
°
c条件下5％co2细胞培养箱中培养，4h后换液为2％fbs的dmem培养液继续培养4d后收集细胞。将获得的细胞样品加入上样缓冲液western blot sample buffer，煮沸7min，待冷却后以12％sds
‑
page,
160v电泳50min，随后以100v恒压电转至pvdf膜上。pvdf膜以5％牛血清白蛋白封闭液bsa室温封闭1h后加入htnv
‑
np特异性单克隆抗体，4℃孵育过夜。tbst缓冲液将多余抗体洗去，再加入红外标记的抗小鼠二抗，室温孵育2h，tbst洗去未结合的二抗，使用奥德赛红外成像仪扫描并分析结果。结果如图1所示的阳性对照结果，加入perifosine(krx
‑
0401)后细胞内病毒载量明显减少。
[0029]
(二)免疫荧光检测
[0030]
将a549细胞消化后传代至96孔板细胞培养板，待细胞密度达到60％时按moi＝1感染htnv，同时按不同化合物浓度加入细胞培养上清，混合均匀后置37
°
c条件下5％co2细胞培养箱中培养，4h后换液为2％fbs的dmem培养液继续培养4d后收集细胞。将细胞用4％多聚甲醛固定后，以triton x
‑
100穿透，随后以bsa封闭。处理后的细胞加入np特异性的单克隆抗体，37℃孵育1h。pbs洗涤掉多余的抗体，加入cy3标记的抗小鼠荧光二抗，37℃孵育1h，pbs洗涤掉未结合的二抗。以dapi溶液染色细胞核后，荧光显微镜下观察红色荧光的分布和强度。结果如图2所示，加入perifosine(krx
‑
0401)后，细胞内的荧光面积明显降低，表明病毒复制得到显著抑制。
[0031]
(三)qrt
‑
pcr检测
[0032]
将a549细胞消化后传代至6孔板细胞培养板，待细胞密度达到60％时按moi＝1感染htnv，同时按不同化合物浓度加入细胞培养上清，混合均匀后置37
°
c条件下5％co2细胞培养箱中培养，4h后换液为2％fbs的dmem培养液继续培养4d后收集细胞，提取总rna，并取2000ng总rna反转录为cdna。以sybr green为荧光染料，htnv s片段为目标，β
‑
actin为内参进行qrt
‑
pcr。结果如图3所示，图3中，与htnv感染的为阳性对照组相比较，经由化合物处理的感染细胞内htnv的核酸水平明显较低。
[0033]
(四)细胞毒性检测
[0034]
利用cck
‑
8的方法检测小分子抑制剂perifosine(krx
‑
0401)对a549的细胞毒性。为了确定化合物的cc50数值，将梯度浓度(100μm、50μm、25μm、10μm、5μm、2.5μm和1μm)的化合物作用于接种在96孔板中的a549细胞，在处理48h后加入cck
‑
8溶液，将培养板在37℃培养箱中孵育1
‑
2h，使用酶标仪测量450nm处的吸光度。通过计算细胞存活率，得到perifosine(krx
‑
0401)的半数细胞毒性浓度(cc50)为105.90
±
1.20μm。
[0035]
通过上述内容可知，本发明通过蛋白水平和核酸水平证实了perifosine(krx
‑
0401)可以显著抑制汉滩病毒的复制，降低感染细胞的病毒载量；此外，化合物在发挥抗病毒作用的浓度下对细胞活力影响较小，这为接下来研制抗汉滩病毒药物提供了先导化合物。
[0036]
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。