一种负载藏红花素玉米醇溶蛋白纳米颗粒的制备方法及应用

1.本发明属于功能性复合纳米颗粒制备技术领域，具体涉及一种负载藏红花素玉米醇溶蛋白纳米颗粒的制备方法及应用。


背景技术：

2.从栀子果实中提取的栀子黄色素是主要的天然着色剂之一，在世界范围内被广泛用作食品着色剂，特别是在东亚地区。研究发现藏红花素是栀子黄色素的主要成分。藏红花素是一种独特的水溶性类胡萝卜素，被认为是主要的生物活性物质之一，具有显著的有益功能，主要包括抗糖尿病、镇痛、降血压、抗毒素、降血糖和抗氧化作用。此外，一些研究报告称，藏红花素具有增强记忆力和学习能力以及保护脑细胞的潜力。藏红花素被视为是一种可有效预防或治疗阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)的成分。ad是一种危险的神经退行性疾病和年龄相关的慢性疾病，其主要与大脑中包括β淀粉样蛋白(aβ
1-42
)和tau蛋白等各种蛋白质的异常清除和积累相关。
3.尽管藏红花素具有这些活性功能，但由于高度不稳定性和对加工条件的敏感性，其应用仍然受到限制。由于口服后内源性β-葡萄糖苷酶的水解和快速消除，藏红花素对ph变化、氧化和热应激的稳定性低、吸收差和生物利用度低。最近，关于生物活性物质的封装的研究较多。例如，用于封装的nps已广泛应用于食品工业，主要包括生物活性载体系统、脂肪替代品等。nps大小通常在50
–
150nm范围内，可以很容易地进入细胞。层层自组装(layer-by-layer，lbl)技术、异质聚合及直接混合技术是三种常用的制备纳米颗粒的方法。其中，lbl技术已获得认可。该技术由聚阳离子和聚阴离子之间的静电吸引形成，可用于控制蛋白质-多糖膜的组成、渗透性和厚度。通过多糖与负载在带相反电荷的液滴上的蛋白质共价结合，在纳米颗粒表面形成多层膜。通过lbl自组装获得的nps在化学稳定性、流变行为和微观结构方面具有优越的性能。
4.由于具有显著的功能特性，食品蛋白质(例如动物源性蛋白质和植物源性蛋白质)被广泛用作生物活性成分递送材料。与动物源性蛋白质相比，植物源性蛋白质具有免疫原性且更便宜。据报道，疏水性植物衍生蛋白质(例如麦醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白)具有产生缓释颗粒载体的能力，这表明纳米颗粒的形成可以不使用有毒化学交联剂。玉米醇溶蛋白是一种从玉米中提取的醇溶蛋白，已广泛应用于生物活性脂质、食用色素、精油和其他功能性成分的封装和传递系统。由于独特的自组装特性和疏水性，玉米蛋白基纳米颗粒在水相中呈现出均匀的球形。wang等人通过玉米蛋白的自组装核壳结构制备了装载柠檬醛和酸橙味的纳米颗粒，这对于化妆品、制药和食品行业的封装目的至关重要。然而，载有藏红花素的中空玉米醇溶蛋白nps的封装和控释尚未见报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的问题，本发明研究的目的在于通过lbl自组装技术制备载有藏红花素的中空玉米醇溶蛋白纳米颗粒。然后通过粒度、zeta电位、结构和形态表征制备
的纳米颗粒。
6.本发明研究的另一目的在于对负载藏红花素的纳米颗粒在体外消化过程中的抗氧化活性和控释特性分别进行评估，此外，还评估了含有藏红花素的纳米颗粒对ad细胞模型的影响。
7.本发明通过以下技术方案加以实现：
8.所述的一种负载藏红花素玉米醇溶蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
9.1)玉米醇溶蛋白原液的制备：将玉米醇溶蛋白粉分散到体积比为70％的乙醇水溶液中，在连续磁力搅拌下加热，离心，上清液过滤后制得玉米醇溶蛋白原液；
