一种柴胡当归薄荷复方提取物及其制备方法和用途

1.本发明属于医药领域，具体涉及一种柴胡当归薄荷复方提取物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.抑郁症一种常见情感精神障碍，全球患病率约为4.4％，已经成为日益严重的公共卫生问题。目前临床主要使用的抗抑郁药如氟西汀，阿米替林、文拉法辛等起效慢，副作用较多，服药周期长，且有近40％的患者无法完全康复，甚至近20％的患者对多种抗抑郁药治疗不敏感，寻找高效的抗抑郁药物已成为神经/精神药理学主要研究方向之一。传统中医药在抑郁症的治疗中具有独特的优势，中医学认为抑郁症多是由情志所伤造成的脾失健运、肝失疏泄的病理状态，属于中医学“郁证”范畴。逍遥散为疏肝健脾的经典方剂，首载于宋朝《太平惠民和剂局方》，具有疏肝解郁、调和肝脾、养血健脾之功效，实验研究及临床应用均证实其有确切的抗抑郁效果。
3.柴当薄组(chaidangbozu)是实验室前期基于逍遥散功效拆方及均匀设计研究获得的具有抗抑郁作用的精简方剂，简称cdb，已获得国家发明专利授权(专利号：zl201410315781.3，一种抗抑郁的药物组合物及其制备方法和用途)。研究表明柴当薄组水煎液能通过影响5-ht受体平衡、激活bdnf通路及抑制hpa轴过度激活来显著抑制cums模型小鼠的抑郁样行为，并具有与逍遥散相当的抗抑郁作用。
4.运用不同极性有机溶剂萃取中药水煎液或醇提物是中药复方研究的经典方法之一。有效部位能在保持复方整体性的前提下富集复方有效成分。采用上述方法研究出柴当薄组抗抑郁的有效成分，对其药物应用以及揭示复方物质基础及作用机制具有重要应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种柴胡当归薄荷复方提取物及其制备方法和用途。
6.本发明提供了一种柴胡当归薄荷复方提取物，所述提取物中含有阿魏酸1-3％(重量)、迷迭香酸0.1-1％(重量)。
7.进一步地，所述提取物中含有阿魏酸1.9-2.3％(重量)、迷迭香酸0.4～1％(重量)。
8.进一步地，所述提取物中含有柴胡皂苷b2 4-5％(重量)、柴胡皂苷a 3-4％(重量)、阿魏酸1-3％(重量)、迷迭香酸0.1-1％(重量)、橙皮苷0.1-0.5％(重量)、绿原酸0.1-1.1％(重量)。
9.进一步地，所述提取物中含有柴胡皂苷b2 4.20-4.21％、柴胡皂苷a3.22-3.23％、阿魏酸1.89-1.99％、迷迭香酸0.79-0.80％、橙皮苷0.35-0.36％、绿原酸0.16-0.17％。
10.进一步地，所述提取物的高效液相色谱图如图6b所示；
11.优选地，所述高效液相色谱条件如下：
12.色谱柱为thermo fisher scientific c18柱，尺寸是250mm
×
4.6mm，5μm；
13.流动相a为0.1％磷酸水溶液，流动相b为乙腈；
14.梯度洗脱条件为：0-15min，5％-15％乙腈；15-25min，15％-20％乙腈；25-45min，20％-30％乙腈；45-60min，30％-40％乙腈；60-80min，40％-55％乙腈；80-90min，55％-90％乙腈；
15.流速为1.0ml/min；
16.柱温为30℃；
17.检测波长为210nm；
18.进样量为10μl。
19.进一步地，所述提取物是如下重量配比的原料药制备而成：
20.柴胡10～20份、当归10～20份、薄荷1～5份；
21.优选地，所述提取物是如下重量配比的原料药制备而成：
22.柴胡14～15份、当归14～15份、薄荷4.0～4.5份。
23.进一步地，所述提取物是如下重量配比的原料药制备而成：
24.柴胡14.4份、当归14.4份、薄荷4.056份。
25.进一步地，所述制备方法包括如下步骤：
26.(1)称取各重量配比的原料药，加入6～8倍量乙醇回流提取1～3次，得醇提液；
27.(2)将醇提液浓缩至无醇味，在水中分散制得醇提物；
28.(3)将醇提物使用石油醚萃取至上层溶液无色后，取下层溶液使用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取后的上层溶液，即得；
29.优选地，
30.步骤(1)中，所述乙醇为95％乙醇；
31.和/或，步骤(1)中，所述回流提取前用乙醇浸泡10～12h；
32.和/或，步骤(1)中，所述回流提取时间为2～4小时；
33.和/或，步骤(2)中，所述醇提物含生药量2～4g
·
ml-1
；
34.和/或，步骤(3)中，所述萃取次数为8～10次；
35.和/或，步骤(3)中，所述乙酸乙酯萃取后的上层溶液减压浓缩，冷冻干燥。
36.进一步地，
37.步骤(1)中，所述回流提取时间为2～3小时；
38.和/或，步骤(1)中，所述回流提取次数为2～3次；
39.和/或，步骤(3)中，所述石油醚的用量为醇提物6～8倍量；
