基于丝素/海藻纤维的具有生物活性的复合透明水胶体敷料及其制备方法

1.本发明涉及生物医药敷料技术领域，具体涉及一种基于丝素/海藻纤维的具有生物活性的复合透明水胶体敷料及其制备方法。


背景技术：

2.随着材料学和生物医学的发展，皮肤伤口敷料发生了巨大的变化，以医用脱脂棉纱布、棉球、凡士林纱布等为代表的传统敷料已经不能满足患者对于伤口护理的要求；因此，新型伤口敷料应运而生，并被积极用于临床。其优点为加速创面修复，减少伤口感染，缩短病程，减轻患者痛苦，相应地节省患者医疗经费。基于这一背景，多功能新型皮肤敷料的开发逐渐成为了医疗和材料领域的研究热点。
3.随着新型伤口敷料的出现和不断发展，越来越多的组织工程领域引入了基于天然柔性聚合物的新型伤口敷料，其中以丝素蛋白(silkfibroin，简称sf)这种天然纤维蛋白为代表，受到了众多研究者的青睐。丝素蛋白是一种可从蚕丝、蛛丝等天然生物材料中提取得到的高分子蛋白，其机械强度高、弹性好、生物相容性优良、可生物降解等特征非常适用于制备人工皮肤；此外，通过不同的制备方式如电纺、盐析、超声处理、冷冻干燥等，可以将丝素蛋白制备成薄膜、凝胶、微球、多孔支架等多种表现形式的材料。
4.虽然基于丝素蛋白的伤口敷料深受生物医学工程以及材料学学者们的青睐，但是暂时还没有一种单纯基于丝素蛋白的敷料可以满足理想伤口敷料的所有要求，它们或多或少存在某些缺陷，如脆性较大、延展性较差等。为了解决单一高聚物存在的某些弊端，通常选择将其与另一种高聚物共混从而达到对材料复杂性能的要求。
5.海藻酸钠(sodiumalginate,sa)是从藻类中提取的一种天然多糖化合物，具有很好的生物相容性、成本低、无毒性。由于其能与含有阳离子(如ca
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)的物质迅速结合并生成凝胶状物质而广泛应用于组织工程。通过离子交联制备的藻酸盐类敷料易折叠和敷贴、吸湿性能好，然而，单一的海藻酸敷料在应用中仍存在诸多问题，如生物降解缓慢、机械性等较差等严重制约了海藻酸敷料在伤口组织工程中的应用和发展。
6.由于单一生物材料或多或少都存在其固有的缺陷，因此复合生物敷料势必是新型生物敷料研发的一大趋势；基于丝素和海藻的新型生物敷料具有众多相似(良好的生物相容性、来源丰富价格低)及互补的性质(基于丝素材料机械性能可观但是材料脆性大、延展性差，保水能力差；海藻酸钠材料机械性能较差，柔韧性较好，吸水能力强)。


技术实现要素：

7.本发明以丝素蛋白和海藻酸钠为原材料，通过一系列工艺及方法，研发出一种新型的、对人体无毒副作用的、具有好的透明度、能促进伤口抗菌及愈合的新型皮肤敷料。基于此，本技术保护如下技术方案：
8.一种基于丝素/海藻纤维的具有生物活性的复合透明水胶体敷料的制备方法，其
特征在于，包括如下步骤：
9.1)制备丝素纤维溶液：将蚕茧脱胶得到丝素蛋白纤维，洗涤、烘干得丝素蛋白，采用氢氧化钠/尿素混合溶液溶解丝素蛋白，将溶出液装入透析袋透析去除杂质离子，取出透析液离心收集上清液即得丝素纤维溶液；
10.2)制备丝素纤维溶液与海藻酸钠的混合溶液：取步骤1)得到的丝素纤维溶液加入海藻酸钠，混合溶液中丝素纤维与海藻酸钠的质量比为1～2﹕1～2；
11.3)加入生物活性药物：在步骤2)制得的混合溶液中加入尿囊素，加入量为每毫升混合溶液加入1～6mg尿囊素，得到敷料复合溶液；