10.2)负载藏红花素的中空玉米醇溶蛋白纳米颗粒的制备：将藏红花素粉末与步骤1)制得的玉米醇溶蛋白原液按一定的质量比加入到体积比为70％的乙醇水溶液中，于室温条件下搅拌30min，得混合液，然后将碳酸钠乙醇水溶液缓慢注入到混合液中，继续在室温条件搅拌30min，使玉米醇溶蛋白包覆碳酸钠颗粒，得反应液，随后将反应液与milli-q水混合反应10min，制备负载藏红花素的中空玉米醇溶蛋白纳米颗粒；
11.3)负载藏红花素的lbl中空ds/ch包覆的玉米醇溶蛋白纳米颗粒的制备：将ds水溶液与步骤2)制得的负载藏红花素的中空玉米醇溶蛋白纳米颗粒混合，于室温条件下连续磁力搅拌20min，得ds包覆的玉米醇溶纳米颗粒混合液；然后将ds包覆的玉米醇溶纳米颗粒混合液与ch溶液混合，于室温条件下连续磁力磁力搅拌20min，重复两次相同的程序来制备负载藏红花素的lbl中空玉米醇溶蛋白纳米颗粒表面的两个双层；
12.4)将步骤3)制得的负载藏红花素的lbl中空ds/ch包覆的玉米醇溶蛋白纳米颗粒在水溶液中真空冷冻干燥成粉末，即得负载藏红花素玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
13.进一步地，步骤1)中玉米醇溶蛋白粉与乙醇水溶液的料液比1g/20ml，加热温度为70℃，加热时间为30min，离心条件为：1000rpm下离心20min。
14.进一步地，步骤2)中一定的质量比是指藏红花素粉末与玉米醇溶蛋白粉的质量比为1:20。
15.进一步地，步骤2)中碳酸钠乙醇水溶液的质量浓度为2％，其添加量为2％碳酸钠乙醇水溶液与玉米醇溶蛋白原液的体积比为1:2。
16.进一步地，步骤3)中ds水溶液与负载藏红花素的中空玉米醇溶蛋白纳米颗粒的混合质量比为：玉米醇溶蛋白粉与硫酸葡聚糖的质量比为1-4:1:4，优选2:1，ds水溶液的浓度为1.0mg/ml。
17.进一步地，步骤3)ds水溶液与负载藏红花素的中空玉米醇溶蛋白纳米颗粒混合反应条件为混合液的ph值为4.0。
18.进一步地，步骤3)ch溶液的浓度为1.0mg/ml，ph值为4.0，ch溶液的使用量为：壳聚糖与硫酸葡聚糖的质量比为1:1。
19.所述的负载藏红花素的lbl中空ds/ch包覆的玉米醇溶蛋白纳米颗粒在阿尔茨海默病治疗中的应用。
20.本发明制备方法可实现对藏红花素的有效包埋，通过使用碳酸钠作为牺牲模板，基于静电相互作用、氢键和疏水相互作用通过lbl自组装成功制备了负载藏红花素的中空ds/ch包覆的玉米醇溶蛋白纳米颗粒。在玉米醇溶蛋白/ds 2:1的最佳质量比下，纳米粒子
的粒径约为315nm，pdi约为13％，ee约为88.01％，zeta电位约为20mv。
附图说明
21.图1为玉米蛋白与ds质量比对中空ds/ch包覆的玉米蛋白nps的ee、pdi和粒径(a)和zeta电位(b)的影响；
22.图2为负载藏红花素的中空玉米蛋白np和负载藏红花素的lbl中空玉米蛋白nps的tem(a、b)、afm(c、d)和afm(e、f)图像的3d视图；
23.图3为ch(a)、ds(b)、玉米醇溶蛋白(c)、游离藏红花素(d)、载有藏红花素的空心玉米醇溶蛋白nps(e)和载有藏红花素的lbl空心玉米醇溶蛋白nps(f)的ftir光谱；
24.图4为胃模拟(a)和肠道模拟(b)中纳米颗粒的tem图像，以及模拟胃肠环境中纳米颗粒的释放速率(c)；
25.图5为负载藏红花素的lbl nps的
·
oh清除率(％)、fe2+螯合活性(％)和dpph清除率(％)。不同字母表示差异显着(p《0.05)；
26.图6为不同浓度的游离藏红花素、载有藏红花素的nps和载有藏红花素的lbl nps处理的sh-sy5y细胞的细胞活力。不同字母表示差异显着(p《0.05)；