40.和/或，步骤(3)中，所述乙酸乙酯的用量为下层溶液6～8倍量。
41.本发明还提供了一种前述的柴胡当归薄荷复方提取物的制备方法，它包括如下步骤：
42.取各重量配比的原料，加入乙醇提取后，使用乙酸乙酯萃取，即得；
43.优选地，它包括如下步骤：
44.(1)称取各重量配比的原料药，加入6～8倍量乙醇回流提取1～3次，得醇提液；
45.(2)将醇提液浓缩至无醇味，在水中分散制得醇提物；
46.(3)将醇提物使用石油醚萃取至上层溶液无色后，取下层溶液使用乙酸乙酯萃取，
取乙酸乙酯萃取后的上层溶液，即得；
47.更优选地，
48.步骤(1)中，所述乙醇为95％乙醇；
49.和/或，步骤(1)中，所述回流提取前用乙醇浸泡10～12h；
50.和/或，步骤(1)中，所述回流提取时间为2～4小时；
51.和/或，步骤(2)中，所述醇提物含生药量2～4g
·
ml-1
；
52.和/或，步骤(3)中，所述萃取次数为8～10次；
53.和/或，步骤(3)中，所述乙酸乙酯萃取后的上层溶液减压浓缩，冷冻干燥。
54.进一步地，
55.步骤(1)中，所述回流提取时间为2～3小时；
56.和/或，步骤(1)中，所述回流提取次数为2～3次；
57.和/或，步骤(3)中，所述石油醚的用量为醇提物6～8倍量；
58.和/或，步骤(3)中，所述乙酸乙酯的用量为下层溶液6～8倍量。
59.本发明还提供了前述的柴胡当归薄荷复方提取物在制备抗抑郁的药物中的用途。
60.本发明还提供了一种药物制剂，它是以前述的柴胡当归薄荷复方提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物制剂。
61.所述药物制剂为颗粒剂、片剂、胶囊、丸剂、煎膏剂、糖浆剂等。
62.本发明研究发现柴胡当归薄荷复方的水煎液乙酸乙酯萃取部位无抗抑郁活性，而柴胡当归薄荷复方的醇提物乙酸乙酯萃取部位具有显著的抗抑郁效果。
63.因此，本发明提供了一种柴胡当归薄荷复方提取物，该提取物为柴胡当归薄荷复方醇提法提取后的醇提物乙酸乙酯萃取部位，该提取物具有显著的抗抑郁效果，可用于制备抗抑郁的药物，具有良好的应用前景。
64.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
65.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
66.图1为各组药物对行为绝望模型小鼠自主活动量的影响结果。
67.图2为各组药物对小鼠悬尾试验(a)和强迫游泳实验(b)不动时间的影响结果。
68.图3为醇提物乙酸乙酯部位正离子模式总离子流色谱图。
69.图4为醇提物乙酸乙酯部位负离子模式总离子流色谱图。
70.图5为绿原酸(a)、阿魏酸(b)、迷迭香酸(c)、橙皮苷(d)、柴胡皂苷a(e)、柴胡皂苷b2(f)的二级质谱图及其结构式。
71.图6为混合对照品(a)和醇提物乙酸乙酯部位(b)的hplc色谱图(210nm)(1-6号峰分别对应绿原酸、阿魏酸、迷迭香酸、橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2)。
72.图7为cums实验流程图。
73.图8为cums程序进行4周(a)及进行8周(b)的糖水偏好情况；与空白对照相比#p《
0.01；与cums组相比*p《0.05。
74.图9为cums实验的飞溅试验结果；与空白对照相比#p《0.01；与cums组相比***p《0.001。
75.图10为cums实验的新颖抑制性摄食试验结果；与空白对照相比#p《0.01；与cums组相比*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
76.图11为cums实验的悬尾试验结果；与空白对照相比#p《0.01；与cums组相比，***p《0.001。
77.图12为cums实验的强迫游泳试验结果；与空白对照相比#p《0.01；与cums组相比，*p《0.05，**p《0.01。
具体实施方式
78.本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。具体如下：
79.1、实验药物
80.北柴胡(bupleurum chinense dc.)，河北一仁药业有限公司，批号20180329；当归(angelica sinensis diels.)，四川中药饮片有限责任公司，批号20190618；薄荷(mentha haplocalyx briq.)，四川省天运民康中药饮片有限公司，批号18100。盐酸氟西汀胶囊，patheon france，20mg/粒，批号9833a。
81.2、实验动物
82.spf级雄性icr小鼠，5周龄，18～20g，成都达硕实验动物有限公司，许可证号为scxk(川)2015-030，合格证号：no.51203500011156。spf级雄性c57bl/6j小鼠，5周龄，18～20g，北京斯贝福公司提供，许可证号为scxk(京)2019-0010，合格证号：no.1103241911035682。所有动物均能自由饮食饮水，在24h明暗周期的环境中饲养，昼夜各12h(光照时间为8:00～20:00)，温度25
