(-)-jorunnamycinA在抑制膀胱肿瘤细胞生长中的应用及应用方法

(-)-jorunnamycin a在抑制膀胱肿瘤细胞生长中的应用及应用方法
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及(-)-jorunnamycin a在抑制膀胱肿瘤细胞生长中的应用及应用方法。


背景技术：

2.膀胱癌，是世界范围内的常见癌症，特别是在男性群体中，是世界男性群体的第4大高发癌种。膀胱癌分为两种：非肌层浸润型膀胱癌与肌层浸润型膀胱癌。其中，以肌层浸润型膀胱癌的危害最大，易发生淋巴转移、骨转移、前列腺转移或子宫转移，5年生存期较短。
3.目前，在膀胱癌的方面，虽然有外科手术、卡介苗、化疗药物、免疫治疗、联合治疗等手段，但是手术联合化疗仍然是最主流的治疗手段。化疗过程中，常用的依然是cisplatin,gemcitabine,doxorubicin,epirubicin等，基于造成dna损伤，破坏dna复制或者诱导细胞凋亡的化疗药物。上述这一类药物的毒副作用和耐药性是一直存在并难以解决的问题，所以亟待开发新的有效且低毒的候选化疗药物。
4.近年来，以天然产物来源的抗癌化合物已经受到广泛关注，主要是植物来源的化合物，其中有些化合物已经发展成为一线抗癌药物，例如紫杉醇、长春新碱等。对于海洋来源的抗癌化合物尚未得到很好的开发，研究并开发基于海洋来源的抗肿瘤新药有极其重要的意义。
5.若是能从海洋来源的植物提取物中寻找到一种对膀胱癌有特效杀伤作用的物质，不仅对于膀胱癌的治疗具有重要的意义，并且也充分的利用了海洋资源。


技术实现要素：

6.为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种对膀胱癌有特效杀伤作用的抗癌物质，(-)-jorunnamycin a。
7.该物质是来自海洋生物提取物的小分子，符合本领域一直在寻求的“对膀胱癌有特效杀伤作用、同时对其它细胞(特别是正常上皮细胞)杀伤作用小”基本特征。
8.本发明人在寻求筛选对膀胱癌有特效杀伤作用、同时对其它细胞(特别是正常上皮细胞)杀伤作用小的抗癌先导化合物的过程中，经过大量前期实验，最终选择到来自海洋生物的抗癌物质(-)-jorunnamycin a。
9.关于(-)-jorunnamycin a，本发明进行了详细的检索，并未发现相关的将其应用于抑制肿瘤中的专利文献或中文期刊文献；检索到的中文、外文文献中，关于抑癌效果研究仅涉及黑色素瘤与肺癌的研究。而对于其在抑制膀胱癌方面的应用，还是空白。身体不同部位的肿瘤细胞的发病机制、扩散机制以及抑制原理并不相同，即，药物也具有靶向性，对于肺癌有药效的药物未必对于乳腺肿瘤、膀胱肿瘤也同样具有药效。
10.这是因为：第一、癌症类型完全不同：肺癌常见于鳞状细胞癌、小细胞癌、腺癌、大
细胞癌；黑色素瘤是起源于皮肤基底部的黑色素细胞的恶变；而膀胱癌则是移行细胞癌，与上述两种癌症从发源就有本质不同；
11.第二、膀胱癌与其他两种癌的发病原因不同：膀胱癌成因的内因方面，多见于fgfr3突变，egfr突变，rb基因丢失等因素；外因多见于亚硝胺类致癌物的刺激，而肺癌和黑色素瘤的成因则完全不同；
12.第三、治疗手法不同，膀胱癌由于其自身特点，在药物治疗方面多采用卡介苗免疫治疗、吉西他滨等化疗药物膀胱灌注等，而黑色素瘤、肺癌的治疗手段则与膀胱癌有很大差别。在肺癌、黑色素瘤治疗适用的药物，在膀胱癌中不一定适用，反之在膀胱癌中特效的药物，在肺癌和黑色素瘤治疗中也不一定起效。本发明对比了膀胱癌、结肠癌、胶质瘤等不同类型，开发出针对肌层浸润型膀胱癌的特效用法。而且，本发明对于膀胱癌治疗方面的分子药理机制研究显示，(-)-jorunnamycin a对于膀胱癌的抑制机制与他人在肺癌和黑色素瘤研究报道中的抑癌机制完全不同。
13.鉴于以上的描述，即便是可以用于肺部肿瘤的药物，也未必适用于其它部位的肿瘤，药物的靶向性往往并不呈现一定的规律性。