12.4)取步骤3)得到的敷料复合溶液，采用浇筑法制备复合敷料，即得。
13.作为优选地，步骤2)中混合溶液中丝素纤维与海藻酸钠的质量比为1﹕1。
14.作为优选地，所述步骤2)中丝素纤维溶液与海藻酸钠的混合溶液为超纯水溶液。
15.作为优选地，步骤2)中先将海藻酸钠溶解于超纯水中得到海藻酸钠溶液，然后取丝素纤维溶液与海藻酸钠溶液进行混合。
16.作为优选地，步骤3)中尿囊素的加入量为每毫升混合溶液加入2～5mg或者4mg尿囊素。
17.步骤4)中将步骤3)得到的敷料复合溶液加入模具中，浇筑，待模具中复合体系质量不再变化后加入氯化钙溶液反应得到复合膜，使复合膜脱模，置于紫外光灯下照射4～6h，即得本发明的复合透明水胶体敷料。
18.所述步骤4)中，每5ml敷料复合溶液加入2ml w/v浓度为2％的氯化钙溶液。
19.所述步骤1)的具体过程为：将蚕茧剪碎后进行清洗去除杂质，采用碳酸钠溶液脱胶得到丝素蛋白纤维，将丝素蛋白洗涤后烘干备用，取烘干后的丝素蛋白置入氢氧化钠/尿素混合溶液中溶解；溶解结束后将溶出液装入预处理后的透析袋中透析，透析结束后将袋内的液体收集于冰浴中超声处理后离心收集上清液即得丝素纤维溶液。
20.所述步骤1)中透析袋使用前需进行预处理：将透析袋在碳酸氢钠2％w/v/1mmol/l edta混合液中煮沸10分钟，取出清洗后再于1mmol/l、ph 8.0edta溶液中煮沸10分钟后将其清洗后液封备用。
21.本发明还保护一种基于丝素/海藻纤维的具有生物活性的复合透明水胶体敷料，是采用前述任一种所述的方法制备得到的敷料。
22.本发明的有益效果是：
23.1)新型复合敷料制备步骤简单，反应条件温和、操作简易，适用于大规模批量生产。本发明选取海藻酸钠天然高分子多糖与丝素蛋白进行改性复合，制备所得新型复合敷料具备亲水性好、吸渗能力强的优点，能够很好吸收多余渗出液，同时吸水溶胀后也有利于进一步换药。很好地克服了现有商用敷料在伤口处产生的炎症反应以及在移除时给患者带来的二次伤害等一系列问题。
24.2)本发明采用两种天然高分子化合物作为原材料，同时载入具有促进伤口愈合、软化角质的尿囊素天然活性物质。制得的敷料不仅具有良好的生物相容性能，能够很好地与伤口处组织亲和，不会引起排异反应；同时具有良好的生物可降解性、机械性能、粘附性以及透明性，能够在组织恢复之前很好发挥屏障作用、稳定贴附作用、止血作用以及对伤口愈合情况的实时观察。
25.3)本发明的复合敷料在丝素纤维与海藻酸钠两种组分含量相当的情况下呈现出相对最优的性能，其中两种天然纤维的结合发挥了最大程度的协同作用，在弥补各自缺点的同时保留了各自的优点。进一步实验评估了本发明复合敷料的体外和体内生物活性：基于水胶体敷料的组织粘附，止血特性已在大鼠肝出血模型中得到例证；细胞毒性试验表明制备的敷料能够促进nih-3t3成纤维细胞的生长和增殖；在小鼠全层皮损模型中应用新型复合敷料，与空白对照组相比，小鼠伤口面积愈合速度加快，病程缩短。
附图说明
26.图1是制备本发明复合敷料的流程图。
27.图2是不同配比制备的复合敷料的扫描电镜图。
28.图3是不同配比制备的复合敷料的傅里叶红外光谱图。
29.图4是按照不同配比制备的复合敷料的应力应变拉伸曲线测试图。
30.图5是按照不同配比制备的复合敷料在可见光范围内的透光率曲线图。
31.图6是按照不同配比制备的复合敷料在含有xiv胰蛋白酶的pbs溶液中的降解曲线图.