±
1℃，相对湿度40～60％。
83.3、实验试剂
84.无水乙醇(2021022401)、石油醚(2019041001)、乙酸乙酯(2019011601)、色谱级乙腈(2017111301)、色谱级甲醇(2021021901)，均购自成都市科隆化学品有限公司；
85.吐温-80、羧甲基纤维素钠(cmc-na)、磷酸(hplc级)，成都市科龙化工试剂厂，批号分别为2016101407、20120727、2016122601；
86.绿原酸、阿魏酸、迷迭香酸、橙皮苷、柴胡皂苷a，柴胡皂苷b2均购自成都克洛玛生物科技有限公司，批号分别为chb201114、chb201105、chb201206、chb201220、chb201131、chb201202；
87.小鼠cort elisa试剂盒，elabscience，批号e-el-0161c；
88.hsp90 rabbit polyclnal antibody、glucocorticoid receptor rabbit polyclnal antibody购自cell signaling technology公司，批号分别为12041s、4877s；fkbp51 antibody
–
internal购自affinity公司，批号为df13305；
89.gapdh mouse polyclnal antibody、荧光二抗cy3山羊抗兔、488山羊抗小鼠，servicebio公司，批号分别为gb11002、gb21303、gb25301。
90.4、实验主要仪器
91.旋转蒸发器，re-3000a，郑州市亚荣仪器有限公司；
92.纯水仪，ulphw，成都优普科技有限公司；
93.超高效液相色谱联用q exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(uplc-qe/ms)，vanquish，thermo fisher scientific；
94.高效液相色谱(hplc)，3000infinity，thermo fisher scientific；
95.小鼠自主活动仪，zz-6，成都泰盟科技有限公司；
96.悬尾实验观察箱，高55cm
×
长40cm
×
宽30cm，自制；
97.强迫游泳容器，高30cm
×
直径20cm，自制；
98.高级多功能酶标仪，varioskan flash，thermo scientific；
99.高速组织研磨仪，kz
‑ⅱ
，servicebio公司；
100.脱色摇床，tsy-b，servicebio；
101.免染型化学发光凝胶成像系统，chemidoc，bio rad。
102.5、实验场地
103.成都中医药大学药学院动物观察室，实验动物使用许可证为syxk(川)2020-124。
104.成都中医药大学国家中医药管理局中药药理学科研三级实验室(tcm-09-315)。
105.6、数据处理
106.采用spss 21.0统计软件分析数据。正态分布计量资料以均数
±
标准差(means
±
sd)表示,组间比较采用t-test检验或单因素方差分析,组间两两比较用lsd法。p《0.05表明具有统计学意义的差异。
107.实施例1、采用醇提法制备柴胡当归薄荷复方乙酸乙酯部位
108.(1)醇提法获得醇提物
109.将北柴胡、当归、薄荷按质量配比14.4：14.4：4.056称取332.56g，药物粉碎后取6倍量无水乙醇浸泡12h，加热至沸腾后回流提取2h，趁热过滤得到提取液。再取6倍量无水乙醇回流提取2h，趁热过滤。合并每次提取液回流浓缩至无醇味，在水中分散制得含生药量2g
·
ml-1
的浓缩醇提物。
110.(2)制备乙酸乙酯部位
111.将制备得到的浓缩醇提物进行萃取：先取浓缩醇提物6倍量的石油醚萃取8次至上层溶液无色，再取下层溶液与6倍量的乙酸乙酯萃取至上层溶液无色(8次)，合并乙酸乙酯萃得的上层溶液并低温水浴减压浓缩。将浓缩得到的流浸膏在通风橱中挥至无有机试剂味后冷冻干燥，得到深黄色粉末，即乙酸乙酯部位。计算得率，公式为：得率＝乙酸乙酯部位质量/投料药材质量。
112.醇提法提取制得的乙酸乙酯部位得率分别为1.06％，-20℃保存，临用时溶解于0.5％吐温80(w/v)0.5％cmc-na(羧甲基纤维素钠)和纯水中。
113.实施例2、采用醇提法制备柴胡当归薄荷复方乙酸乙酯部位
114.(1)醇提法获得醇提物
115.将北柴胡、当归、薄荷按质量配比14.4：14.4：4.056称取332.56g，药物粉碎后取8倍量95％乙醇浸泡12h，加热至沸腾后回流提取3h，趁热过滤得到提取液。再取8倍量95％乙醇回流提取3h，趁热过滤，重复2次。合并每次提取液回流浓缩至无醇味，在水中分散制得含生药量2g
