GPR180抑制剂在制备改善糖或脂代谢药物中的用途

本发明涉及医药，具体涉及gpr180抑制剂在制备改善糖或脂代谢药物中的用途，特别是gpr180抑制剂在制备治疗非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fattyliver disease，nafld)、减肥减脂、改善胰岛素抵抗药物中的应用。

背景技术：

1、nafld是全球慢性肝病日益增长的一个重要病因，其特点是非饮酒因素导致肝脏脂肪沉积过多，可表现为非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，nafl)或非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，nash)。美国肝病研究协会实践指南通过肝脂肪变性的组织学证据定义了nafl为单纯性脂肪变性，没有肝细胞损伤；而nash的组织学特征包括大泡性脂肪变性、炎症以及肝细胞出现膨胀等病理现象。nash与nafl相比，nash具有进展至肝硬化或肝细胞癌症的风险。

2、目前nafld全球患病率约为24％，随着肥胖、2型糖尿病和代谢综合征发病率的上升，nafld预计在未来十年将成为肝硬化需要肝移植的主要病因。评估不同地理区域nafld患病率发现nafld在全球各大洲普遍流行：南美洲(31％)和中东(32％)的发病率最高，其次是亚洲(27％)、北美洲(24％)和欧洲(23％)，而非洲发病率(14％)较低。

3、nafld与2型糖尿病(type 2diabetes mellitus，t2dm)之间的关系是复杂的、双向的。nafld不仅是t2dm疾病转归的一个结局，也是t2dm的一个致病因素。在其病因中，有观点认为胰岛素抵抗是nafld的显著特征同时也是导致nafld形成的致病因素。胰岛素抵抗的特点是肝外组织对葡萄糖利用减少，包括脂肪组织和肌肉组织。脂肪组织胰岛素抵抗通过脂肪分解紊乱导致脂肪酸释放过度，从而促使全身胰岛素信号受损。另外脂肪组织与肝脏通过释放的蛋白因子，例如脂联素(adiponectin)、白细胞介素-6(il-6)、二肽基肽酶4(dpp-4)等，在胰岛素抵抗方面可能互为因果。其他的一些代谢因素如胆固醇(cholesterol,cho)的影响也可以促进nafld的发生发展，但是其具体的机制尚不明确。由于胆固醇通过肝脏的流通量很大，而且每天饮食中胆固醇摄入量都会有波动，因此胆固醇的调节始终处于动态平衡的状态。这种平衡包括胆固醇缺乏时会加强胆固醇的合成途径，过多时则加强其排出途径；如果动态平衡发生紊乱可能会导致nafld的发生。有研究证据显示，nafld患者肝脏胆固醇稳态失调，导致胆固醇积聚，触发kupffer细胞的炎症反应。但目前，胆固醇性nafld还缺乏一个全面的，普遍接受的发病机制概念模型。

4、nafld患者普遍存在血脂异常，血脂呈现高甘油三酯和高胆固醇，是动脉粥样硬化形成的重要致病因素。尤其是低密度脂蛋白胆固醇含量高，高密度脂蛋白胆固醇含量低时，对心血管的损害大。另外临床上通过对nafld患者左心室形态和舒张功能的研究，发现与对照组相比左心室结构异常且出现功能障碍，可以看出nafld是心血管疾病的风险因素。据一项人群队列统计结果显示，nafld与脑出血风险增加和缺血性卒中风险增加相关，这显示了nafld是脑中风风险增加的重要风险因素。

5、此外，瘦型nafld是一种潜在不健康的代谢状态，是指发生在非超重或者非肥胖人群中的nafld。然而，其全球流行病学和代谢特征尚未得到广泛阐明。目前临床上许多医生仍然认为瘦型nafld相比肥胖表型nafld而言是良性的，因此瘦型nafld的危害性常被忽视，没有引起重视。通常瘦型nafld由不同病因引起，包括高果糖高脂饮食、酗酒、遗传突变以及内分泌失衡等。瘦型nafld病例体重正常，但是代谢可能发生紊乱，在西方国家人口中其患病率不低于5％。瘦型nafld人群通常有以下特征：包括非肥胖、经常久坐、胰岛素敏感性受损、心血管风险增加以及肝脏脂质水平升高；造成的后果是脂肪组织储存脂肪能力下降、线粒体功能降低以及肝脏脂肪生成增加。瘦型nafld更容易发展为肝纤维化，肝脏相关的死亡率和发病率风险更高，危害更大。因此这种新型nafld，需要引起足够关注。

