阿帕替尼在制备治疗多发性硬化症药物的用途

1.本发明属于医药领域，具体而言，本发明涉及阿帕替尼在制备治疗多发性硬化症药物的用途。


背景技术：

2.多发性硬化症(multiple sclerosis，ms)是一种中枢神经系统(central nervous system，cns)的不可治愈性和渐进性的炎症性疾病，其神经病理学特征包括炎症性脱髓鞘、慢性轴突损伤以及神经退行性变
1.。全球有两百万人受到该疾病的影响，典型的临床症状包括但不限于视神经炎引起的单眼视野、横断性脊髓炎引起的肢体无力或感觉丧失、脑干障碍所致复视以及小脑病变导致共济失调
2.。
3.因与ms具有相似的神经病理学特征，实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，eae)是用来研究ms最为普遍的动物模型，能够帮助定义ms发展进程中所发生的免疫反应
[3,4]
。eae诱导完成后8-10天，小鼠便会开始出现尾部无力、走路不稳、四肢瘫痪等症状，根据这些症状可以给小鼠做出疾病评分，从而评估小鼠发病的严重程度。eae模型小鼠发病过程中，自身反应性t细胞在外周被活化诱导，随后迁移至中枢神经系统识别由局部抗原提呈细胞所提呈的抗原，攻击表达此类抗原的组织，从而造成神经组织的损伤
[5]
。研究表明，eae是由th1和th17细胞所介导
[6]
，这两种细胞均能够引起疾病的发生。
[0004]
阿帕替尼(apatinib)是新一代高选择性血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2，vegfr2)酪氨酸激酶抑制剂，这会在细胞水平阻断vegfr2下游的信号转导
[7]
。第三期临床试验表明，其已被证实是患有晚期胃癌患者的安全有效的治疗药物。
[0005]
th1与th17是cd4+辅助性t细胞的两个细胞亚群，前者主要分泌ifn-γ，后者主要分泌il-17a，通过流式细胞术、酶联免疫吸附试验、实时荧光定量pcr检测这些细胞因子分泌的量，就可定义th1和th17的细胞比例。
[0006]
目前，尚未有阿帕替尼在制备治疗多发性硬化症药物的用途的报道。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供阿帕替尼在制备治疗多发性硬化症药物的用途。
[0008]
本发明的技术方案概述如下：
[0009]
阿帕替尼在制备治疗多发性硬化症药物的用途。
[0010]
有益效果
[0011]
1.相比于对照组，aptinib选定给药浓度对小鼠无毒性作用；
[0012]
2.根据eae模型发病的临床评分规则，相比于对照组，apatinib治疗组eae模型小鼠的发病程度明显降低；
pbs；将研磨液收集于15ml离心管进行离心，离心条件为4℃、1600rpm、5min，离心结束后弃去上清，用10ml 1x pbs重悬细胞沉淀，随后可进行细胞计数，根据计数结果取1x10^6个细胞进行流式细胞术染色。
[0055]
实施例4
[0056]
中枢神经系统单个核细胞悬液制备(脑和脊髓)：
[0057]
首先，用10x pbs将percoll原液配制为90％percoll溶液，即percoll工作溶液；对小鼠进行解剖，取小鼠脑和脊髓，将两者置于同一玻璃研磨器，往玻璃研磨器中加入3ml 1x pbs，然后对脑和脊髓进行研磨；将研磨液收集至15ml离心管，用1x pbs补至7ml，然后加入3ml percoll工作液，此时液体体积为10ml，为溶液a；用1x pbs将percoll工作溶液配制成70％浓度的percoll工作溶液，为溶液b。取3ml溶液b加到一个15ml离心管，随后用电动移液枪将全部溶液a缓慢地沿壁加入到3ml溶液b上层，移液过程中保持上下分层；移液完成后16℃、630g、30min进行离心，并且离心机启动和制动调制为0；离心结束后，缓慢取出离心管以保持分层状态，所需单个核细胞在中间白膜层。
[0058]
实施例5
[0059]
流式细胞术：
[0060]
实施例2、3、4小鼠各组织的单细胞悬液制备完成后，
[0061]
用添加了10％胎牛血清(foetal bovine serum，fbs)和1％青霉素/链霉素混合液的rpmi1640完全培养基在96孔平底板进行细胞铺板，每个孔加入细胞刺激剂(cell activation cocktail，cac)，细胞刺激剂与培养基的体积比为1：1000，刺激4小时，刺激结束后将细胞收集到流式管中,1x106个细胞/管；
[0062]
细胞收集后，于4℃、1600rpm、5min离心，弃去上清，