27.图7为不同样品处理后的sh-sy5y细胞形态((放大200倍)。a，未处理的sh-sy5y细胞；b，atra分化的sh-sy5y细胞；c，atra+bdnf分化的sh-sy5y细胞；d，aβ1-42处理的分化sh-sy5y细胞；e，多奈哌齐处理的分化sh-sy5y细胞作为阳性药物对照组；f，游离藏红花素处理的分化sh-sy5y细胞；g，分化的sh-sy5y细胞用载有藏红花素的nps处理的sy5y细胞；h，用载有藏红花素的lbl nps处理的分化的sh-sy5y细胞；i，用pbs处理的分化的sh-sy5y细胞作为阴性对照组；
28.图8为不同样品处理的分化的sh-sy5y细胞中aβ1-42的水平。不同字母表示差异显着(p《0.05)。p control：阳性对照组；n对照，阴性对照组；nps，载有藏红花素的nps；lbl nps，藏红花素负载的lbl nps。
具体实施方式
29.以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，以便更好地理解本技术方案。
30.材料与试剂：藏红花蛋白(》99％)、玉米蛋白、硫酸葡聚糖(ds,500kda)、来自胃粘膜的猪胃蛋白酶(酶活性为250u/mg蛋白质)、全反式视黄酸(atra)、脑源性神经营养因子(bdnf))、aβ
1-42
、多奈哌齐、来自猪胰腺的胰酶(24u/mg脂肪酶的酶活性)、醋酸铀酰、过氧化氢和磷酸盐缓冲盐水(pbs)购自sigma chemical co.(st.louis美国密苏里州)。sh-sy5y人神经母细胞瘤细胞由bena culture collection(中国北京)提供。壳聚糖(ch，分子量190
–
310kda，粘度电位200
–
800cp，脱乙酰度85％)、碳酸钠、水杨酸-乙醇、氯化亚铁、乙醇、naoh、hcl和分析纯乙酸由国药集团化学试剂有限公司(中国上海)提供。dulbecco改良必需培养基(dmem)，胎牛血清(fbs)、牛血清白蛋白(bsa)、青霉素和链霉素由thermo fisher scientific(sanfrancisco,ca,usa)提供。超纯水(18.2mω
·
cm)由milli-q系统(millipore,ma,us)生产。
31.实施例1：制备中空玉米蛋白纳米颗粒
32.玉米蛋白原液的制备方法是将5g蛋白粉分散到100ml 70％(v/v)乙醇水溶液中，
在连续磁力搅拌下，在70℃下加热30min，然后以10,000rpm离心20min。将得到的上清液用0.45μm的注射器过滤器过滤以去除不溶性颗粒，即为玉米蛋白原液。2％碳酸钠乙醇水溶液作为牺牲模板，将碳酸钠溶液以碳酸钠与玉米蛋白原液的体积比1:2缓慢注入玉米蛋白原液中，并在连续磁力搅拌下在室温下反应30min。然后，在室温下将反应溶液与milli-q水混合10min。水可以溶解碳酸钠并制备中空的玉米蛋白纳米颗粒。
33.实施例2：制备负载藏红花素的中空玉米醇溶蛋白纳米颗粒
34.将藏红花素粉末按藏红花素/玉米醇溶蛋白质量比为1:20的比例加入70％(v/v)乙醇水溶液中，并在室温下搅拌30min。然后，将碳酸钠溶液缓慢注入上述溶液中，并在室温下搅拌30min，使玉米醇溶蛋白包覆碳酸钠颗粒。然后，将反应溶液与milli-q水在室温下混合10min，制备负载藏红花素的中空玉米蛋白纳米颗粒。
35.实施例3：制备负载藏红花素的lbl中空玉米蛋白纳米颗粒
36.将ds水溶液(1.0mg/ml)与制备的载有藏红花素的中空玉米蛋白nps以不同的玉米蛋白/硫酸葡聚糖质量比(4:1、2:1、1:1、1:2和1:4)在室温下连续磁力搅拌20min。为了制备lbl自组装的第一层，通过1.0m hcl将溶液ph值调节至4.0。然后将上述混合物与ch溶液(1.0mg/ml,ph 4.0)以1:1ds与ch的质量比在室温下连续磁力搅拌20min混合。通过重复两次相同的程序来制备负载藏红花素的lbl中空玉米蛋白nps表面的两个双层。将制备的载有藏红花素的lbl中空玉米醇溶蛋白nps在水溶液中真空冷冻干燥成粉末。