6、由于nafld病因复杂，个体差异性大，无特效药物治疗。目前中国、美国、或者欧洲食品与药品监督局尚无批准专门用于治疗nafld的药物。关于nafld的治疗，有非药物和药物干预两种模式。非药物治疗，即通过规律锻炼、饮食疗法以及减轻体重来改善代谢，并有可能抑制nafld的发展进程；但是总的来说，非药物干预模式疗效甚微。因此治疗nafld的焦点更多在于药物干预模式。通常治疗nafld主流药物为维生素e、吡格列酮、二甲双胍、他汀以及glp1受体激动剂利拉鲁肽/塞马鲁肽等等。遗憾的是，大多数报道的药物都没有显示出nafld疾病状况的显著改善。目前一些具有潜力的试剂已进入iii期临床试验，如法尼类x受体(farnesoid x receptor，fxr)激动剂阿苯胆酸、过氧化物酶体增殖物激活受体α/δ(peroxisome proliferator–activated receptor alpha/delta，pparα/δ)激动剂依拉贝诺、凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase，ask1)抑制剂selonsertib以及趋化因子受体2和5(c-c chemokine receptor type 2/5，ccr2/ccr5)抑制剂cenicriviroc。

7、gpr180(g protein-coupled receptor 180)是一种g蛋白偶联受体(g-protein-coupled receptor，gpcr)，也被称为内膜厚度相关受体(intimal thickness–relatedreceptor，itr)。2003年日本科学家在研究兔子主动脉导管损伤模型时通过基因差异分析，发现了一个新的基因在损伤后表达上调。该基因主要在血管平滑肌细胞中表达并编码一种具有7次跨膜结构域的新蛋白，因此命名为itr。itr序列包含与视紫红质样gpcr超家族共有的模体序列。对该基因的体内研究分析发现，itr蛋白的表达随着小鼠股动脉周围导管放置引起的内膜增厚而增加。此外，itr基因敲除小鼠对这种实验性内膜增厚具有抵抗作用。目前对gpr180的研究主要涉及到肿瘤、心血管、瞳孔发育等方面。

技术实现思路

1、本发明通过实验研究发现了gpr180在小鼠肾脏、肝脏、下丘脑、胰腺、肺、附睾脂肪(epididymo white adipose tissue,ewat)、卵巢等组织高表达；且在肝脏组织中，肝实质细胞表达量最高。高脂饮食诱导小鼠肥胖和leptin受体敲除诱导小鼠糖尿病两种病理条件下，小鼠肝脏gpr180基因表达水平上调。肝脏gpr180敲减后，正常饮食(normal chow diet,ncd)小鼠和高脂饮食(high fat diet,hfd)小鼠的能量代谢均增强，体内脂肪含量均降低，包括皮下脂肪(subcutaneous white adipose tissue,swat)、附睾脂肪。所述现象在高脂饮食小鼠中更为明显。肝脏敲减gpr180能改善高脂饮食导致的小鼠肝脏脂肪变性，降低血浆和肝脏中胆固醇含量。肝脏敲减gpr180还能改善正常饮食小鼠和高脂饮食小鼠胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性，而完成了本发明。

2、在此基础上，gpr180可以作为非酒精性脂肪性肝病、减肥或减脂、治疗糖尿病、高胆固醇血症的治疗靶点。

3、本发明的技术方案如下：

4、gpr180抑制剂在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的用途。在本发明的一个实施方式中，所述非酒精性脂肪性肝病是瘦型非酒精性脂肪性肝病。在本发明的一个实施方式中，所述非酒精性脂肪性肝病是肥胖型非酒精性脂肪性肝病。

5、非酒精性脂肪性肝病包括非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，nafl)和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，nash)。

