5,6-dehydroeurycomalactone在制备抗登革病毒药物的应用的制作方法

5,6-dehydroeurycomalactone在制备抗登革病毒药物的应用
1.技术领域
2.本发明涉及苦木苦味素类化合物5,6-dehydroeurycomalactone在制备用于抗登革病毒药物中的应用，属于医药化学抗病毒技术领域。
3.

背景技术：

4.5,6-dehydroeurycomalactone属于苦木苦味素类化合物，该类化合物是苦木科植物的特征性成分。研究表明，苦木苦味素类化合物能够显著抑制多种病毒的复制，如人类免疫缺陷病毒、人类疱疹病毒和烟草花叶病毒（bioorganic&medicinal chem lett, 1996, 6: 701-706；bull chem soc jpn, 1999, 72 (4) : 751-756；j agric food chem, 2010, 58(3) : 1572-1577），但迄今还未有此类化合物的抗登革病毒药理作用研究报道。
5.登革病毒（dengue virus，denv）属于黄病毒科黄病毒属成员，与其同属的成员还包括：日本脑炎病毒、西尼罗病毒、圣路易斯脑炎病毒和黄热病毒等。病毒有rna基因组衣壳，呈哑铃形、杆状或球形，直径为40～50nm。可在乳鼠脑内和组织细胞中培养繁殖，以白纹伊蚊细胞纯株(c6/36)最为敏感。登革病毒有1~4四个血清型，各血清型间存在广泛的血清学交叉反应，异型二次感染可引起抗体依赖性感染增强（antibody-dependent enhancement，ade）现象。
6.登革病毒(dengue virus，denv)感染是当今人类中流行最广的虫媒病毒病。据who估计，全球有25~30亿人口面临感染登革病毒的危险，每年大约有5千万到1亿登革热(dengue fever，df)病例发生，患者表现出高热、头痛、肌痛、关节痛及皮疹等症状，这其中有50万例发展成更为严重的登革出血热(dengue hemorrhagic fever，dhf)和登革休克综合征(dengue shock syndrome，dss)，其死亡率为5%~10%。该病毒主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊在人与人之间进行传播。该病毒主要流行于东南亚、美洲、地中海东部、非洲等一百多个国家和地区。
7.据世界卫生组织的估计，全世界每年约有5千万至1亿人感染登革病毒而引发登革热，其临床症 状主要表现为：发热、皮疹、头痛和肌痛；而登革病毒的感染者可能发展为更为严重的病症，即登革 出血热和登革休克综合症，据统计每年全世界约有25万至50万人表
现为登革出血热。
8.随着全球气候的变化，城市化进程的加快、人员的频繁交往及我国在登革疫区劳务人员的增加，登革病毒流行的威胁依然存在，而且我国部分地区的气候和环境适合登革病毒的传播媒介的生存，为病毒的传播提供了条件。
9.目前还没有有效的疫苗或药物来预防和治疗登革病毒引起的疾病，因此，寻找可有效抗登革病毒的药物具有重要的意义。