37.试验例
38.包封率：负载藏红花素的中空玉米醇溶蛋白nps的包封率(ee)，通过高速离心和低温(16,000rpm，4℃)30min获得上清液中的游离藏红花素。使用紫外可见光谱仪(infinite 200pro，tecan，switzerland)在440nm处分析藏红花素含量。ee的计算公式为：
[0039][0040]
粒径和zeta电位：使用malvern zetasizere(malvern instruments ltd.,malvern,uk)，在动态光散射下测量样品的平均粒径、多分散指数(pdi)和zeta电位。每次测量一式三份进行。
[0041]
傅里叶变换红外(ftir)光谱：通过kbr颗粒技术，样品的ftir由分光光度计(nicolet 5700，thermo electron co.，waltham，ma，usa)进行。分光光度计用连续流动的干燥空气吹扫。扫描速度为每秒64次，扫描范围为4000至400cm-1
。
[0042]
投射电子显微镜(tem):使用tem(jeol jem-2100f，thermo scientific，ma，usa)对负载藏红花素的中空玉米醇溶蛋白nps进行形态分析。将一滴nps悬浮液放在铜网上，用吸墨纸吸干使其干燥。使用1％(w/w)醋酸双氧铀溶液对沉积物进行阴性染色30s，然后再次干燥。除去过量的乙酸盐溶液并观察染色的样品。
[0043]
原子力显微术(afm)：使用数字多模式v扫描探针显微镜(veeco metrology，usa)通过afm图像观察纳米颗粒的表面形态。样品经过超声处理，沉积在新切割的云母基底上并在空气中干燥。使用si3n4探针通过afm扫描云母的不同区域。
[0044]
体外模拟消化：在体外模拟胃肠道中研究了藏红花素的动力学释放特性，通过加入hcl(1.0m)将制备的nps调节至ph 2.0，并在连续磁力搅拌下在37℃下孵育30min。然后，将猪胃蛋白酶水溶液(15mg/ml)作为模拟胃液(sgf)加入上述混合物中。消化2h后，将胰酶
水溶液(30mg/ml)作为模拟肠液(sif)加入上述胃消化液中。用naoh(1.0m)将混合物的ph值调节至7.2并在37℃下反应120min。分别以sgf和sif的设计时间间隔(10、20、30、60、90和120min)收集样品。然后按一定体积取出样品并用等体积的新鲜模拟流体代替。体外消化过程中藏红花素的释放率使用方程计算。
[0045][0046]
nps的潜在生物功能活性试验
[0047]
抗氧化活性：基于上述体外模拟消化试验，测定了负载藏红花素的lbl中空玉米醇溶蛋白nps在sif环境中37℃反应120min过程中的抗氧化活性。以一系列时间间隔(30、60、90和120min)取出反应溶液进行分析。在本研究中，使用三种方法测量纳米颗粒的抗氧化活性，即羟基自由基清除活性、dpph清除活性和亚铁离子螯合活性。
[0048]
羟基自由基清除活性：根据报道的方法测量羟基自由基(
·
oh)清除活性[22]。简单地说，将样品与水杨酸-乙醇(6mm)和氯化亚铁(9mm)混合，然后加入过氧化氢(8.8mm)开始反应，在37℃下孵育30min。在510nm处测量溶液的吸光度。羟基自由基清除活性表示为清除率率并使用公式3计算：
[0049][0050]
dpph清除活性：测量了超氧阴离子自由基(
·o2-)清除活性，将样品与dpph溶液(0.1mm)混合。然后，将混合物在黑暗中在37℃下孵育30h，并在517nm处测定吸光度。自由基清除活性用公式计算：
[0051][0052]
亚铁离子螯合活性：测定了样品的铁还原能力[24]。将样品与氯化亚铁(20mm)混合并在25℃下孵育30min。然后，将亚铁嗪(5mm)添加到上述混合物中，并在25℃下孵育10min。然后，在560nm处测量溶液的吸光度。fe