6、gpr180抑制剂在制备减肥或减体脂或治疗肥胖症药物中的用途。

7、gpr180抑制剂在制备治疗糖尿病药物中的用途，优选所述药物用于提高糖尿病患者对胰岛素的敏感性。

8、gpr180抑制剂在制备治疗高胆固醇血症药物中的用途。

9、根据本发明，gpr180抑制剂可以是抑制gpr180活性的抑制剂、或者抑制gpr180蛋白质表达水平的抑制剂。所述抑制活性可以是可逆的或不可逆的。

10、所述抑制gpr180活性的抑制剂是指可以结合gpr180但在结合时不激动gpr180的受体活性或不产生生物应答的物质。所述抑制剂可以阻断、抑制或减弱由gpr180激动剂介导的应答，并可与激动剂竞争结合gpr180。抑制gpr180活性的抑制剂包括但不限于gpr180的抗体、抑制gpr180活性的多肽、小分子化合物等。

11、抑制gpr180蛋白质表达水平的抑制剂可以是gpr180基因的反义核酸序列、干扰序列(例如sirna、mirna、shrna、dsrna等)，或者能够抑制gpr180基因转录的多肽、小分子化合物等，或者能够抑制gpr180的mrna翻译成蛋白质的多肽、小分子化合物等。

12、根据本发明，所述抗体包括但不限于单克隆抗体、合成抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链fv(scfv)(包括双特异性scfv)、单链抗体、fab片段、f(ab')片段、二硫键连接的fv(sdfv)和任何上述的表位结合片段。特别地，用于本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。用于本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类。优选地，抗体是人或人源化单克隆抗体。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从由人基因表达抗体的小鼠或其它动物分离的抗体。可采用本领域已知的抗体制备方法制备得到gpr180的抗体。例如，可通过向已经修饰以反应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备；还可通过基于杂交瘤的方法制得；还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的fv纯系可变域序列产生；包括(但不限于)蛋白分解消化完整抗体或者通过重组宿主细胞的方式产生抗体片段等等。

13、在本发明的一些实施方式中，所述抑制剂为gpr180的抗体，优选为单克隆抗体。

14、在本发明的一些实施方式中，所述抑制剂为gpr180基因的干扰序列，例如针对gpr180的mrna的shrna或sirna。基于gpr180的基因序列，可以采用本领域已知的方法设计其干扰序列。

15、在本发明的一些实施方式中，所述gpr180基因的干扰序列为以下序列中的任一条或两条以上的任一组合：5’-ctcccaaattcagatgctgta-3’，5’-tgcttcagccttagctaatta-3’，5’-gcttcagccttagctaattac-3’，5’-gctcttgctgattgtcttacg-3’。

16、在本发明的一些实施方式中，所述gpr180基因的干扰序列携带在表达载体上。

17、所述表达载体中可以包含与gpr180基因的干扰序列可操作地连接的启动子和转录终止序列。

18、所述表达载体可以是真核细胞表达载体。

19、所述真核细胞表达载体可以是质粒表达载体或病毒表达载体。

20、所述质粒表达载体可以是但不限于pcdna3.1+/-，pcdna4/hismax b，psectag2 a，pvax1，pbudce4.1，ptracer cmv2，pcdna3.1(-)/myc-his a，pcdna6-myc/his b，pcep4，pires，piresneo，pires hyg3，pcmv-myc，pcmv-ha，pires-puro3，pires-neo3，pcaggs，psilencer1.0，psilencer2.1-u6 hygro，psilencer3.1-h1 hygro，psilencer3.1-h1 neo，psilencer4.1-cmv neo。

21、所述病毒表达载体可以为慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒表达载体或其他类型病毒载体，包括但不限于plko.1，plvx-ires-zsgreen1，pcdh-ef1-luc2-t2a-tdtomato，pcdh-mscv-mcs-ef1-puro，pcdh-mscv-mcs-ef1-copgfp，plvx-zsgreen1-c1，padeasy-1，pshuttle-cmv，pshuttle，padtrack，padtrack-cmv，pshuttle-ires-hrgfp-1，pshuttle-ires-hrgfp-2，pshuttle-cmv-lacz，pshuttle-cmv-egfp-c，pxc1，pbhge3，paav-mcs，paav-rc，phelper，paav-lacz，pav-gfp载体。

22、在本发明的一个实施方式中，pav-gfp载体上装载四条干扰序列：5’-ctcccaaattcagatgctgta-3’，5’-tgcttcagccttagctaatta-3’，5’-gcttcagccttagctaattac-3’，5’-gctcttgctgattgtcttacg-3’。