技术实现要素：

10.为解决上述技术问题，本发明的目的之一是提供5,6-dehydroeurycomalactone在制备用于抗登革病毒药物中的用途，本发明发现5,6-dehydroeurycomalactone具有抗病毒作用，可显著抑制登革病毒的复制。
11.本发明另一个目的在于提供一种抗登革病毒药物制剂，包含治疗有效量的5,6
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dehydroeurycomalactone，还包含药用辅料或其它可配伍的药物。
12.所述药用辅料是指常规的药用赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂和粘合剂中的一种或两种组合。
13.所述其它可配伍的药物，指的是以有效剂量的5,6-dehydroeurycomalactone为药物原料，再配伍其它具有抗炎、免疫增强、或抗病毒活性的天然药物或化学药品。
14.其中，所述抗炎药物选自：(1)、乙酰水杨酸盐类，包括阿司匹林等；(2)、非乙酰基水杨酸盐类，包括水杨酸镁、水杨酸钠、水杨酸胆碱镁、二氟尼柳（二氟苯水杨酸）、双水杨酸酯；(3)、非水杨酸盐类，包括布洛芬、吲哚美辛（消炎痛）、氟比布洛芬、苯氧基布洛芬、萘普生、萘丁美酮（萘普酮）、吡罗昔康（炎痛喜康）、保泰松、双氯灭痛、芬洛芬、酮基布洛芬、酮咯酸、四氯芬那酸、舒林酸、托美丁等。
15.所述免疫增强药物选自：左旋咪唑左旋咪唑（levamisole,lms）、白细胞介素白细胞介素2(细胞生长因子，t
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cell
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factor,tcgf）、干扰素干扰素（interferon,ifn）、转移因子转移因子（transfer
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factor,tf）、胸腺素胸腺素（thymosin）、法环孢素（ciclosporin,cyclosporin
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a），以及从人参、黄芪、五味子、枸杞子、党参、冬虫夏草、灵芝和银耳得到的提取物等。
16.所述抗病毒活性药物选自：(1)、非开环核苷类，包括齐多夫定（zidovudine）、司他夫定（stavudine）、拉米夫定（lamivudine）、扎西他滨（zalcitabine）等；(2)、开环核苷类，包括阿昔洛韦（aciclovir）、更昔洛韦（ganciclovir）、喷昔洛韦（penciclovir）、泛昔洛韦（famciclovir）、阿德福韦酯（adefovir dipivoxil）；(3)、非核苷类，包括奈韦拉平（nevirapine）、依发韦仑（efavirenz）；(4)、蛋白酶抑制剂，包括沙奎那韦（saquinavir）、茚地那韦（indinavir）、奈非那韦（nelfinavir）；(4)、其他类型，包括利巴韦林（ribavirin）、盐酸金刚烷胺（amantadine hydrochloride）、盐酸金刚乙胺（rimantadine hydrochloride）、膦甲酸钠和磷酸奥司他韦（oseltamivir phosphate）等。
17.所述的抗登革病毒药物制剂包括多种临床药物剂型，如胶囊剂、颗粒剂、片剂、注射剂、脂质体纳米粒、缓释剂、控释剂或分散片等。
18.本发明的另一个目的是提供一种药物组合物。
19.所述药物组合物，是指含有作为活性成分的5,6-dehydroeurycomalactone、其药
学上可接受的盐或它们的溶剂合物，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
20.所述药用赋形剂包括溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂和粘合剂中的一种或两种以上的组合。
21.本发明相对于现有技术具有如下的优点及技术效果：本发明的5,6-dehydroeurycomalactone体外抗登革病毒活性强，明显优于阳性药物利巴韦林，提示该化合物具有良好的药用前景。
22.附图说明
23.图1是mtt方法检测药物毒性，显示5,6-dehydroeurycomalactone在20μm浓度对bhk-21细胞基本没有毒性。
24.图2是显微镜下（40倍）观察细胞的病变效应，显示5,6-dehydroeurycomalactone可抑制2型登革病毒诱导的细胞病变。
25.图3是cck8方法检测细胞的死亡情况，显示5,6-dehydroeurycomalactone可抑制2型登革病毒诱导的细胞死亡。
26.图4是实时荧光定量pcr方法检测病毒rna的表达水平，显示5,6-dehydroeurycomalactone可抑制2型登革病毒诱导病毒rna的合成。
27.具体实施方式
28.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
29.本发明实施例用到的5,6-dehydroeurycomalactone由发明人从植物东革阿里中分离(暨南大学药学院认证)制备，通过uv、ms、nmr等光谱方法鉴定其结构，纯度经hplc-dad峰面积归一化法测得在98%以上。
30.本发明采用2型登革病毒感染细胞模型，评价了5,6-dehydroeurycomalactone对2型登革病毒诱导细胞病变、死亡及病毒rna合成的影响。
31.实施例15,6-dehydroeurycomalactone对bhk-21细胞的毒性试验方法取处于对数生长期的bhk-21细胞，以1
×
105个/ml的细胞密度接种于96孔板中，每孔100μl，设置对照组和不同浓度的药物组，4d后采用mtt法检测细胞毒性。
32.图1试验结果显示：5,6-dehydroeurycomalactone对bhk-21细胞的半数抑制浓度为37.63μm，在20μm浓度对细胞基本没有毒性。
33.实施例25,6-dehydroeurycomalactone对2型登革病毒诱导细胞病变的抑制作用试验方法取处于对数生长期的bhk-21细胞，以1
×
105个/ml的细胞密度接种于6孔板中，每孔2ml，感染200pfu2型登革病毒（denv-2）1h后，给予5,6-dehydroeurycomalactone（el-2，2.5、5、10μm）或20μm利巴韦林（rv）治疗，4d后于显微镜下观察细胞病变情况并拍照。
34.图2试验结果显示：5,6-dehydroeurycomalactone呈剂量依赖性地抑制2型登革病毒诱导的细胞病变。
35.实施例35,6-dehydroeurycomalactone对2型登革病毒诱导细胞死亡的抑制作用试验方法取处于对数生长期的bhk-21细胞，以1
×
105个/ml的细胞密度接种于96孔板中，每孔100μl，感染200pfu2型登革病毒1h后，给予5,6-dehydroeurycomalactone（0.625~20μm）或20μmrv治疗，4d后采用cck8法检测细胞死亡情况。
36.图3试验结果显示：5,6-dehydroeurycomalactone能有效抑制2型登革病毒诱导的细胞死亡，其半数有效浓度为4.67μm。
37.实施例45,6-dehydroeurycomalactone对2型登革病毒诱导病毒rna合成的抑制作用试验方法取处于对数生长期的bhk-21细胞，以1
×
105个/ml的细胞密度接种于6孔板中，每孔2ml，感染200pfu2型登革病毒1h后，给予5,6-dehydroeurycomalactone（2.5、5、10μm）或20μmrv治疗，2d后采用实时荧光定量pcr法检测病毒e蛋白和ns1蛋白的表达情况。
38.图4试验结果显示：5,6-dehydroeurycomalactone对2型登革病毒诱导的病毒e蛋白和ns1蛋白的rna合成具有明显的抑制作用。
39.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。