32.图7是本发明制备的复合敷料中的最优配比f1a1应用于小鼠肝脏出血模型的中的出血量的柱状图。
33.图8是本发明制备的复合敷料中的最优配比f1a1的细胞毒性测试中小鼠成纤维细胞的细胞活力的柱状图。
34.图9是本发明制备的复合敷料中的最优配比f1a1应用于小鼠全层皮损的伤口愈合过程中伤口剩余面积的柱状图。
35.图10是不同浓度尿囊素制备的复合敷料的透光率检测结果。
36.图11是不同浓度尿囊素制备的复合敷料应用于小鼠全层皮损的伤口愈合过程中伤口剩余面积的柱状图。
具体实施方式
37.下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
38.下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；各实施例中所用生物、化学试剂，如无特殊说明，均为常规试剂，均可通过商购获得。
39.实施例1丝素纤维溶液的制备
40.选取优质蚕茧剪碎后进行超声清洗去除杂质，随后先后两次置入2l浓度为10wt％的碳酸钠溶液中煮沸三十分钟脱胶得到丝素蛋白纤维，将脱胶的丝素蛋白用去离子水洗涤后烘干备用，待烘干后取3g丝素蛋白置入配制好的氢氧化钠/尿素混合溶液(9g氢氧化钠和12g尿素加入超纯水搅拌中并定容至100ml后放入-12℃冰箱)，对丝素进行搅拌后放回冰箱中溶解，一共溶解三天，其中每隔半天将烧杯取出搅拌20分钟后放回冰箱。
41.溶解结束后将溶出液装入预处理后的透析袋(截留分子量7000)并放入2l超纯水中透析三天去除杂质离子，这过程每12小时换一次超纯水。经过3天透析后将袋内的白色液体收集于300w冰浴中超声30分钟后装离心管以5000rmp速度离心10分钟后收集上清液即得丝素纤维溶液。其中，透析袋使用前需进行预处理：将透析袋在足量碳酸氢钠2％(w/v)/
edta(1mmol/l)混合液(ph 8.0)中煮沸10分钟，取出清洗后再于足量的edta(1mmol/l，ph 8.0)溶液中煮沸10分钟后将其清洗后液封备用。
42.实施例2新型复合透明水胶体敷料的制备
43.1、准备工作：调节实施例1提取得到的丝素纤维溶液的浓度为2％(w/v)并置于4℃冰箱中备用；同时配置浓度同样为2％(w/v)的海藻酸钠溶液：将2g海藻酸钠粉末(生工，cas:[9005-38-3])加入50ml超纯水中并于50℃磁力搅拌机上以500rpm的转速搅拌6～8h溶解后定容至100ml，于4℃冰箱中备用。
[0044]
2、制备：制备流程如图1所示，将准备好的丝素纤维溶液与海藻酸钠溶液以不同的体积比(3:1、1:1、1:3)均匀混合为三份溶液并保持每份溶液总体积为20ml，将按照前述比例制备的复合敷料命名为f3a1、f1a1、f1a3，随后向复合敷料混合溶液中按照4mg/1ml的比例加入加速伤口愈合的生物活性药物尿囊素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，cas:[97-59-6])并充分溶解。随后在三份溶液中分别取5ml复合溶液加入4cm
×
3cm的长方形模具中浇筑，待模具中复合体系质量24小时不再变化后加入2ml浓度为2％(w/v)的氯化钙溶液，钙离子诱导海藻酸钠纤维的长链交联，由于丝素纤维与海藻纤维充分均匀混合，海藻纤维在相互交联的同时与丝素穿插交联形成类似中国结的复合交联体系，能够将两种高分子纤维整合起来的同时顺利脱模，经过10分钟左右的交联，贴合在模具上的复合膜自动脱模，随后将不同构成比的复合膜取出置于紫外光灯下照射(波长254～365nm)4～6h后封存备用。