·
ml-1
的浓缩醇提物。
116.(2)制备乙酸乙酯部位
117.将制备得到的浓缩醇提物进行萃取：先取浓缩醇提物6倍量的石油醚萃取8次至上层溶液无色，再取下层溶液与6倍量的乙酸乙酯萃取至上层溶液无色(8次)，合并乙酸乙酯萃得的上层溶液并低温水浴减压浓缩。将浓缩得到的流浸膏在通风橱中挥至无有机试剂味后冷冻干燥，得到深黄色粉末，即乙酸乙酯部位。经过计算，乙酸乙酯部位得率为1.45％。
118.实施例3、水煎法提法制备柴胡当归薄荷复方乙酸乙酯部位
119.(1)水煎法获得水煎液
120.将北柴胡、当归、薄荷按质量配比14.4：14.4：4.056称取332.56g，药物粉碎后取8倍量蒸馏水浸泡30min后大火煮开，小火维持微沸煮40min，趁热倒出煎液。再依次加6倍量、4倍量蒸馏水大火煮开，小火维持微沸煮40min。合并每次煎液，水浴减压浓缩至含生药量2g
·
ml-1
的浓缩水煎液。
121.(2)制备乙酸乙酯部位
122.制备方法同实施例1“(2)制备乙酸乙酯部位”，将制备得到的浓缩水煎液进行萃取，得乙酸乙酯部位。
123.水煎法提取制得的乙酸乙酯部位得率为1.10％，-20℃保存，临用时溶解于0.5％吐温80(w/v)0.5％cmc-na(羧甲基纤维素钠)和纯水中。
124.以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
125.试验例1、采用行为绝望抑郁模型研究各组乙酸乙酯部位抗抑郁效果
126.采用实施例1制备的醇提法乙酸乙酯部位和实施例3制备的水煎法乙酸乙酯部位，并采用行为绝望抑郁模型，研究各组乙酸乙酯部位的抗抑郁效果。
127.5周龄雄性icr小鼠，分别用于悬尾试验(tst)和强迫游泳试验(fst)，适应性喂养3天，按体重分层随机分为空白对照组(model)、氟西汀组(13.2mg
·
kg-1，flx)、水煎法乙酸乙酯部位组和醇提法乙酸乙酯部位组(均为21.9mg
·
kg-1，即成人每日剂量的40倍，以生药量计)，每组10只小鼠。分组后第1天开始灌胃给药。各组小鼠每日灌胃给药1次，灌胃体积为0.2ml/10g，空白对照组给予等体积溶剂，连续给药14d，溶剂为含0.5％吐温80(w/v)和0.5％cmc-na的水溶液。另外，将分组当天记为第0天，在第13天测试并记录动物自主活动量，在第14天进行小鼠悬尾试验及强迫游泳试验。
128.①
自主活动
129.自主活动结果见表1及图1。实验第13天，与空白对照组(model)相比，各给药组小鼠自主活动量未出现显著性差异，表明药物在所试剂量下不影响小鼠神经系统的兴奋性，排除了实验的假阳性的结果。
130.表1.各组对行为绝望抑郁模型小鼠自主活动量的影响
131.132.②
小鼠悬尾试验及强迫游泳试验
133.悬尾试验(tst)：距离小鼠尾尖部1cm处采用医用胶布将小鼠尾部固定在水平杆上，使其呈倒挂状态，头部离下水平面约20cm，记录动物在6min内后4min的累记不动时间。
134.强迫游泳试验(fst)：在高30cm、直径20cm的圆柱型透明器皿中注入清水，深度20cm，温度(25
±
2)℃。将小鼠置于器皿内，计时6min，记录后4min内累记不动时间。
135.结果见表2及图2。实验第14天，与空白对照组相比，醇提法乙酸乙酯部位(21.9g
·
kg-1
)能显著缩短小鼠悬尾不动时间(图2.a，p《0.05)和强迫游泳不动时间(图2.b，p《0.05)，而水煎法乙酸乙酯部位(21.9g
·
kg-1
)在行为绝望抑郁模型中未体现出显著的抗抑郁效果。实验结果说明醇提法得到的乙酸乙酯部位具有良好的抗抑郁活性，而水煎法乙酸乙酯部位不具有抗抑郁活性，醇提法乙酸乙酯部位抗抑郁效果显著优于水煎法得到的乙酸乙酯部分。
136.表2.各组对小鼠悬尾试验和强迫游泳实验不动时间的影响
[0137][0138]
注：与model组相比*p《0.05
[0139]
试验例2、醇提法乙酸乙酯部位有效成分研究
[0140]
以中国药典规定的当归稳定存在的内标成分阿魏酸和薄荷的非挥发性代表成分迷迭香酸共同作为评价指标，以有效成分的含量结合得率来具体考察实施例1和实施例2醇提法乙酸乙酯部位中阿魏酸和迷迭香酸的含量和得率。结果见表3。
[0141]
表3.各组乙酸乙酯部位中有效成分阿魏酸和迷迭香酸的含量
[0142][0143]
在综合考虑乙酸乙酯部位有效成分阿魏酸和迷迭香酸得率和含量后，发现，实施例2提取方法得到的阿魏酸和迷迭香酸得率和含量更高。
[0144]
试验例3、醇提法乙酸乙酯部位的质量控制
[0145]
一、利用uplc-qe/ms对醇提法乙酸乙酯部位的化学成分进行预测。
[0146]
1、供试品溶液的制备
[0147]
精密称定实施例2醇提法乙酸乙酯部位，溶解在甲醇中，超声30min，制得浓度为1178.95μg
·
ml-1
的供试品溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤，备用。