[0063]
每个流式管加入100μl的nir死活染料稀释液进行细胞染色以排除死细胞，在4℃避光15min进行染色；(nir死活染料稀释液的配制：按体积比为1000：1的比例，将1x pbs与nir死活染料混合制成)
[0064]
染色结束后每个管加入1ml 1x pbs，在4℃、1600rpm、5min离心，弃去上清；
[0065]
每个流式管加入50μl第一种抗体稀释液。
[0066]
第一种抗体稀释液是按体积比为200：1的比例，将1x pbs与流式抗体(cd45::fitc和cd4::pe-cy7等体积)混合，得到第一种抗体稀释液；
[0067]
按固定/破膜试剂盒说明书对细胞进行固定和破膜；破膜结束后，每个流式管加入50μl第二种抗体稀释液；所述第二种抗体稀释液是按体积比200：1的比例，将1x pbs与流式抗体(ifn-γ::apc和il-17a::pe等体积)混合，得到第二种抗体稀释液，
[0068]
每个流式管加入50μl第二种抗体稀释液。4℃避光30min，染色结束后每个管加入1ml 1xpbs，在4℃、1600rpm、5min离心。离心结束后弃去上清，用200μl 1x pbs重悬细胞，上机检测，流式数据用flowjo软件进行分析。
[0069]
实施例6
[0070]
评估药物毒性
[0071]
选取6只周龄为6周的c57bl/6雌鼠进行造模。
[0072]
造模成功后，随机分为对照组和给药组，每组3只小鼠；给药组按100mg/kg/只剂量进行灌胃给药200μl，对照组灌胃给予200μl的1x pbs，过程持续7天并且每天记录小鼠体重
(图1a)。而后于第8天取两组小鼠脾脏、肝脏、肾脏进行体外称重并记录(图1b、图1c、图1d)，并且通过流式细胞术检测两组小鼠各自脾脏中的cd4+t cells比例和绝对数(图1e、图1f)、cd19+b cell比例和绝对数(图1g、图1h)。(n＝3只/组，mean
±
sem)
[0073]
实施例7
[0074]
评估药物治疗效果
[0075]
选取12只周龄为6周的c57bl/6雌鼠进行造模。
[0076]
造模成功后，随机分为对照组和给药组，每组6只小鼠；给药组按100mg/kg/只剂量进行灌胃给药200μl，对照组灌胃给予200μl的1x pbs，过程持续27天并且每天评估小鼠临床评分以及记录体重(图2a、图2e)；得到小鼠评分图后，计算两组评分曲线的曲线下面积以及评分峰值均数，进行统计学差异比较(图2b、图2c)；将两组小鼠按发病严重程度分级(评分《1分，无疾病；评分1-2分，轻微疾病；评分≥2.5分，严重疾病)，进行绘图(图2d)。(n＝6只/组，mean
±
sem)
[0077]
实施例8
[0078]
评估药物治疗效果
[0079]
选取20只周龄为6周的c57bl/6雌鼠进行造模。
[0080]
造模成功后，随机分为对照组和给药组，每组10只小鼠；给药组按100mg/kg/只剂量进行灌胃给药200μl，对照组灌胃给予200μl的1x pbs。当小鼠处于即将发病的状态时，即造模后第7天，从两组各取出5只小鼠，通过解剖获取小鼠的脾脏和引流淋巴结，而后制备单细胞悬液，将细胞体外刺激后，进行流式细胞术染色从而检测两组小鼠脾脏和引流淋巴结的th1、th17细胞比例(图3)。当剩余小鼠处于发病高峰期的状态时，即造模后第18天，将两组剩余小鼠全部解剖获取小鼠的脾脏、引流淋巴结以及中枢神经系统，而后制备单细胞悬液，将细胞体外刺激后，进行流式细胞术染色从而检测两组小鼠脾脏、引流淋巴结以及中枢神经系统的th1、th17细胞比例(图4)(n＝10只/组，mean
±
sem)
[0081]
相比于对照组，aptinib选定给药浓度对小鼠无毒性作用，如图1；
[0082]
根据eae模型发病的临床评分规则，相比于对照组，apatinib治疗组eae模型小鼠的发病程度明显降低，如图2；
[0083]
apatinib缓解eae模型小鼠的发病是通过降低小鼠体内th1细胞的比例，如图3、4。
[0084]
参考文献
[0085]
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‑‑
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[0090]
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[0091]
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