[0045]
在实验过程中，发明人发现，在复合溶液中的溶剂挥发基本完毕时(本实验中是在模具中浇筑后24小时后，复合体系的质量不再变化)，加入氯化钙交联效果最好，因为在复合溶液中溶剂较多时，纤维排列松散，在溶剂含量仍然较多时加氯化钙进行交联得到的复合膜较为松散、紧致度不够。
[0046]
实施例3复合敷料最优配比探究及其生物活性验证
[0047]
对实施例2制得的三种不同配比制备的复合敷料进行各项表征及测试如扫描电镜测试、透光率测试、拉伸测试、降解测试以及透气率测试，通过对比选出性质最适作为皮肤敷料的一种配比即当丝素海藻含量相当时发现复合敷料具备作为伤口敷料的最佳性质，因此以此为基础进一步进行体内外生物学应用实例如细胞毒性实验、止血实验以及小鼠全层皮损模型验证其生物学活性。
[0048]
一、复合敷料扫描电镜观察
[0049]
首先将不同配比的复合敷料在-80℃下冻干24小时后对其表面进行镀金，随后在6kv的电压下进行扫描电镜观察，如图2所示，其中(a)、(b)、(c)分别为为f3a1、f1a1、f1a3，可以观察到在三个比例中，f3a1样本表面粗糙伴随有裂痕，而f1a1、f1a3样本表面形貌则相对均一稳定，说明海藻的加入起到稳定体系的作用。
[0050]
二、复合敷料的傅里叶红外光谱图
[0051]
按照不同配比制备的复合敷料的傅里叶红外光谱图如图3所示，其中(a)、(b)、(c)分别为为f3a1、f1a1、f1a3，可以观察到随着海藻的加入复合敷料中的酰胺i带峰值强度逐渐降低，意味着复合膜中的β折叠含量下降，复合膜的刚性降低，更加适用于伤口敷料。
[0052]
三、复合敷料的应力应变拉伸曲线测试
[0053]
将按照不同配比制备的复合敷料制备成大小相同的样品(5厘米
×
1厘米尺寸)，以
2毫米/分钟的速度通过万能力学试验机得到复合敷料的应力应变曲线数据，如图4所示，其中(a)、(b)、(c)分别为为f3a1、f1a1、f1a3，可以观察到复合敷料f1a1满足人正常皮肤的力学性能(应力2.5～16mpa，应变70％左右)。
[0054]
四、复合敷料在可见光范围内的透光率
[0055]
将按照不同配比制备的复合敷料置于孔板中，并于酶标仪中进行吸光度测试，将各个样本对应的吸光度按照比尔朗伯定律转换为透光率即得，结果如图5所示，其中(a)、(b)、(c)分别为为f3a1、f1a1、f1a3，可以根据图片观察到f1a1、f1a3样品在可见光范围内具备较好透光率，可以实现对伤口愈合程度的实时观察。
[0056]
五、复合敷料的降解测试
[0057]
首先将不同配比的复合敷料在-80℃下冻干24小时后称重，将其置于2ml含有2单位/毫升xiv胰蛋白酶的pbs溶液中，并于摇床上处理。在特定时间节点取出复合敷料重新于-80℃下冻干称重，根据降解后的质量及原始质量作出降解图。结果如图6所示，其中(a)、(b)、(c)分别为为f3a1、f1a1、f1a3，可以观察到f3a1样本降解速率过快，而f1a3样品降解速率过慢同时可降解程度较低，只有f1a1具备一个适中降解速率满足伤口慢性愈合的周期。六、f1a1应用于小鼠肝脏出血模型
[0058]