[0148]
2、色谱条件
[0149]
thermo scientific accucore
tmc18
色谱柱(2.1mm
×
100mm,2.2μm)，流动相为0.1％甲酸(a)-乙腈(b)，梯度洗脱(0～30min，5％～40％b；30～36min，40％～45％b；36～41min，45％～55％b；41～45min，55％～60％b；45～50min，60％～90％b；50～55min，90％
b)，流速0.3ml
·
min-1
，柱温30℃，进样量5μl。
[0150]
3、质谱条件
[0151]
离子源类型：hesi；扫描方式：full ms-dd ms2；扫描范围：100-1500；full ms分辨率：35000；dd ms2分辨率：17500；正负电压：3000(v)；s-lens：50(v)；鞘气流速：35(au)；辅助气流速：10(au)；离子传输管温度：320(℃)；辅助气加热温度：350(℃)。扫描模式为全扫描/数据依赖二级扫描，一级分辨率70000，二级分辨率17500，扫描范围m/z 100～1500。
[0152]
4、数据处理
[0153]
将采集得到的原始数据导入compound discoverer 3.0软件，对其进行峰对齐和峰提取，通过提取得到的分子离子色谱峰、同位素峰拟合出可能的分子式，并将二级碎片实测谱图与mzcloud在线数据库及mzvault数据库进行匹配，匹配度分值高于80。对过滤后的离子与数据库中的化合物信息及相关文献比对，进行化合物的分析鉴定。
[0154]
5、uplc-qe/ms法测定醇提法乙酸乙酯部位化学成分的结果
[0155]
通过uplc-qe/ms结果和图谱分析、文献比对，认为对绿原酸(chlorogenic acid,c
16h18
o9)、阿魏酸(ferulic acid,c
10h10
o4)、迷迭香酸(rosmarinic acid,c
18h16
o8)、橙皮苷(hesperidin,c
28h34o15
)、柴胡皂苷a(saikosaponin a,c
42h68o13
)、柴胡皂苷b2(saikosaponin b2，c
42h68o13
)等的预测较为可靠，主要为苯丙素类、黄酮类和三萜皂苷类化合物。乙酸乙酯部位正、负模式总离子流色谱图分别见图3、图4，绿原酸、阿魏酸、迷迭香酸、橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2质谱图见图5(a-f)。
[0156]
二、基于hplc的醇提法乙酸乙酯部位主要成分的含量测定
[0157]
醇提法乙酸乙酯部位经uplc-qe/ms法定性分析成分后，使用hplc法同时进行绿原酸(chlorogenic acid,c
16h18
o9)、阿魏酸(ferulic acid,c
10h10
o4)、迷迭香酸(rosmarinic acid,c
18h16
o8)、橙皮苷(hesperidin,c
28h34o15
)、柴胡皂苷a(saikosaponin a,c
42h68o13
)、柴胡皂苷b2(saikosaponin b2，c
42h68o13
)6种化合物的含量测定，作为质量控制的依据。
[0158]
1、供试品溶液的制备
[0159]
精密称定实施例2醇提法乙酸乙酯部位，溶解在甲醇中，超声30min，制得浓度为8.376mg
·
ml-1
的供试品溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤，备用。
[0160]
2、混合对照品溶液的制备
[0161]
称取绿原酸、阿魏酸、橙皮苷、迷迭香酸、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2对照品适量，同时精密称定于10ml量瓶中，用无水甲醇稀释至刻度，摇匀，混合对照品中各对照品溶液质量浓度如下：绿原酸为0.936mg
·
ml-1
、阿魏酸为1.80mg
·
ml-1
、迷迭香酸为0.927mg
·
ml-1
、橙皮苷为0.855mg
·
ml-1
、柴胡皂苷a为0.973mg
·
ml-1
、柴胡皂苷b2为1.073mg
·
ml-1
。
[0162]
3、色谱条件
[0163]
色谱柱为thermo fisher scientific c18柱(250mm
×
4.6mm,5μm)，流动相：0.1％磷酸水溶液(a)
–
乙腈(b),梯度洗脱条件：0-15min，5％-15％乙腈；15-25min，15％-20％乙腈；25-45min，20％-30％乙腈；45-60min，30％-40％乙腈；60-80min，40％-55％乙腈；80-90min，55％-90％乙腈；流速:1.0ml/min；柱温:30℃；检测波长:210nm；进样量：10μl。2020版《中国药典》规定柴胡皂苷a的检测波长为210nm，阿魏酸的检测波长为320nm，文献报道柴胡皂苷b2的最大吸收波长为254nm，橙皮苷的最大吸收波长为284nm，绿原酸及迷迭香酸的最大吸收波长分别为327nm及330nm。综合考虑醇提物乙酸乙酯部位内的主要物质成分群，
