一种上转换纳米诊疗一体化平台探针及其制备方法

1.本发明涉及新型生物医学技术领域，尤其涉及一种上转换纳米诊疗一体化平台探针及其制备方法。


背景技术：

2.乳腺癌（breast cancer, bc）是发生在乳腺终末导管小叶单元上皮组织的恶性肿瘤，是一种复杂的异质性疾病，根据免疫组织学特征可分为雌激素受体阳性（er+），孕激素受体阳性（pr+），人表皮生长因子受体2阳性（her2+）和三阴性乳腺癌（tnbc）。近年来，尽管在预防、诊断和治疗乳腺癌方面取得了大量进展，并因此改善了总生存率，但进展期乳腺癌仍是一种不可治愈的疾病，在新发乳腺癌患者中，6%~7%的患者初次诊断即为进展期乳腺癌，而最初诊断为早期乳腺癌的患者在接受治疗后，其中30%的患者最终会出现复发转移。目前乳腺癌治疗的主要手段包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗和分子靶向治疗等，其中分子靶向治疗已经成为乳腺癌治疗领域研究的热点，最有代表的药物为赫赛汀（曲妥珠单抗），其应用于her2阳性患者有效率可以达到30%，已成为her2阳性乳腺癌患者的一线治疗。
3.诊疗一体化是一种将疾病的诊断和治疗有机结合的新型生物医学技术，对于某种癌症，通常的方法是先鉴定并筛选出在这种癌细胞表面特异性表达的生物标记物，然后将其同源结合载体加载到探针/载体上，以实现肿瘤识别和肿瘤归巢。随着纳米技术的不断进步，将新型的纳米颗粒诊疗一体化平台应用到乳腺癌的诊断、治疗，搭载乳腺癌特异性靶向分子的纳米颗粒对乳腺癌的诊治显示出巨大前景。上转换纳米颗粒以其独特的荧光强、发光稳定、组织穿透性好、化学稳定性好、生物兼容性好、无自体荧光背景干扰等优点。在肿瘤的多模式成像、靶向治疗及肿瘤的诊疗一体化等方面解决了许多瓶颈性的问题。
4.目前尚未存在上转换纳米颗粒结合her2的相关研究。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种主动靶向的上转换纳米诊疗一体化平台探针及其制备方法，用于实现上转换纳米材料优异性能与her2靶向药物的结合，填补相关研究的空白。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种上转换纳米诊疗一体化平台探针，所述上转换纳米诊疗一体化平台探针包含nps耦联her2靶向药物的结构。
7.优选的，所述her2靶向药物为赫赛汀。
8.优选的，所述nps为水溶性nps。
9.本发明还提供了上转换纳米诊疗一体化平台探针的制备方法，包含如下步骤：将nps与her2靶向药物耦联，得到上转换纳米诊疗一体化平台探针。
10.优选的，所述耦联为将nps与tcep预处理后的her2靶向药物混合，所述耦联的温度为22~28℃，所述耦联的时间为20~40min，所述耦联的过程中伴随震荡，所述震荡的转速为600~1000rpm。
11.优选的，tcep预处理her2靶向药物的过程如下：将her2靶向药物、pbs和tcep混合反应20~40min后过滤；所述混合反应的温度为22~28℃，所述混合反应的过程中伴随震荡，所述震荡的转速为600~1000rpm；所述her2靶向药物、pbs和tcep的质量体积比为1~2 g:8~10 l:8~12 l。
12.优选的，所述nps为水溶性nps，所述的水溶性nps由油溶性nps经peg修饰得到；所述油溶性nps为nagdf4:yb,tm@naluf4纳米晶体。
13.优选的，所述peg修饰包含如下步骤：s1、将油溶性nps与丙酮混合离心，得到第一沉淀物，用四氢呋喃将所得第一沉淀物溶解获得溶解液，将所述溶解液与peg的四氢呋喃溶液混合，30~50℃反应20~28h，冷却得到混合溶液；s2、将所得混合溶液与环己烷混合，得到第二沉淀物，将所述第二沉淀物顺次进行干燥、溶解、过滤，得到水溶性nps。