23、根据本发明，所述药物进一步包含药学上可接受的赋形剂。

24、“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述gpr180抑制剂之外的任何成分，并且在患者中具有基本上无毒和非炎性的性质，包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质或其他液体载体、分散或悬浮助剂、稀释剂、等渗剂、防腐剂、着色剂、甜味剂或调味剂、稳定剂、抗氧化剂、抗微生物剂或抗真菌剂、摩尔渗透压浓度调节剂、ph调节剂、缓冲剂、螯合剂、冷冻保护剂和/或填充剂，如适合于所需的特定剂型的。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域已知的。示例性抗微生物剂或抗真菌剂包括但不限于苯扎氯铵，苄索氯铵，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯，苯甲酸，羟基苯甲酸，苯甲酸钾或苯甲酸钠，山梨酸钾或钠，丙酸钠，山梨酸等，以及它们的组合。示例性防腐剂包括但不限于，维生素a，维生素c，维生素e，β-胡萝卜素，柠檬酸，抗坏血酸等，以及它们的组合。控制ph的示例性缓冲液可包括但不限于磷酸钠，柠檬酸钠，琥珀酸钠，组氨酸(或组氨酸-hcl)，苹果酸钠，碳酸钠等，和/或其组合。示例性的冷冻保护剂包括但不限于甘露醇，蔗糖，海藻糖，乳糖，甘油，右旋糖等，以及它们的组合。示例性的稀释剂例如：乳糖、淀粉、纤维素衍生物、无机钙盐、山梨醇等。示例性的粘合剂例如：淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等。示例性的抗氧化剂例如：维生素e、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、丁羟基茴香醚等。示例性的润滑剂例如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉等。示例性的崩解剂例如：淀粉、甲基纤维素、黄原胶、交联羧甲基纤维素钠等。

25、本发明药物的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。

26、本发明的药物可以本领域已知的途径施用于受试者，包括但不限于口服，胃肠外，皮下，肌内，静脉内，腹腔内，肝内，心肌内，肾内，阴道，直肠，颊，舌下，鼻内，透皮方式等。

27、施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，联用药物的种类，治疗频率，给药途径等。药物可以单一日剂量施用，或者总日剂量以每天两次，三次或四次的分开剂量施用。药物可以手术前、手术中、手术后施用。剂量可以施用一次或多次，施药时间可以单日至几个月或更长时间。

28、根据本发明，所述药物还可以与其他能改善糖代谢或脂代谢的药物联合使用，例如降血糖药物，降低血脂的药物。

29、本发明进一步提供：表达靶向于gpr180基因的干扰序列的载体在制备药物中的应用，所述药物用于治疗非酒精性脂肪性肝病、减肥或减体脂、治疗肥胖症、治疗糖尿病、或/和治疗高胆固醇血症。优选，治疗糖尿病是提高糖尿病患者对胰岛素的敏感性。

30、在本发明的一些实施方式中，所述gpr180基因的干扰序列为以下序列中的任一条或两条以上的任一组合：5’-ctcccaaattcagatgctgta-3’，5’-tgcttcagccttagctaatta-3’，5’-gcttcagccttagctaattac-3’，5’-gctcttgctgattgtcttacg-3’。

31、所述表达载体中可以包含与上述gpr180基因的干扰序列可操作地连接的启动子和转录终止序列。

32、所述表达载体可以是真核细胞表达载体。

33、所述真核细胞表达载体可以是质粒表达载体或病毒表达载体。

34、所述质粒表达载体可以是但不限于pcdna3.1+/-，pcdna4/hismax b，psectag2 a，pvax1，pbudce4.1，ptracer cmv2，pcdna3.1(-)/myc-his a，pcdna6-myc/his b，pcep4，pires，piresneo，pires hyg3，pcmv-myc，pcmv-ha，pires-puro3，pires-neo3，pcaggs，psilencer1.0，psilencer2.1-u6 hygro，psilencer3.1-h1 hygro，psilencer3.1-h1 neo，psilencer4.1-cmv neo。

35、所述病毒表达载体可以为慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒表达载体或其他类型病毒载体，包括但不限于plko.1，plvx-ires-zsgreen1，pcdh-ef1-luc2-t2a-tdtomato，pcdh-mscv-mcs-ef1-puro，pcdh-mscv-mcs-ef1-copgfp，plvx-zsgreen1-c1，padeasy-1，pshuttle-cmv，pshuttle，padtrack，padtrack-cmv，pshuttle-ires-hrgfp-1，pshuttle-ires-hrgfp-2，pshuttle-cmv-lacz，pshuttle-cmv-egfp-c，pxc1，pbhge3，paav-mcs，paav-rc，phelper，paav-lacz，pav-gfp载体。