拟采用210nm(柴胡皂苷a)、254nm(柴胡皂苷b2)、287nm(橙皮苷)、330nm(绿原酸、阿魏酸、迷迭香酸)进行四通道多波长扫描。利用hplc多波长扫描，对醇提法乙酸乙酯部位在不同检测波长下的谱图进行对比分析，发现210nm时出峰较多且峰形良好，故混合对照品及hplc色谱图在210nm下进行展示。采用混合对照品的样品及醇提法乙酸乙酯部位样品的色谱图见图6。
[0164]
4、hplc方法学考察
[0165]
①
系统适应性试验
[0166]
按照色谱条件，分别吸取混合对照品溶液和醇提法乙酸乙酯部位样品溶液进样，测定各化合物峰面积。结果(图6)显示，混合对照品溶液中各成分对应色谱峰分离良好，基线平稳且各对照品峰与样品峰时间对应良好。
[0167]
②
线性关系考察
[0168]
精密吸取混合对照品母液，将其用无水甲醇稀释为7个梯度，分别计算出每个质量浓度梯度下各对照品的质量浓度，按色谱条件测定7个质量浓度梯度下各对照品的峰面积，以质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)绘制各对照品标准曲线，进行线性回归，得各活性成分的线性回归方程和线性范围分别为绿原酸y＝0.0024x-0.0164，r2＝0.9996，线性范围为936.0μg
·
ml-1-7.3125μg
·
ml-1
；阿魏酸y＝0.0009x-0.0011，r2＝0.9998，线性范围为1800.0μg
·
ml-1-14.063μg
·
ml-1
；迷迭香酸y＝0.0023x-0.0074，r2＝0.9998，线性范围为927.0μg
·
ml-1-7.242μg
·
ml-1
；橙皮苷y＝0.0031x-0.0053，r2＝0.9996，线性范围为855.0μg
·
ml-1-16.68μg
·
ml-1
；柴胡皂苷a y＝0.0217x-0.0052，r2＝0.9999，线性范围为973.0μg
·
ml-1-7.602μg
·
ml-1
；柴胡皂苷b2 y＝0.0039x-0.007，r2＝0.9996，线性范围为1073.0μg
·
ml-1-8.383μg
·
ml-1
。发现各活性成分在相应检测质量浓度范围内线性关系良好。
[0169]
③
精密度试验
[0170]
取配制的醇提法乙酸乙酯部位供试品溶液，按拟定的色谱条件连续进样6次，分别计算6种测定成分绿原酸、阿魏酸、迷迭香酸、橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2对应峰面积rsd值，分别为1.22％、1.06％、1.11％、1.24％、1.01％、1.29％。结果表明各测定成分峰面积的rsd值均小于1.5％，表明该检测方法精密度良好。
[0171]
④
重复性试验
[0172]
同时配制6份醇提法乙酸乙酯部位样品，按拟定色谱条件进行检测，分别计算6种测定成分绿原酸、阿魏酸、迷迭香酸、橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2对应峰面积rsd值，分别为0.99％、1.09％、1.31％、1.16％、1.27％、1.00％。结果表明各测定成分峰面积的rsd值均小于1.5％，表明该检测方法重复性良好。
[0173]
⑤
稳定性试验
[0174]
取相同的醇提法乙酸乙酯供试品溶液分别在配制后0、2、4、8、12、18、24h进样检测，并计算6种测定成分绿原酸、阿魏酸、迷迭香酸、橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2对应峰面积rsd值，分别为1.11％、1.13％、1.26％、1.17％、1.41％、1.03％。该结果表明，醇提法乙酸乙酯部位供试品溶液在配制后24h内基本稳定。
[0175]
⑥
加样回收率试验
[0176]
取已知含量的醇提法乙酸乙酯部位100mg，精密称定，按照各成分在样品中的含量，精密加入约0.2mg绿原酸、2.0mg阿魏酸、0.8mg迷迭香酸、0.35mg橙皮苷、3.0mg柴胡皂苷
a、4.0mg柴胡皂苷b2按照供试品溶液制备的步骤进行前处理后，在规定色谱条件下测定峰面积并计算6种成分的平均加样回收率，实验平行测定3次，6种成分的平均加样回收率和rsd值如下：绿原酸为104.3％和3.2％，阿魏酸为98.3％和2.5％，迷迭香酸为101.5％和2.8％，橙皮苷为96.3％和3.5％，柴胡皂苷a为101.3％和3.6％，柴胡皂苷b2为105.3％和2.9％，各成分加样回收率rsd均小于5％，表示制备工艺及样品的前处理条件稳定可控。
[0177]
⑦
含量测定
[0178]