14.优选的，所述步骤s1中油溶性nps与丙酮的体积比为1:2~5；所述油溶性nps与peg质量比为1:8~12；所述步骤s2中干燥为真空干燥，所述干燥的时间为2~6h；所述溶解所用溶剂为水；所述过滤采用超滤，所述超滤的截留分子量为80~120kda。
15.优选的，所述油溶性nps的制备方法包含如下步骤：ⅰ、将氢氧化钠溶液、无水乙醇和油酸混合搅拌5~15min，然后加入镧系金属盐溶液和氟化钠溶液混合搅拌0.5~1.5h，得到第一混合物；ⅱ、将所述第一混合物与乙醇混合后离心，得到沉淀物，用环己烷将所得沉淀物溶解，得到第一纳米簇前驱物环己烷溶液；ⅲ、将氢氧化钠溶液、无水乙醇和油酸混合搅拌5~15min，然后加入镥盐溶液和氟化钠溶液混合搅拌0.5~1.5h，得到第二混合物；iv、将所述第二混合物与乙醇混合后离心，得到沉淀物，用环己烷将所得沉淀物溶解，得到第二纳米簇前驱物环己烷溶液；v、将十八烯、油酸和第一纳米簇前驱物环己烷溶液混合，通入氮气，在60~80℃搅拌20~40min，然后升温至260~300℃，反应0.5~1.5h后冷却得到纳米晶体中间物溶液；vi、将所述纳米晶体中间物溶液和十八烯、油酸、第二纳米簇前驱物环己烷溶液混合，通入氮气，在60~80℃搅拌20~40min，然后升温至260~300℃，反应0.5~1.5h后冷却得到油溶性nps；所述镧系金属盐溶液为多组分镧系盐溶液，所述多组分镧系盐溶液中包含gd、yb和tm，gd、yb和tm的摩尔比为70~90:15~20:1~3；所述步骤ⅰ中氢氧化钠溶液、无水乙醇、油酸、镧系金属盐溶液和氟化钠溶液的体积比为3~5:7~10:18~22:1~2:2~6；所述氢氧化钠溶液浓度为200~400g/l；所述镧系金属盐溶液浓度为0.2~0.8mol/l；所述镥盐溶液浓度为0.2~0.8mol/l；
所述氟化钠溶液浓度为0.2~0.8mol/l；所述步骤ⅱ中第一混合物与乙醇的体积比为1:2~4；所述步骤iv中第二混合物与乙醇的体积比为1:2~4；所述步骤ⅱ中离心的转速为8000~15000rpm，时间为5~15min；所述步骤iv中离心的转速为8000~15000rpm，时间为5~15min；所述步骤v和步骤vi中升温的速度独立地为5~15℃/min。
16.本发明的技术效果和优点：本发明中的上转换纳米诊疗一体化平台探针能够结合上转换纳米材料的优异性能以及赫赛汀针对her2靶点的特殊性质，具有her2活性，稳定性较强，生物安全性较高，制备方法简单易行，具有良好的上转换发光性能，同时还具有主动靶向功能，有望进一步用于诊疗一体化探针的临床前开发应用，为her2高表达的乳腺癌提供一种新的诊疗策略。
附图说明
17.图1为np
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mab电镜图；图2为np
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mab粒径统计图；图3为np
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mab水合粒径图；图4为np
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mab荧光光谱图；图5为np
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mab溶于纯水后的水合粒径变化；图6为np
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mab溶于10%fbs后的水合粒径变化；图7为np
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mab对qsg7701细胞和skbr3细胞的毒性结果；图8为水溶性np