14.本发明人以从天然手性源l-酪氨酸为原料，经离子氢化反应、baeyer-villiger氧化反应和高选择性的pictet-spengler环化反应等关键步骤，自主合成了(-)-jorunnamycin a，详见参考文献[ruijiao chen；hao liu；xiaochuan chen.asymmetric total synthesis of(-)-jorunnamycins aand c and(-)-jorumycin from l-tyrosine.j.nat.prod.2013,76,1789-1795.]。
[0015]
本发明人通过多种对比实验发现，该化合物能够特异性抑制膀胱肿瘤细胞的增殖，特别是对于肌层浸润型的膀胱癌有特效、在动物水平指出了(-)-jorunnamycin a的有效浓度与安全用量，并在分子水平揭示出该化合物的抑癌分子机制。
[0016]
本发明所要重点保护的是，(-)-jorunnamycin a在抑制膀胱肿瘤细胞生长中的应用，尤其是要保护(-)-jorunnamycin a在抑制肌层浸润型膀胱癌细胞生长中的应用。
[0017]
在不同细胞系中，有不同的抑制作用，(-)-jorunnamycin a对于人胚肾细胞h293t、人结肠癌细胞sw480，人胶质瘤细胞u251有一定的抑制作用，但是在400nm浓度下，依然不能完全杀死细胞。但是对于膀胱癌细胞sw780、t24、umuc3、均有较敏感的杀伤作用。其中，sw780为非肌层浸润型膀胱癌细胞株，t24、umuc3为肌层浸润型膀胱癌细胞株。可见，(-)-jorunnamycin a对于膀胱癌，特别是肌层浸润型膀胱癌有特效。
[0018]
(-)-jorunnamycin a的使用浓度为150～400nm之间。本发明人通过研究，结果表明，高于400nm的浓度下，(-)-jorunnamycin a对正常细胞有较大毒性，低于200nm时对正常细胞毒性较小。所以，在(-)-jorunnamycin a用于对抗膀胱癌细胞时，使用的浓度应在200-400nm之间，优选的浓度为200nm，恰好可以完全抑制膀胱肿瘤细胞生长，对正常细胞的影响尚在可接受范围内。
[0019]
通过研究，本发明人还发现，(-)-jorunnamycin a对于肌层浸润型膀胱癌细胞株t24和umuc3的半抑制浓度ic50分别为53～55nm之间和82～85nm之间。
[0020]
更具体的，(-)-jorunnamycin a对于肌层浸润型膀胱癌细胞株t24和umuc3的半抑制浓度ic50分别为54.1nm和83.6nm。
[0021]
(-)-jorunnamycin a在使用时，将其溶于有机溶剂中，有机溶剂的浓度为5～
30mmol/l，优选的为20mmol/l。
[0022]
上述的有机溶剂为甲醇、乙醇、二甲基亚砜中的任一种，当然还可以是其它的一切安全且能有效的将(-)-jorunnamycin a溶解的溶剂，并不仅限于以上的种类。
[0023]
(-)-jorunnamycin a在抑制膀胱肿瘤细胞生长中的应用方法是：将(-)-jorunnamycin a溶于5～30mmol/l的有机溶剂中，然后使(-)-jorunnamycin a的浓度保持在150～400nm注射给药。
[0024]
更具体的，(-)-jorunnamycin a在抑制膀胱肿瘤细胞生长中的应用方法，包括以下的步骤：
[0025]
(1)配制(-)-jorunnamycin a
[0026]
将(-)-jorunnamycin a溶于5～30mmol/l甲醇、乙醇、二甲基亚砜中的任一种有机溶剂中；
[0027]
(2)使(-)-jorunnamycin a的浓度保持在150～400nm注射给药。
[0028]
本发明的有益效果在于：
[0029]