分别平行制备3份醇提法乙酸乙酯部位样品。采用建立的hplc方法分别对其进行检测并使用标准曲线法计算醇提法乙酸乙酯部位中6种活性成分的含量(mg
·
g-1
)。结果(表4)表明所选择的6种活性成分，含量由高到低依次为柴胡皂苷b2、柴胡皂苷a、阿魏酸、迷迭香酸、橙皮苷、绿原酸，以上成分在醇提法乙酸乙酯部位中的平均含量为4.21％、3.22％、1.99％、0.79％、0.35％、0.16％。
[0179]
表4.醇提法乙酸乙酯部位中6种有效成分含量测定结果(mg
·
g-1
)及含量(％)
[0180]
编号绿原酸阿魏酸迷迭香酸橙皮苷柴胡皂苷a柴胡皂苷b211.62418.987.9233.58632.2842.0921.62218.927.9133.57732.2642.0631.61719.027.9093.57232.2542.03平均含量0.16％1.99％0.79％0.35％3.22％4.21％
[0181]
实验利用uplc-qe/ms对醇提法乙酸乙酯部位的化学成分进行预测，结合文献比对确定其主要的化学成分，进一步采用hplc法同时测定绿原酸、阿魏酸、迷迭香酸、橙皮苷、柴胡皂苷a及柴胡皂苷b2，实现对醇提法乙酸乙酯部位的质量控制。测得阿魏酸在醇提法乙酸乙酯部位中的含量为1.99％，同时柴胡皂苷a在醇提法乙酸乙酯部位中的含量为3.22％。中国药典(2020版)规定当归饮片的阿魏酸含量不得低于0.050％，柴胡饮片的柴胡皂苷(柴胡皂苷a及柴胡皂苷d)含量不得低于0.30％，本部位结果均远高于药典标准，可认为该提取工艺下的醇提法乙酸乙酯部位实现了对生药化学成分的有效富集。
[0182]
试验例4、基于cums小鼠模型探索醇提法乙酸乙酯部位的抗抑郁作用
[0183]
1、cums抑郁小鼠模型建立，分组、给药及取材
[0184]
5周龄雄性c57bl/6j小鼠，适应性饲养一周，按体重分层随机分为空白组和cums模型组，分别12只和72只。空白组小鼠每笼4只正常饲养，cums模型组小鼠单笼孤养，且cums模型组小鼠每天不定时随机给予以下1或2种刺激：束缚3h，冷水游泳(4℃,5min)，夹尾3min，噪音(60hz，1h)，热刺激(45℃，5min)，异味刺激(氨水或醋酸，3h)，禁水12h，空笼12h(笼中无垫料)，倾斜45
°
12h，潮湿垫料12h，昼夜颠倒24h(暗环境频闪)，昼夜颠倒24h，禁食24h。每种刺激不连续重复出现，总刺激时间为8周，刺激安排见表5。在实施刺激第4周末，检测小鼠糖水偏好率，评价造模是否成功；将造模成功的小鼠按糖水偏好率分层随机分为模型组、阳性药组(氟西汀13.2mg
·
kg-1
)、实施例2醇提法乙酸乙酯部位低、中、高剂量组(11.0g
·
kg-1
、22.0g
·
kg-1
、33.0g
·
kg-1
，分别为临床成人日用剂量的20、40、60倍)、水煎液组(21.9g
·
kg-1
)，每组12只小鼠，各抑郁模型组小鼠给药前的糖水偏好率水平无显著差异。分组后开始灌胃给药，除水煎液组外(水煎液组采用实施例3所述方法制备，记为cdb水煎液)，其余给药
组药液配制均采用含0.5％cmc na和0.5％tween 80的溶液，空白组和模型组给予等体积溶剂(含0.5％cmc na和0.5％tween 80的溶液)，连续给药4周，每日灌胃给药1次，灌胃体积为0.2ml/10g。给药第5周末进行行为学测试，行为学测试结束后12h，小鼠取血分离血清，冰上剖取海马组织，立即于液氮中冷冻，而后-80℃保存样本备用。实验流程见图7。
[0185]
表5.cums刺激安排表
[0186]
[0187][0188]
2、醇提法乙酸乙酯部位对cums抑郁小鼠模型行为学的影响
[0189]
①
自主活动测试
[0190]
于第9周测试并记录慢性应激和药物干预后各组小鼠的自主活动量。具体结果见表6。第8周末，各组间小鼠的自主活动量无显著性差异，醇提法乙酸乙酯部位11g
·
kg-1
、22g
·
kg-1
、33g
·
kg-1
分别对应eefc-l、eefc-m、eefc-h，表明慢性应激和药物治疗均不影响小鼠神经系统的兴奋性。
[0191]
表6.各组对cums抑郁小鼠模型自主活动量的影响
[0192][0193]
②
糖水偏好试验(spt)
[0194]
于第4周最后一天和第9周最后一天进行糖水偏好测试，试验开始前小鼠禁食禁水24h，试验时，小鼠单独放置于其熟悉的鼠盒中，每个鼠盒有两个已称重的水瓶，分别装满纯净水和1％的糖水。将小鼠3h内的糖水偏好率作为评价指标，糖水偏好率＝糖水消耗量/(糖水消耗量+纯净水消耗量)
×
100％。
[0195]
见表7及图8。第4周末，与空白对照组相比，各造模组小鼠糖水偏好率均显著减少(p《0.05)，表明慢性应激导致模型小鼠快感缺失表现，提示4周的cums程序使动物出现抑郁样行为，开始分组给药后，同时继续造模程序。实验第8周，与空白组对照组相比，cums模型组小鼠糖水偏好率依然降低(p《0.05)；与cums模型组相比，氟西汀、cdb水煎液及醇提法乙酸乙酯部位11g