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mab特异性结合实验一结果；图9为水溶性np
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mab特异性结合实验二结果；图10为尾静脉注射np
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mab后24小时各个脏器体外上转换成像；图11为尾静脉注射np
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mab后24小时各个脏器上转换信号定量值。
具体实施方式
18.本发明提供了一种上转换纳米诊疗一体化平台探针，包含nps耦联her2靶向药物的结构。在本发明中，所述her2靶向药物优选为赫赛汀；所述nps优选为水溶性nps。
19.本发明还提供了上转换纳米诊疗一体化平台探针的制备方法，包含如下步骤：将nps与her2靶向药物耦联，得到上转换纳米诊疗一体化平台探针。
20.在本发明中，所述耦联优选为将nps与tcep预处理后的her2靶向药物混合，所述耦联的温度优选为22~28℃，进一步优选为24~26℃；所述耦联的时间优选为20~40min，进一步优选为25~35min，还优选为28~32min；本发明所述耦联的过程中优选伴随震荡，所述震荡的转速优选为600~1000rpm，进一步优选为700~900rpm，还优选为800~850rpm。本发明在所述耦联结束后还优选进行超滤，所述超滤的截留分子量优选为80~120kda，进一步优选为90~110kda，所述超滤的次数优选为2~5次；所述超滤采用纯水进行。本发明在所述超滤后，优选的将所述上转换纳米诊疗一体化平台探针置于0~5℃保存。
21.本发明中，所述tcep预处理her2靶向药物的过程优选为将her2靶向药物、pbs和tcep混合反应20~40min后过滤。在本发明中，所述her2靶向药物、pbs和tcep的质量体积比
优选为1~2 g:8~10 l:8~12 l，进一步优选为1.3~1.8 g:8.5~9.5 l:9~10 l；本发明所述tcep的浓度优选为10~15g/l，进一步优选为11~14g/l，还优选为12~13g/l；本发明所述混合反应的时间为20~40min，优选为25~35min，进一步优选为28~32min；所述混合反应的温度为22~28℃，所述混合反应的过程中优选伴随震荡，所述震荡的转速优选为600~1000rpm，进一步优选为700~900rpm，还优选为800~850rpm；在本发明中，所述混合反应完成后优选的还包括用tbs超滤。
22.在本发明中，所述nps优选为水溶性nps，所述水溶性nps优选由油溶性nps经peg修饰得到，所述油溶性nps优选为nagdf4:yb,tm@naluf4纳米晶体。
23.在本发明中，所述peg修饰优选包含如下步骤：s1、将油溶性nps与丙酮混合离心，得到第一沉淀物，用四氢呋喃将所得第一沉淀物溶解获得溶解液，将所述溶解液与peg的四氢呋喃溶液混合，30~50℃反应20~28h，冷却得到混合溶液；s2、将所得混合溶液与环己烷混合，得到第二沉淀物，将所述第二沉淀物顺次进行干燥、溶解、过滤，得到水溶性nps。
24.在本发明中，将油溶性nps与丙酮混合离心，得到第一沉淀物。所述油溶性nps与丙酮的体积比优选为1:2~5，进一步优选为1:3~4；所述离心的转速优选为8000~12000 rpm，进一步优选为9000 rpm~11000 rpm，所述离心的时间优选为3~8 min，进一步优选为4~6 min；本发明在获得所述第一沉淀物后，用四氢呋喃溶解所得的第一沉淀物获得溶解液，当第一沉淀物中含有gd时，所述第一沉淀物中的gd与四氢呋喃的质量体积比优选为4~6 mg∶1~2 ml。