首先使用250μl浓度为4％(w/v)的水合氯醛溶液对小鼠进行腹腔注射麻醉，并将小鼠以仰卧位置于角度为30度左右的斜木板上，随后进行开腹手术暴露出小鼠的肝脏，在保持肝脏完整的情况下将肝脏置于滤纸上，随后使用规格为20g的针头将肝脏刺破，分别在伤口处进行不处理和复合敷料覆盖处理，通过测量滤纸上的出血量检测复合敷料的止血性能。图7是f1a1应用于小鼠肝脏出血模型的中的出血量的柱状图，由图中出血量的结果可以发现，不对小鼠做任何的处理的空白组中小鼠于滤纸上的平均出血量为800mg左右，而将复合敷料应用于小鼠肝脏出血模型的一组中小鼠于滤纸上的平均出血量仅仅为200mg左右，两组在出血量上具有显著性差异，说明制备的复合敷料能够很好达到止血的目的。
[0059]
七、f1a1的细胞毒性测试
[0060]
将制备的复合皮肤敷料f1a1浸泡于细胞完全培养基中，分别对nih3t3成纤维细胞进行正常完全培养基培养以及复合敷料浸出液培养(每组重复三次)，一段时间后利用cck-8对细胞进行计数测量观察使用复合敷料浸出液培养基培养的细胞增殖情况。图8是f1a1的细胞毒性测试中小鼠成纤维细胞的细胞活力的柱状图，可以看出相较于完全培养基，复合敷料浸出液培养的细胞活性高于完全培养基组，说明本发明制备的复合敷料不仅不具备细胞毒性，反而可以有效促进小鼠成纤维细胞的增殖。
[0061]
八、f1a1应用于小鼠全层皮损的伤口愈合
[0062]
首先使用250μl浓度为4％(w/v)的水合氯醛溶液对小鼠进行腹腔注射麻醉，随后使用活检打孔器在小鼠背部造一个直径8mm左右的伤口，并分别在伤口处进行不处理和制备的复合敷料处理，图9为在伤口形成后的第4、8、12天三个时间节点的小鼠伤口剩余面积的柱状图，可以看到应用了本发明选取的复合敷料后，相较于空白对照组，小鼠伤口面积收缩速度加快，病程缩短。
[0063]
实施例4不同尿囊素添加量实验
[0064]
本发明在前期实验中对尿囊素的最佳添加量也做了研究，按照实施2中的方法制备f1a1型复合敷料(即配制时丝素纤维与海藻酸钠的质量比为1﹕1)，对尿囊素的添加量设置
了三种不同的添加量：1mg/1ml、4mg/1ml、7mg/1ml复合敷料混合溶液，即设置每毫升复合敷料混合溶液添加1mg、4mg、7mg尿囊素的三种不同比例实验。
[0065]
取制得的复合敷料，进行检测实验。
[0066]
进行透光率检测以及小鼠全层皮损伤口模型预实验以观察所制备的敷料的相对最适载药量。通过载有不同浓度尿囊素敷料的透光率检测(结果如图10所示)可以观察到，尿囊素含量对复合敷料透光率有一定影响，当载药量为7mg/ml时，复合敷料在可见光范围内的透光率急剧下降，可能的原因时因为尿囊素浓度过高，使得部分晶体析出复合敷料表现出较差的透光率；相比之下，尿囊素浓度为1mg/ml以及4mg/ml的复合敷料则表现出较好的光透过率，由于本发明制备的是易于观察伤口愈合情况的透明敷料，因此选择浓度1mg/ml以及4mg/ml验证不同浓度下的小鼠模型的伤口愈合情况，实验方法如下：
[0067]
首先使用250μl浓度为4％(w/v)的水合氯醛溶液对小鼠进行腹腔注射麻醉，随后使用活检打孔器在小鼠背部造一个直径8mm左右的伤口，并分别在伤口处进行不同尿囊素浓度的复合敷料处理小鼠伤口，并在处理后的第0、4、8、12天对小鼠伤口处于同一水平高度进行摄像记录，通过image j软件计算不同时间节点的小鼠伤口面积，将各个时间节点的伤口面积除以第0天时小鼠伤口面积做出柱状图。结果如图11所示，可以看到在每个不同的时间节点中，在使用了尿囊素浓度为4mg/ml的复合敷料组中小鼠的伤口愈合情况均好于1mg/ml，通过预实验的结果，选取4mg/ml作为载药浓度进行正式试验。