·
kg-1
、22g
·
kg-1
、33g
·
kg-1
的治疗能显著提高模型小鼠的糖水偏好率(p《0.05)，表明药物具有抗抑郁作用。另外，与水煎液组相比，醇提法乙酸乙酯部位各个剂量组小鼠糖水偏好率无统计学差异。
[0196]
表7.各组对cums抑郁小鼠模型糖水偏好的影响
[0197][0198][0199]
注：与空白对照相比#p《0.01；与cums组相比*p《0.05。
[0200]
③
飞溅试验(st)
[0201]
于第8周周末开展飞溅试验。将10％蔗糖溶液喷在小鼠背部，连续喷洒6次(约1.2ml)，将小鼠放入其熟悉的鼠笼，记录5min内小鼠梳洗背部时间。
[0202]
见表8及图9。与空白对照组相比，cums模型组小鼠梳洗时间显著减少，提示模型小鼠梳理毛发和自我保护能力存在缺陷，呈现类抑郁样行为。与模型组相比，氟西汀组、cdb水煎液组、醇提法乙酸乙酯部位11g
·
kg-1
、22g
·
kg-1
、33g
·
kg-1
组小鼠梳洗时间显著增加(p《
0.001)。另外，水煎液组与醇提法乙酸乙酯部位各剂量组比较，小鼠梳洗时间无统计学差异。
[0203]
表8.各组对cums抑郁小鼠模型梳洗时间的影响
[0204][0205]
注：与空白对照相比#p《0.01；与cums组相比***p《0.001。
[0206]
④
新颖抑制性摄食试验(nfst)
[0207]
于第8周开展新奇环境抑制性摄食试验。测试前小鼠禁食不禁水36h，在自制敞箱(50cm
×
50cm
×
50cm)底部覆盖一层干净垫料，中央固定一张白纸，白纸上放置颗粒状饲料并用垂直光源照射凸显。将小鼠面向箱壁放入敞箱角落，立即计时5min，记录小鼠咬食第一口饲料的时间(即摄食潜伏期)，超过5min按5min计。
[0208]
见表9及图10。与空白对照组相比，模型组小鼠摄食潜伏期显著延长(p《0.001)，提示模型小鼠在饥饿状态下对摄食的需求和在新奇环境中的恐惧感存在冲突，表现出抑郁样及焦虑样行为。与cums模型组相比，氟西汀、cdb水煎液及醇提法乙酸乙酯部位11g
·
kg-1
、22g
·
kg-1
、33g
·
kg-1
的治疗均能显著缩短小鼠在陌生环境下的摄食潜伏期。与cdb水煎液相比，醇提法乙酸乙酯部位各剂量组该行为学表现无差异。
[0209]
表9.各组对cums抑郁小鼠模型摄食潜伏期的影响
[0210][0211]
注：与空白对照相比#p《0.01；与cums组相比*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
[0212]
⑤
悬尾试验(tst)
[0213]
于第8周末开展悬尾试验，将小鼠距尾尖部1.5cm处用胶带固定在一根水平木棍上，使动物呈倒挂状态，其头部离水平面约20cm，分别记录每只动物在6min内后4min的累计
不动时间。
[0214]
见表10及图11。与空白对照组相比，cums模型组小鼠悬尾不动时间显著延长(p《0.05)，行为绝望、淡漠，提示其出现抑郁样行为。与cums模型组相比，氟西汀组、水煎液组、醇提法乙酸乙酯部位11g
·
kg-1
、22g
·
kg-1
、33g
·
kg-1
组小鼠不动时间极显著缩短(p《0.001)。与水煎液组相比，醇提法乙酸乙酯部位各剂量组小鼠悬尾不动时间无显著性差异。
[0215]
表10.各组对cums抑郁小鼠模型悬尾不动时间的影响
[0216][0217]
注：与空白对照相比#p《0.01；与cums组相比***p《0.001。
[0218]
⑥
强迫游泳试验(fst)
[0219]
于第8周末开展强迫游泳试验，将小鼠置于预先注有20cm深清水的圆柱型透明器皿内(高30cm，直径20cm)，温度25
±
1℃，分别记录每只小鼠6min内后4min内的累计不动时间。
[0220]
见表11及图12。与空白对照组相比，cums模型组小鼠强迫游泳不动时间显著延长(p《0.05)，行为绝望、淡漠，提示其出现抑郁样行为。与cums模型组相比，醇提法乙酸乙酯部位11g
·
kg-1
、22g
·
kg-1
、33g
·
kg-1
组小鼠不动时间显著缩短(p《0.05，p《0.01)。
[0221]
表11.各组对cums抑郁小鼠模型强迫游泳不动时间的影响
[0222][0223]
注：与空白对照相比#p《0.01；与cums组相比*p《0.05，**p《0.01。
[0224]
上述试验结果说明：具有抗抑郁效果的柴当薄组(柴胡当归薄荷复方)采用乙醇提取后使用乙酸乙酯萃取，得到的乙酸乙酯部位具有良好的抗抑郁效果，其效果与复方水煎液法相当，但显著优于水煎液法乙酸乙酯部位。
[0225]
综上，本发明提供了一种柴胡当归薄荷复方提取物，该提取物为柴胡当归薄荷复方醇提法提取后的醇提物乙酸乙酯萃取部位，该提取物具有显著的抗抑郁效果，可用于制备抗抑郁的药物，具有良好的应用前景。