25.本发明在获得所述溶解液后，将所述溶解液与peg的四氢呋喃溶液混合反应，所述油溶性nps与peg质量比优选为1:8~12，进一步优选为1:9~11；所述反应的温度为30~50℃，优选为35~45℃，还优选为38~42℃；步骤s1所述反应的时间为20~28h，优选为22~26h，进一步优选为23~25h；。
26.在本发明中，混合溶液与环己烷混合前还优选包括冷却至室温；步骤s2中混合溶液与环己烷的体积比优选为1:2~5，进一步优选为1:3~4；步骤s2中沉淀物在干燥前还优选包括用四氢呋喃复溶、环己烷洗涤的过程，当沉淀物中含有gd时，所述沉淀物中的gd与四氢呋喃的质量体积比优选为4~6 mg∶1~2 ml。，所述环己烷洗涤的次数优选为1~3次；本发明步骤s2中所述干燥优选为真空干燥，所述干燥的时间优选为2~6h，进一步优选为3~5h；所述溶解所用溶剂优选为水，进一步优选为纯水；本发明步骤s2中所述过滤优选采用超滤，所述超滤的截留分子量优选为80~120kda，进一步优选为90~110kda，所述超滤的次数优选为2~5次；所述超滤采用超滤管进行，所述超滤的作用是除去多余的peg。本发明制备获得的水溶性nps优选的置于0~5℃保存。
27.在本发明中，所述油溶性nps优选由包含如下步骤的制备方法得到：ⅰ、将氢氧化钠溶液、无水乙醇和油酸混合搅拌5~15min，然后加入镧系金属盐溶液和氟化钠溶液混合搅拌0.5~1.5h，得到第一混合物；ⅱ、将所述第一混合物与乙醇混合后离心，得到沉淀物，用环己烷将所得沉淀物溶解，得到第一纳米簇前驱物环己烷溶液；ⅲ、将氢氧化钠溶液、无水乙醇和油酸混合搅拌5~15min，然后加入镥盐溶液和氟
化钠溶液混合搅拌0.5~1.5h，得到第二混合物；iv、将所述第二混合物与乙醇混合后离心，得到沉淀物，用环己烷将所得沉淀物溶解，得到第二纳米簇前驱物环己烷溶液；v、将十八烯、油酸和第一纳米簇前驱物环己烷溶液混合，通入氮气，在60~80℃搅拌20~40min，然后升温至260~300℃，反应0.5~1.5h后冷却得到纳米晶体中间物溶液；vi、将所述纳米晶体中间物溶液和十八烯、油酸、第二纳米簇前驱物环己烷溶液混合，通入氮气，在60~80℃搅拌20~40min，然后升温至260~300℃，反应0.5~1.5h后冷却得到油溶性nps；在本发明步骤ⅰ中，将氢氧化钠溶液、无水乙醇和油酸混合搅拌5~15min，优选为8~12min，所述氢氧化钠溶液的浓度优选为200~400g/l，进一步优选为250~350g/l，还优选为280~320g/l。本发明在氢氧化钠溶液、无水乙醇和油酸混合后，向其中加入镧系金属盐溶液和氟化钠溶液混合搅拌0.5~1.5h，优选为0.8~1.2h。本发明中所述氢氧化钠溶液、无水乙醇、油酸、镧系金属盐溶液和氟化钠溶液的体积比优选为3~5:7~10:18~22:1~2:2~6，进一步优选为3~5:8~9:19~20:1~2:3~4；所述镧系金属盐溶液优选为多组分镧系盐溶液，所述多组分镧系盐溶液中优选包含gd、yb和tm，gd、yb和tm的摩尔比优选为70~90:15~20:1~3，所述镧系金属盐溶液的浓度优选为0.2~0.8mol/l，进一步优选为0.3~0.7mol/l，还优选为0.4~0.6mol/l；所述氟化钠溶液浓度优选为0.2~0.8mol/l，进一步优选为0.3~0.7mol/l，还优选为0.4~0.6mol/l；本发明中的镧系金属盐溶液和氟化钠溶液的添加方式优选为先加入镧系金属盐溶液再加入氟化钠溶液，进一步优选为逐滴添加。
28.在本发明步骤ⅱ中，所述第一混合物与乙醇的体积比优选为1:2~4；所述离心的转速优选为8000~15000rpm，进一步优选为9000~12000rpm，还优选为10000~11000rpm，所述离心的时间优选为5~15min，进一步优选为7~13min，还优选为9~11min；本发明步骤ⅱ中所述离心之后还优选包括用乙醇洗涤；步骤ⅱ中所述沉淀物与环己烷的比例优选为0.3~0.6 mmol∶1~2 ml。