2+
螯合活性使用方程计算：
[0053][0054]
体外细胞毒性试验：sh-sy5y细胞在添加有10％(v/v)热灭活fbs和100u/ml青霉素/链霉素的dmem中培养。细胞放在在5％co2和加湿培养箱(mco-15ac，sanyo electric co.，osaka，japan)中于37℃下培养。通过甲基噻唑基二苯基溴化四唑(mtt)测定并评估了制备样品的细胞毒性。在补充的dmem培养基中制备了三种样品溶液(游离藏红花素、空的中空玉米醇溶蛋白nps和负载藏红花素的中空玉米蛋白nps，并在10、30、50、70和90μg/ml的藏红花素下测量细胞毒性。sh-sy5y细胞(约2
×
104细胞/孔)在96孔板中放置24h。除去培养基后，加入样品并孵育24h。弃去培养基，加入pbs洗涤细胞3次。之后，mtt溶液(100μl，0.将5mg/ml)加入每个孔中，并在37℃下孵育4h以形成紫色甲臜晶体。然后，除去溶液，加入dmso(100μl，0.5mg/ml)溶解形成的甲臜结晶，并在连续磁力搅拌下孵育20min。在570nm处测试吸光度。细胞活力的百分比由方程计算：
[0055][0056]
ad模型细胞形态变化：当sh-sy5y细胞达到70％-80％后，开始分化。在此阶段收获未处理的对照组，而分化组用培养基中的10mm atra处理(第0d)。每两天更换一次培养基并补充atra。在第5d，将细胞用pbs洗涤3次，并在不含血清并补充有bdnf(50ng/ml)的培养基中孵育。bdnf储备液(100μg/ml溶解在0.1％bsa溶液中制备(de medeiros et al.,2019)。每两天更换一次培养基以补充bdnf。在第11d完成细胞分化并获得神经元样表型，分化后的细胞用aβ
1-42
(2.0mm)处理24h，作为ad模型细胞收集。
[0057]
根据上述细胞毒性结果，分别制备了三种样品溶液(游离藏红花素、中空玉米醇溶蛋白nps和负载藏红花素的中空玉米醇溶蛋白nps、阳性药物对照组(多奈哌齐)和阴性对照组(pbs)。获得的ad模型细胞在细胞收集前分别用三个样品在培养基中进一步处理24h。通过zeiss axiovert 200倒置荧光显微镜(carl zeiss，oberkochen，germany)观察sh-sy5y细胞在培养和分化阶段的形态变化，并用axiovisionle(carl zeiss)记录。此外，根据说明书使用elisa试剂盒测定sh-sy5y细胞的aβ
1-42
浓度。
[0058]
统计分析：采用microsoft办公软件、origin 8.0和ibm spss statistics(版本21.0)对数据进行处理。通过方差分析(anova)进行统计分析。以上所有实验至少重复三次。
[0059]
试验结果
[0060]
中空ds/ch包覆玉米蛋白nps的制备:如图1所示，可以看到在不同玉米醇溶蛋白/ds质量比下负载藏红花素的中空ds/ch包覆玉米醇溶蛋白nps的ee、pdi、粒径和zeta电位的变化。首先，由于玉米蛋白nps表面ds和ch负载量的增加，nps的粒径显着增大(图1a)。在玉米醇溶蛋白与ds的质量比为4:1时获得最高值(约456nm)后，当ds和ch质量进一步增加时发生急剧下降，这可能是由于空间位阻、库仑力和静电排斥。此外，在pdi中可以看到相同的变化趋势。在玉米醇溶蛋白/ds的质量比范围为4:1至1:1时，nps的pdi值小于20％，这表明nps的粒径是均匀的。随着ds和ch的质量增加，nps的ee变化相对显著(p《0.05)。当玉米蛋白与ds的质量比为2:1时，ee最高为88.01％。结果表明，包覆在中空玉米醇溶蛋白纳米颗粒内的藏红花素是稳定的。由于在70℃下热变性30min，天然玉米醇溶蛋白通过破坏氢键展开一些α-螺旋结构，并通过重新排列和重组形成β片层构象，这可能为藏红花素提供络合位点。