(1)本发明提供了一种来源于海洋生物提取物的小分子(-)-jorunnamycin a在抑制膀胱肿瘤细胞生长中的新的用途，这种物质(-)-jorunnamycin a能够特异性抑制膀胱肿瘤细胞的增殖，特别是对于肌层浸润型的膀胱癌有特效，在200nm的浓度下，即可完全抑制膀胱肿瘤细胞生长，对正常细胞的影响尚在可接受范围内；
[0030]
(2)通过对小鼠毒性及疗效研究，结果表明600μg/kg的药物，对于小鼠无明显致死毒副租用，并且对于移植到裸鼠的膀胱肿瘤有良好的抑制作用。这也进一步的证实了本发明所提供的(-)-jorunnamycin a具有抑制膀胱癌细胞增长的特效，同时还具有安全无毒的特点。
附图说明
[0031]
图1为(-)-jorunnamycin a对于不同类型细胞的抑制作用；
[0032]
图2为(-)-jorunnamycin a对肌层浸润型膀胱癌的抑制作用；
[0033]
图3为(-)-jorunnamycin a抑制肌层浸润型膀胱癌细胞t24 cell的分裂能力；
[0034]
图4为(-)-jorunnamycin a对肌层浸润型膀胱癌细胞生长密度及形态方面的影响；
[0035]
图5为(-)-jorunnamycin a小鼠毒性、毒理研究结果；
[0036]
图6为(-)-jorunnamycin a对小鼠模型膀胱肿瘤的抑制作用图；
[0037]
图7为(-)-jorunnamycin a通过靶向egfr起到治疗膀胱癌的作用的药理机制。
具体实施方式
[0038]
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
[0039]
实施例1
[0040]
本发明所提及的海洋生物提取物的小分子(-)-jorunnamycin a，具有以下的化学结构式：
[0041][0042]
关于(-)-jorunnamycin a对于不同类型细胞的抑制作用，本发明人进行了如下的实验：
[0043]
分别取人胚肾细胞h293t、人结肠癌细胞sw480、人胶质瘤细胞u251、膀胱癌细胞sw780、膀胱癌细胞t24、膀胱癌细胞umuc3作为样本，按照初始密度为25％培养至96孔板中，待密度生长至50～55％时，加入不同量的(-)-jorunnamycin a使其终浓度分别为0、20、40、60、80、100、200、300、400nm。
[0044]
培养24小时后，以cck8方法检测细胞剩余活力，并作图(以不加(-)-jorunnamycin a的细胞活性作为100％)。
[0045]
附图1为(-)-jorunnamycin a对于人胚肾细胞h293t、人结肠癌细胞sw480、人胶质瘤细胞u251、膀胱癌细胞sw780、膀胱癌细胞t24、膀胱癌细胞umuc3的抑制作用图；
[0046]
从图1可以看出，在不同细胞系中，(-)-jorunnamycin a有着不同的抑制作用，(-)-jorunnamycin a对于人胚肾细胞h293t、人结肠癌细胞sw480，人胶质瘤细胞u251有一定的抑制作用，但是在400nm浓度下，依然不能完全杀死细胞。
[0047]
但是(-)-jorunnamycin a对于膀胱癌细胞sw780、t24、umuc3均有较敏感的杀伤作用。其中，sw780为非肌层浸润型膀胱癌细胞株，t24、umuc3为肌层浸润型膀胱癌细胞株。可见，(-)-jorunnamycin a对于膀胱癌，特别是肌层浸润型膀胱癌有特效。
[0048]
以上的结果表明，(-)-jorunnamycin a对于膀胱癌细胞的抑制效果要明显好于其他癌细胞。
[0049]
实施例2
[0050]
实施例2中，本发明人进一步考察了(-)-jorunnamycin a对肌层浸润型膀胱癌的抑制作用，其具体的步骤如下：
[0051]
取细胞样本，按照初始密度为25％培养至96孔板中，待密度生长至50-55％时，加入0-200nm浓度的(-)-jorunnamycin a，培养24小时后，用cck8方法检测细胞剩余活力，并计算(-)-jorunnamycin a对于肌层浸润型膀胱癌细胞株t24的半抑制浓度ic50为54.1nm，对于肌层浸润型膀胱癌细胞株umuc3的半抑制浓度ic50为83.6nm，如附图2所示。