29.在本发明步骤ⅲ中，将氢氧化钠溶液、无水乙醇和油酸混合搅拌5~15min，优选为8~12min，所述氢氧化钠溶液的浓度优选为200~400g/l，进一步优选为250~350g/l，还优选为280~320g/l。本发明在氢氧化钠溶液、无水乙醇和油酸混合后，向其中加入镥盐溶液和氟化钠溶液混合搅拌0.5~1.5h，优选为0.8~1.2h。在本发明中，所述的镥盐溶液优选为氯化镥盐溶液；本发明中所述氢氧化钠溶液、无水乙醇、油酸、镥盐溶液和氟化钠溶液的体积比优选为3~5:7~10:18~22:1~2:2~6，进一步优选为3~5:8~9:19~20:1~2:3~4；所述镥盐溶液的浓度优选为0.2~0.8mol/l，进一步优选为0.3~0.7mol/l，还优选为0.4~0.6mol/l；所述氟化钠溶液浓度优选为0.2~0.8mol/l，进一步优选为0.3~0.7mol/l，还优选为0.4~0.6mol/l；本发明中的镥盐溶液和氟化钠溶液的添加方式优选为先加入镥盐溶液再加入氟化钠溶液，进一步优选为逐滴添加。
30.在本发明步骤iv中，所述第二混合物与乙醇的体积比优选为1:2~4；所述离心的转速优选为8000~15000rpm，进一步优选为9000~12000rpm，还优选为10000~11000rpm，所述离心的时间优选为5~15min，进一步优选为7~13min，还优选为9~11min；本发明步骤iv中所述离心之后还优选包括用乙醇洗涤；步骤iv中所述沉淀物与环己烷的比例优选为0.3~0.6 mmol∶1~2 ml。
31.在本发明步骤v中，所述十八烯和油酸的体积比优选为3~6:2~4；所述搅拌的温度为60~80℃，进一步优选为65~75℃，还优选为68~72℃；所述搅拌的时间为20~40min，进一步优选为25~35min。还优选为28~31min；本发明步骤v中升温至260~300℃，优选为270~290℃，进一步优选为275~285℃，所述升温的速度优选为5~15℃/min，进一步优选为8~11℃/min；本发明步骤v中反应后冷却得到纳米晶体中间物溶液，所述反应时间为0.5~1.5h，优选为0.7~1.3h，进一步优选为0.9~1.1h；在本发明中，所述冷却得到纳米晶体中间物溶液优选通过冷凝进行，所述冷凝优选为在升温至200℃时加上冷凝装置；本发明所述冷却优选为冷却至室温。
32.在本发明步骤vi中，所述十八烯和油酸的体积比优选为3~6:2~4；所述纳米晶体中间物溶液和第二纳米簇前驱物环己烷溶液的体积比优选为6~9∶1~2；所述搅拌的温度为60~80℃，进一步优选为65~75℃，还优选为68~72℃；所述搅拌的时间为20~40min，进一步优选为25~35min。还优选为28~31min；本发明步骤vi中升温至260~300℃，优选为270~290℃，进一步优选为275~285℃，所述升温的速度优选为5~15℃/min，进一步优选为8~11℃/min；本发明步骤vi中反应后冷却得到油溶性nps，所述反应时间为0.5~1.5h，优选为0.7~1.3h，进一步优选为0.9~1.1h；在本发明中，所述冷却得到油溶性nps优选通过冷凝进行，所述冷凝优选为在升温至200℃时加上冷凝装置；本发明所述冷却优选为冷却至室温。
33.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
34.以下实施例中用到的主要试剂来源：氯化钆(iii)六水合物，分子式gdcl3·
6h2o，分子量371.70，纯度99.99%；氯化镱(iii)六水合物，分子式ybcl
3 · 6h2o，分子量387.49，纯度99.99%；氯化铥(iii)六水合物，分子式tmcl
3 · 6h2o，分子量:383.38，纯度99.99%；氯化镥(iii)六水合物，分子式lucl