[0061]
研究发现静电吸引力对于形成蛋白质/多糖复合物是必不可少的。如图1b所示，nps的zeta电位值都是正的。带阴离子的ds被用作第一层，因为它可以与阳离子玉米醇溶蛋白表面静电相互作用并在未涂覆的玉米醇溶蛋白nps表面形成负电荷密度。然后，由于静电吸引力，阳离子ch用于创建第二层。负载有藏红花素的中空ds/ch包覆玉米蛋白nps的最外层是由ch产生的，这决定了nps的电荷为正。由于具有阳离子性质的主氨基存在，ch具有良好的粘附性和渗透性。随着ds质量的增加，nps的zeta电位降低，表明阴离子ds沉积在nps表面。结果表明，玉米醇溶蛋白纳米颗粒的lbl ds/ch涂层的成功制备有助于阴离子ds和阳离子ch之间的静电相互作用。根据分析结果，选择了质量比为2:1的zein/ds的中空ds/ch包覆的玉米蛋白nps用于以下研究。
[0062]
形态观察：tem和afm图像用于评估负载藏红花素的中空玉米醇溶蛋白(crocin-loaded nps)是否包覆ds/ch以及负载藏红花素的nps和负载藏红花素的lbl中空玉米醇溶蛋白nps(crocin-loaded lbl nps)之间的微观结构差异，如图2所示。负载藏红花素的nps
(图2a)显示暗环，代表胶囊壳。结果与中空玉米醇溶蛋白nps报道的结果一致。通过ds和ch包覆后(图2b)，从与囊泡对应的暗边缘可以明显地看到核壳结构。与负载有藏红花素的nps相比，该nps壳厚度和粒径都变大，这归因于水溶液中层的流体动力学膨胀。
[0063]
根据原子力显微镜图像，通过比较表面粗糙度(r
ms
)来观察纳米颗粒的表面粗糙度。如图2c所示，负载有藏红花素的nps的表面相对光滑，r
ms
＝6.98nm。包覆ds/ch后，负载藏红花素的lbl nps的表面粗糙度增加(r
ms
＝21.70nm)。图2f是afm图像的3d视图。从图像上看，负载有藏红花素的lbl nps的平均高度约为140.80nm，相当于负载有藏红花素的nps厚度(36.20nm)的3.88倍。nps分布相对较好，这与lbl nps概况的参考文献一致。形态观察分析结果初步表明制备了负载藏红花素的lbl空心玉米蛋白nps。
[0064]
ftir分析：ftir光谱用于探索大分子中存在的官能团的振动以及物质的分子结构变化和二级结构。ch(样品a)、ds(样品b)、玉米醇溶蛋白(样品c)、游离藏红花素(样品d)、负载有藏红花素的空心玉米醇溶蛋白nps(样品e)和负载有藏红花素的lbl空心玉米蛋白nps的特征透射带(样品f)在4000-400cm-1
范围内进行了图3。根据之前的研究，ch的光谱在1655cm-1
、1590cm-1
、1415cm-1
、-1
,1375cm-1
,和1150cm-1
,分别归于酰胺ⅰ的伸缩振动、n-h弯曲振动、c-o-c,ch3和c-n的对称和不对称伸缩振动以及c-n和c-o是由于存在羰基和脂肪族基团而产生的伸缩振动。通过分析ds的光谱(图3b)，在1230cm-1
、1020cm-1
、980cm-1
、和815cm-1
与soo-和s-o-s的不对称和对称伸缩振动有关。对于天然玉米醇溶蛋白，由文献报道可知特征带在1650cm-1
(酰胺ⅰ的伸缩振动)和1535cm-1
(从胺ⅱ引起nh弯曲和拉伸cn).游离藏红花素的ftir光谱在1700cm-1
、1220cm-1
和1080cm-1
处有特征带，对应于酯或酸基团的c-o伸缩振动，以及c-o和o-h，该结果与rahaiee等人的报告一致。
[0065]
与天然玉米醇溶蛋白的ftir光谱相比，样品e的光谱没有明显变化，表明玉米醇溶蛋白的结构没有被游离的藏红花素显著改变。这可以证明游离藏红花素复合在玉米醇溶蛋白的疏水区域。lbl nps(样品f)形成后，由于ds和ch中的羟基与谷氨酰胺中的酰胺基之间的相互作用，氢谱带在3600cm-1