36、在本发明的一个实施方式中，所述载体为pav-gfp，其上装载四条gpr180基因的干扰序列：5’-ctcccaaattcagatgctgta-3’，5’-tgcttcagccttagctaatta-3’，5’-gcttcagccttagctaattac-3’，5’-gctcttgctgattgtcttacg-3’。

37、本发明还提供疾病的治疗方法。

38、一种治疗非酒精性脂肪性肝病的方法，所述方法包括给予有需要的治疗对象治疗有效量的gpr180抑制剂。非酒精性脂肪性肝病包括非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fattyliver，nafl)和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，nash)。在本发明的一个实施方式中，所述非酒精性脂肪性肝病是瘦型非酒精性脂肪性肝病。在本发明的一个实施方式中，所述非酒精性脂肪性肝病是肥胖型非酒精性脂肪性肝病。

39、一种减肥或减体脂或治疗肥胖症的方法，所述方法包括给予有需要的治疗对象治疗有效量的gpr180抑制剂。

40、一种治疗糖尿病的方法，所述方法包括给予有需要的治疗对象治疗有效量的gpr180抑制剂。优选，所述治疗是提高治疗对象对胰岛素的敏感性。

41、一种治疗高胆固醇血症的方法，所述方法包括给予有需要的治疗对象治疗有效量的gpr180抑制剂。

42、所述gpr180抑制剂如前文定义。

43、在本发明的一些实施方式中，所述抑制剂为gpr180的抗体，优选为单克隆抗体。

44、在本发明的一些实施方式中，所述抑制剂为gpr180基因的干扰序列，例如针对gpr180的mrna的shrna或sirna。

45、在本发明的一些实施方式中，所述gpr180基因的干扰序列为以下序列中的任一条或两条以上的任一组合：5’-ctcccaaattcagatgctgta-3’，5’-tgcttcagccttagctaatta-3’，5’-gcttcagccttagctaattac-3’，5’-gctcttgctgattgtcttacg-3’。

46、在本发明的一些实施方式中，所述gpr180基因的干扰序列携带在表达载体上。

47、所述表达载体中可以包含与gpr180基因的干扰序列可操作地连接的启动子和转录终止序列。

48、所述表达载体可以是真核细胞表达载体。

49、所述真核细胞表达载体可以是质粒表达载体或病毒表达载体。

50、所述质粒表达载体可以是但不限于pcdna3.1+/-，pcdna4/hismax b，psectag2 a，pvax1，pbudce4.1，ptracer cmv2，pcdna3.1(-)/myc-his a，pcdna6-myc/his b，pcep4，pires，piresneo，pires hyg3，pcmv-myc，pcmv-ha，pires-puro3，pires-neo3，pcaggs，psilencer1.0，psilencer2.1-u6 hygro，psilencer3.1-h1 hygro，psilencer3.1-h1 neo，psilencer4.1-cmv neo。

51、所述病毒表达载体可以为慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒表达载体或其他类型病毒载体，包括但不限于plko.1，plvx-ires-zsgreen1，pcdh-ef1-luc2-t2a-tdtomato，pcdh-mscv-mcs-ef1-puro，pcdh-mscv-mcs-ef1-copgfp，plvx-zsgreen1-c1，padeasy-1，pshuttle-cmv，pshuttle，padtrack，padtrack-cmv，pshuttle-ires-hrgfp-1，pshuttle-ires-hrgfp-2，pshuttle-cmv-lacz，pshuttle-cmv-egfp-c，pxc1，pbhge3，paav-mcs，paav-rc，phelper，paav-lacz，pav-gfp载体。

52、所述有需要的治疗对象可以是人和哺乳动物，所述哺乳动物例如猴、猩猩、狒狒、猫、狗、猪、羊、牛、鼠、兔等。

53、定义：

54、“和/或”将被视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开。因此，在诸如“a和/或b”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)和“b”(单独)。同样地，在诸如“a、b和/或c”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。

55、“包括”和“包含”具有相同的含义，旨在是开放的并且允许但不要求包括额外的元件或步骤。当在本文中使用术语“包括”或“包含”时，因此也包括和公开了术语“由......组成”和/或“基本上由……组成”。