3 · 6h2o，分子量: 389.42，纯度99.99%，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
35.双磷酸
‑
peg
‑
马来酰亚胺（dp
‑
peg
‑
mal），分子量为2000，聚乙二醇一端是二磷酸基团，另一端是马来酰亚胺基团，是苏州欣影科技有限公司提供的定制产品。
36.赫赛汀（注射用曲妥珠单抗），分子量180000，购自罗氏下属genentech公司。
37.实施例1首先将0.5mmol lncl3（gd，yb，tm=80:18:2）溶于1ml水中，2mmol氟化钠溶于4ml水中，称量1.2g氢氧化钠至50ml单口烧瓶中，加入4ml水溶解完全，再加入9ml无水乙醇和20ml油酸，搅拌约10min后，逐滴依次加入lncl3水溶液和氟化钠水溶液，搅拌约1h后，加入2倍体积乙醇沉淀出产物，10000rpm离心10min之后，再用乙醇和环己烷洗涤一次，将最终产物分散在2ml环己烷中，得到nalnf4纳米簇前驱物的环己烷溶液。
38.将0.5mmol lucl3溶于1ml水中，2mmol氟化钠溶于4ml水中，称量1.2g氢氧化钠至50ml单口烧瓶中，加入4ml水溶解完全，再加入9ml无水乙醇和20ml油酸，搅拌约10min后，逐滴依次加入lucl3水溶液和氟化钠水溶液，搅拌约1h后，加入2倍体积乙醇沉淀出产物，10000rpm离心10min之后，再用乙醇和环己烷洗涤一次，将最终产物分散在2ml环己烷中，得到naluf4纳米簇前驱物的环己烷溶液。
39.将10ml十八烯和6ml油酸加入至100ml三口烧瓶中，然后加入制备好的nalnf4纳米粒子前驱物的环己烷溶液，通氮气在70℃搅拌30min，以10℃/min升温至280℃，升温过程中
在200℃时加上冷凝装置，反应1h后冷却至室温，加入制备好的naluf4纳米粒子前驱物的环己烷溶液，同时加入10 ml十八烯和6 ml油酸，通氮气在70℃搅拌30min，以10℃/min升温至280℃，升温过程中在200℃时加上冷凝装置，反应1h后冷却至室温，得到nagdf4:yb,tm@naluf4纳米晶体。
40.取nagdf4:yb,tm@naluf4纳米晶体 10mg，加3倍体积丙酮离心沉淀，弃上清，沉淀溶于2 ml四氢呋喃备用。取100mg peg溶于2 ml四氢呋喃，再与溶于四氢呋喃的nps混合，混匀后40℃搅拌反应24小时。反应结束后冷却至室温，随后用3倍体积环己烷沉淀，沉淀复溶于2 ml的四氢呋喃中，再重复用环己烷洗涤沉淀2次。所得的沉淀置于真空干燥箱中室温抽真空干燥4小时，干燥的纳米颗粒用纯水溶解，再用100 kda超滤管超滤3次以除去多余的peg，得到水溶性nps，4℃条件下保存。
41.取tcep，每1mg溶于80微升的纯水中，取赫赛汀10μg，与90μl pbs、100μl tcep混合，在25℃，震荡器800rpm下反应30min，反应完成后用tbs超滤；取水溶性nps 1mg，用tbs超滤，超滤后与处理后的赫赛汀混合，混匀后在25 ℃，震荡器800rpm下反应30min，反应结束后100 kda超滤管纯水超滤3次，测定浓度后4℃保存，得到上转换纳米诊疗一体化平台探针np
‑
mab。
42.实验例1 电镜及性状表征取实施例1制得的np
‑
mab，纯水稀释到0.2 mg/ml，滴加到电镜用铜网中，制样后电镜拍摄（fei tecnai g20）。
43.电镜图如图1所示，粒径统计图如图2所示，水合粒径图如图3所示，荧光光谱图如图4所示。
44.结果显示：制备的核壳结构ucnp呈球形，粒径约为22.05
±
1.82nm；在980nm激光激发下在804nm处有明显发射峰；同时具有her2活性，有主动靶向的作用。
45.实验例2 胶体稳定性测试取实施例1中的np
‑
mab分别溶于纯水和10%fbs中，检测np
‑