到3250cm-1
范围内发生轻微偏移。由于ds和ch的涂层，样品f在1020cm-1
和805cm-1
处存在特征带。此外，1250cm-1
处的带强度(由于c-n的伸缩振动)增强，表明ds和ch的相互作用可能与ch中的羧基羟基、藏红花素中的羟基以及玉米醇溶蛋白中酰胺键中的羰基有关。据报道，ch和玉米醇溶蛋白通过静电相互作用结合，可导致酰胺ⅰ特征峰出现明显蓝移。已报道的结果与本研究结果相一致。在本研究中，ftir分析结果进一步证实了负载有藏红花素的lbl中空玉米蛋白nps的表面是由于聚电解质的沉积产生的。
[0066]
藏红花素的控释：在口服纳米载体递送系统中，活性物质从可生物降解的nps的释放曲线通常是双相的，因为释放速率取决于水渗透到聚合物基质中程度大小。研究发现一小部分物质粘附在壳表面而不是负载于核中。通过tem图像观察了在模拟胃肠道消化过程中负载藏红花素的lbl nps的形态变化。如图4a所示，sgf消化的nps的粒径要大得多，其结构变得蓬松，而核壳结构仍然可见。sif消化后(图4b)，无法观察到nps的核壳结构，粒径较小，nps被明显消化。消化后的nps的粒径约为75nm，这与报道的结论一致，即纳米颗粒的大小通常在50-150nm范围内，并且可以轻松进入细胞。结果可能是由于模拟胃肠道消化过程中ph环境的影响。戴等人还发现在模拟消化环境中纳米颗粒的形态变化很明显。负载有藏红花素的lbl纳米颗粒的体外释放曲线如图4c所示。由图可知，藏红花素的体外释放模式先是快速爆发，然后是有控制的释放。在胃模拟过程中，由于亲水性化合物的再水化过程，
60.75％的游离藏红花素分散到sgf中，其余部分完全释放到sif中，这与之前的报告相一致。由于生物聚合物与藏红花素之间的相互作用力较弱，nps的释放速度比游离藏红花素慢。与负载有藏红花素的nps相比，负载有藏红花素的lbl nps的释放率较低(p《0.05)。因为玉米蛋白的包封和ds/ch涂层的组合可以提高藏红花素的可用性。nps中ds/ch的存在对玉米醇溶蛋白的胃蛋白酶降解起到缓冲作用，这有助于延迟释放藏红花素。此外，负载藏红花素的lbl nps在肠道模拟期间的控释行为比在胃模拟期间更优越，这可能是由于随着ph值的增加ds/ch和玉米醇溶蛋白之间的静电相互作用增加。结果表明，ds/ch包覆的玉米醇溶蛋白nps可有效提高藏红花素的生物利用度并通过限制胃中的消化破坏在被运送到肠道之前实现目标释放。
[0067]
体外抗氧化活性：采用
·
oh和dpph
·
自由基的清除活性以及fe
2+
螯合能力来评价负载藏红花素的lbl nps的体外抗氧化活性。如图5所示，由于在模拟消化环境中容易降解和不稳定，游离藏红花素对
·
oh和dpph
·
自由基的抗氧化活性随着消化时间的延长而降低。在sif环境开始时，游离藏红花素对
·
oh和dpph
·
自由基的清除能力分别为75.75％和62.91％，分别相当于负载藏红花素的lbl nps的6.17和3.25倍。负载有藏红花素的nps的清除能力略高于载有藏红花素的lbl nps(p《0.05)。相反，该nps对
·
oh和dpph
·
自由基的抗氧化活性先升高后降低。反应90min后，负载有藏红花素的lbl nps的抗氧化活性最高。结果表明，藏红花素在sif环境中可被分解，ds/ch层对藏红花有显著的保护作用。此外，frap具有类似的变化趋势。消化120min后，游离藏红花素的frap值从68.07％下降到46.49％，而负载藏红花素的nps和负载藏红花素的lbl nps的frap值分别从14.27％增加到59.17％和16.35％到61.71％。根据之前的报道，nps和游离藏红花素之间抗氧化活性的差异可能是由于玉米蛋白中的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等许多芳香族氨基酸通过热诱导技术暴露出来，其可增强蛋白质的抗氧化能力。此外，研究发现ch中的活性氨基和羟基可能参与自由基清除并有助于抗氧化活性。