[0052]
实施例3
[0053]
本发明进一步考察了(-)-jorunnamycin a抑制肌层浸润型膀胱癌细胞t24 cell的分裂能力，结果如附图3所示。
[0054]
具体的方法如下：癌细胞的主要特征之一就是快速有丝分裂，细胞有丝分裂的前提是dna复制。所以对dna复制速率的影响，是评价药物抑癌效果的重要实验手段。本发明采用edu试剂盒法(edu试剂盒购自碧云天公司)检测(-)-jorunnamycin a对于膀胱癌细胞dna复制的抑制效果。从附图3中的结果可以看出，(-)-jorunnamycin a可以有效的呈浓度依赖性的方式抑制膀胱癌细胞的dna合成。
[0055]
实施例4
[0056]
实施例4主要考察了(-)-jorunnamycin a对肌层浸润型膀胱癌细胞生长密度及形态方面的影响，结果如附图4所示。
[0057]
具体的考察方法如下：细胞形态是反映细胞生存及生长状况的重要表型，本研究中，在12孔板中，按15％的初始密度接种细胞，当细胞密度增长为20％时，加入不同浓度的(-)-jorunnamycin a，24小时后在倒置显微镜下观察细胞密度与形态，并拍照记录。
[0058]
由图4可见，随着(-)-jorunnamycin a浓度的升高，膀胱癌细胞t24cells的密度及形态呈现浓度依赖性变化。
[0059]
实施例5
[0060]
关于(-)-jorunnamycin a小鼠毒性、毒理研究，如附图5所示。
[0061]
小鼠模型采用balb/c nude mice，7～8周龄的小鼠，分别研究600μg/kg、800μg/kg、1000μg/kg、1500μg/kg的小鼠，其连续给药的死亡率；具体如下：
[0062]
给药量600μg/kg小鼠，2天给药一次，3次连续给药死亡率为0％；
[0063]
给药量800μg/kg小鼠，2天给药一次；3次连续给药死亡率为25％；
[0064]
给药量1000μg/kg小鼠，2天给药一次，3次连续给药死亡率为25％。
[0065]
给药量1500μg/kg小鼠，2天给药一次，3次连续给药死亡率为50％。
[0066]
以上的结果提示，该(-)-jorunnamycin a虽然对膀胱癌有特效，但是有一定的细胞毒性，需要在合理的浓度下使用。结合药效与安全性可以得出：给药剂量为≤600μg/kg为安全剂量。
[0067]
实施例6
[0068]
(-)-jorunnamycin a对小鼠模型膀胱肿瘤的抑制作用
[0069]
小鼠模型采用balb/c nude mice，皮下荷瘤采用t24膀胱肿瘤细胞，小鼠为5周龄时在皮下注射107个t24细胞，待皮下荷瘤生长至100mm3时，开始给药(-)-jorunnamycin a，采用腹腔注射的给药方式，给药量为600μg/kg，给药频率为2天一次，给药时间为24天。
[0070]
从附图6中的结果可以看出，(-)-jorunnamycin a对于裸鼠移植膀胱肿瘤有很显著的抑制能力，并且小鼠在给药期间未发生死亡。
[0071]
实施例7
[0072]
为了研究(-)-jorunnamycin a的药理分子机制，发明人借助通过高通量蛋白组学，比较(-)-jorunnamycin a处理组中蛋白质表达差异变化，实验以肌层浸润型膀胱癌细胞系t24作为研究模型，采用tmt定量蛋白质组学技术开展研究，发现(-)-jorunnamycin a主要通过靶向egfr酪氨酸激酶通路发挥抑癌作用。
[0073]
更重要的是，该(-)-jorunnamycin a直接靶向egfr、axl和bcl-xl，有望解决egfr抑制剂耐药问题。
[0074]
附图7中，深色方框表示(-)-jorunnamycin a可以显著下调的分子。