mab水合粒径变化情况，如图5~图6所示。
46.结果显示：np
‑
mab在纯水中始终为单一散射峰，0h、12h、24h、48h、72h水合粒径均没有明显波动。np
‑
mab在10%fbs中散射峰有两个，其中较小的一个为血清蛋白的散射峰，较大的是纳米颗粒的散射峰，0h、12h、24h、48h、72h水合粒径均没有明显波动。
47.实验例3 生物毒性分析取对数生长期的skbr3细胞和qsg7701细胞按8000个细胞每孔分别铺96孔板，37℃，5%co2培养箱中过夜，按0.04mmol(ucnp中gd
3+
含量计算)，0.08mmol、0.16mmol、0.31mmol、0.63mmol、1.25mmol、2.5mmol、5mmol浓度配制培养基，加到96孔板细胞中，培养24小时，pbs清洗后，更换正常培养基，加10%cck8，培养箱中孵育一小时后酶标仪显色，结果如图7所示。
48.结果显示：当gd
3+
浓度高达5mmol时，孵育24小时后，细胞活力仍高达81.3
±
1.3%和76.2
±
2.8%。而在治疗研究中的使用剂量均远低于5mmol，说明本发明合成的np
‑
mab纳米颗粒生物安全性高，在治疗使用剂量下基本无毒。
49.实验例4 细胞免疫荧光实验证实np
‑
mab生物活性和靶向性水溶性np
‑
mab特异性结合实验一：取对数生长期skbr3细胞和mda
‑
mb 231细胞铺
15mm直径玻底皿，5
×
103/皿，37℃，5% co2培养箱中过夜，24小时后分别加入100μg/ml（gd
3+
=100μg）nps及实施例1中的np
‑
mab。12小时后，用pbs在水平摇床上清洗3次，每次5min，再每皿加吖啶橙工作液室温避光染色5min，再用pbs清洗3次，每次5min，再用4%多聚甲醛固定30min。在共聚焦显微镜下分别用acridine orange、980nm激光下观察，结果如图8所示。
50.水溶性np
‑
mab特异性结合实验二：取对数生长期skbr3细胞铺35 mm直径细胞培养皿，5
×
104/皿，37℃，5% co2培养箱中过夜，24小时后分别加入pbs、100μg/ml（gd
3+
=100μg）nps、100μg/ml实施例1中的np
‑
mab及100μg/ml的np
‑
mab+10μg游离mab。12小时后，用pbs在水平摇床上清洗3次，每次5分钟，消化细胞转移至1.5mlep管中，在上转换ivis中观察显像，结果如图9所示。
51.结果显示：本发明合成的np
‑
mab有明显的生物活性及靶向性，np
‑
mab较nps更多的被细胞摄取，表现为明显的上转换荧光信号（实验一），表明np
‑
mab能够与her2阳性细胞特异性结合。同时在加入游离mab后，细胞摄取受到明显抑制（实验二）。
52.实验例5 np
‑
mab探针在活体内的ivis靶向显像取skbr3足垫荷瘤鼠（来源于常州卡文斯实验动物有限公司，为spf级雌性裸鼠，饲养于苏州大学spf级动物房），通过尾静脉注射实施例1中的np
‑
mab，24小时后处死解剖出左侧腘窝淋巴结和各器官及组织，采集上转换信号并分析信号强弱，结果如图10~11所示。
53.结果显示：np
‑
mab在荷瘤鼠体内各脏器生物分布情况，主要分布在骨骼、肝脏及脾脏中，肿瘤内可见明显摄取，尤其是在转移淋巴结中np
‑
mab可见更高的分布。
54.由以上实施例可知，本发明提供了一种上转换纳米诊疗一体化平台探针，能够结合上转换纳米材料的优异性能以及赫赛汀针对her2靶点的特殊性质，具有her2活性，稳定性较强，生物安全性较高，制备方法简单易行，具有良好的上转换发光性能，同时还具有主动靶向功能，有望进一步用于诊疗一体化探针的临床前开发应用，为her2高表达的乳腺癌提供一种新的诊疗策略。
55.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。