[0068]
细胞毒性：采用mtt方法评估负载藏红花素的lbl nps的潜在细胞毒性。我们选择sh-sy5y细胞作为体外ad模型。目前，有许多常见的体外模型可用于ad研究。例如缺乏适当神经突结构和许多定义神经元的特征(例如成熟神经元标记)的细胞系。然而，分化的sh-sy5y细胞可以克服这个限制。sh-sy5y细胞源自交感神经系统中处于未成熟阶段的神经元谱系，并表达人类蛋白质。如图6所示，经游离藏红花素、负载有藏红花素的nps和负载有藏红花素的lbl nps处理后的细胞活力呈剂量依赖性。随着浓度的增加，细胞活力逐渐降低。在三个测试样品中，游离藏红花素的细胞活力最高(88.21％)，其次是负载藏红花素的lbl nps(86.75％)和负载藏红花素的nps(84.96％)。游离藏红花素和负载藏红花素的lbl nps和负载有藏红花素的nps之间的细胞活力差异是显著的(p《0.05)。此外，由于静电吸附，三个样品的正电荷很容易与带负电荷的sh-sy5y细胞结合。ch被公认为是一种具有安全性和良好生物相容性的食品常用成分。在较高浓度样品中发现的细胞毒性可能是由于与sh-sy5y细胞接触时的相互作用。nunes等人发现由于sh-sy5y细胞中没有保护层，其细胞毒性可能会随着样品浓度的增加而增加。因此，使用浓度为10μg/ml的负载藏红花素的lbl np进行进一步研究
[0069]
ad细胞模型的形态特征：研究证明sh-sy5y细胞可以分化并获得成熟的神经元样特征，其可用作神经退行性疾病研究(例如ad)的体外模型。分化后的sh-sy5y细胞中成熟神
经元标志物的表达、增殖率的降低、神经突触的形成和扩展等得以展开。atra和bdnf的结合是常见的神经元分化方法。据报道，通过添加atra，神经突触的生长和神经元标记物的表达得到增强。此外，许多研究发现bdnf对于大脑发育中胆碱能表型的分化至关重要。在本研究中，使用zeiss axiovert 200倒置显微镜对经样品处理的sh-sy5y细胞进行成像。图7a是未处理的sh-sy5y细胞的图像。用atra处理5d后，sh-sy5y细胞(图7b)增殖率降低，形态更具极性，因为细胞体延伸得更长且网络开始形成。在用bdnf进一步成熟后，该细胞(图7c)迁移到簇中，细胞网络变得越来越复杂，类似于成熟的神经元。
[0070]
这些成熟神经元进一步用aβ
1-42
处理以获得ad模型。根据现有报道，用于诱导ad细胞模型的最佳aβ
1-42
浓度为2.0μm。如图7d所示，细胞形态数据还显示，aβ
1-42
处理组的细胞体积较小，神经突触退缩，密度较低，形状不规则。相比，游离藏红花素处理后的细胞密度、大小和形状(图7f)与阳性对照组(图7e)相似，说明藏红花素与多奈哌齐具有相似的ad病理改善作用。结果初步表明游离藏红花素和纳米颗粒可以缓解ad的病理，但负载藏红花素的nps和负载藏红花素的lbl nps对ad的影响相对较低。这可能是由于ds/ch包覆的玉米醇溶蛋白nps控制释放藏红花素，以及ds/ch层的潜在细胞毒性。
[0071]
如图8所示，细胞样品中aβ
1-42
浓度的差异是显著的(p《0.05)。多奈哌齐和游离藏红花素处理后细胞的aβ
1-42
浓度最低(分别为101.72pg/mg和123.54pg/mg)，表明藏红花素可诱导aβ
1-42
降解。此外，负载藏红花素的lbl nps作为协同靶向给药系统已被证明在缓解ad进展方面具有潜在作用。虽然结果没有显示负载藏红花素的lbl nps和负载藏红花素的nps在缓解ad病理学上的巨大差异，但负载藏红花素的lbl nps的控释、体外抗氧化活性和细胞毒性特性是优越的。