双靶向纳米硒-阿霉素复合物在铂耐药恶性肿瘤治疗的应用

1.本发明属于医药复合物和制备技术领域，特别涉及双靶向纳米硒-阿霉素复合物及其制备方法，以及在铂耐药恶性肿瘤，尤其是卵巢癌治疗的应用。


背景技术：

2.卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，是一种易于转移并广泛播散的肿瘤。其发病率占妇科恶性肿瘤的22.9％，死亡率居妇科恶性肿瘤之首。在临床治疗中，手术后辅以化疗是晚期卵巢癌综合治疗的必须环节，通过化疗可以杀灭微小肿瘤病灶、减缓肿瘤复发并延长患者生存时间。但化疗药物的毒副作用和肿瘤细胞产生的抗药性往往会导致化疗失败，使肿瘤细胞进一步扩散、转移，导致恶病质的发生，最终使患者全身多器官衰竭而死亡。鉴于此，寻找新型的治疗手段用于降低化疗药物毒副作用和肿瘤的耐药性，并且能够提高药物抗肿瘤的治疗效果迫在眉睫。
3.化疗作为卵巢癌治疗的一线疗法是当今医学工作者的研究重点，化疗药物在作用于肿瘤细胞的同时也会对机体内的正常细胞带来损伤。如何在增加患者肿瘤组织中的药物浓度达到有效杀伤肿瘤细胞的同时，减少正常细胞和组织对化疗药物的暴露，从而减少毒副作用和肿瘤耐药的发生是专家们想要达到的理想目标。因此随着现代细胞生物学及分子生物学技术的发展，对于肿瘤的治疗不再仅仅局限于传统的手术、放疗及化疗，而是提出基于细胞功能、信号通路和对肿瘤靶向性抗肿瘤治疗。化疗药物具有靶向性，不仅可以提高肿瘤局部药物浓度，使药物达到更好的肿瘤杀伤效果，也可以减少其对正常组织的毒副作用。当今，肿瘤的靶向治疗由于其良好的指向性、针对性及抗肿瘤活性已成为当今抗肿瘤研究领域的热点。
4.在肿瘤靶向药物治疗的研究中，抗肿瘤药物载体的选择至关重要，良好的载体在携带化疗药物进入机体后能够逃过机体的免疫监控系统，特异的趋化和聚集于肿瘤部位，并释放抗肿瘤药物。已经有研究表明，脂质体、纳米粒、胶束、高分子材料等都可以作为靶向递送药物和基因的载体，但这些材料仍然存在靶向性低、载体毒性高、到达肿瘤部位药量少、易被免疫系统清除等缺点。
5.阿霉素(dox)是一种抗生素类广普抗肿瘤药物，可以抑制细胞中的rna和dna的合成，其中对rna的抑制作用最强，属于周期抑制非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有良好的杀灭作用，但在使用药物过程中易发生骨髓抑制并对心脏毒性等副作用，而且其最大终身累积剂量为550mg/m2。如何减少dox使用剂量，在发挥药物最佳抗肿瘤效果的同时，减少其毒副作用，是目前现有技术最需要解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，发挥药物最佳抗肿瘤效果的同时，减少其毒副作用，提供一种双靶向修饰纳米硒-阿霉素复合物的制备方法。
7.本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的双靶向纳米硒-阿霉素复合物。
8.本发明的再一目的在于提供所述双靶向纳米硒-阿霉素复合物在治疗铂耐药恶性肿瘤，尤其是卵巢癌中的应用。
9.本发明人发现硒元素具有一定的抗癌作用，并能缓解癌症患者化疗药物的毒性反应，降低肿瘤细胞对化疗的耐药性。应用纳米生物技术可以将硒的化合物构建成纳米硒，将其作为一种良好的纳米载体与多种多肽、抗体和抗肿瘤药物正负电荷吸附结合，形成一个靶向的载药系统。rgd多肽能特异性的识别和结合整合素αvβ3，s2.2适配体能特异性的识别和结合muc1，故整合素αvβ3和muc1可以作为卵巢癌的靶点，其配体rgd多肽和s2.2适配体可用于抗卵巢癌的靶向探针。
10.将硒化合物构建出的纳米硒加载dox后，经rgd多肽和s2.2适配体修饰，可介导dox靶向运送到耐药卵巢癌后释放，明显提高肿瘤局部药物浓度，进而发挥杀伤肿瘤细胞的作用，同时发挥硒元素的抗癌、减少化疗药物毒性反应、降低肿瘤细胞耐药性的作用，既可以改善卵巢癌细胞耐药性，又能够减轻全身化疗的毒副反应，提高dox抗卵巢癌疗效，是一个理想的药物靶向治疗方式。
11.本发明提供一种双靶向纳米硒-阿霉素复合物的制备方法，步骤包括：
12.(1)制备负载了阿霉素(dox)的纳米硒，取na2seo3和dox溶于水中，比如取质量2-4份na2seo3和1份dox溶于水中，配置成亚硒酸钠-阿霉素的储液；然后配制抗坏血酸储备液和吐温80溶液，将所述亚硒酸钠-阿霉素储液加入到吐温80溶液中，之后向反应中逐渐滴入抗坏血酸，避光搅拌后透析，得到负载了阿霉素的纳米硒(se-dox)；
13.(2)se-dox@pda-s2.2/rgd的合成，配置pda储液，将所述pda储液逐滴加入到所述负载了阿霉素的纳米硒(se-dox)反应体系中充分搅拌反应，等观察到反应溶液变黑，取se-dox@pda溶液，分别加入rgd多肽和适配体s2.2，搅拌反应，并进行离心处理，最后得到双靶向纳米硒-阿霉素复合物。
14.作为一种实施方式，所述双靶向纳米硒-阿霉素复合物的制备方法，具体步骤包括：
15.(1)制备负载阿霉素的纳米硒，取3份na2seo3和1份dox溶于水中，配置成亚硒酸钠-阿霉素的储液，然后配制抗坏血酸储备液和吐温80溶液，将亚硒酸钠-阿霉素储液加入到吐温80溶液中，之后向反应中逐渐滴入抗坏血酸1-2份，避光搅拌8-14h后透析过夜，得到负载了阿霉素的纳米硒；
16.(2)se-dox@pda-s2.2/rgd的合成，配置pda的储液，将0.5-0.6份的pda储液逐滴加入到5-6份的所述负载了阿霉素的纳米硒(se-dox)反应体系中充分搅拌反应，等观察到反应溶液变黑，取se-dox@pda溶液，分别加入1-2份的rgd多肽和适配体s2.2，搅拌反应沉淀，并进行离心处理，最后得到双靶向纳米硒-阿霉素复合物。
17.使用rgd多肽能特异性的识别并结合恶性肿瘤细胞膜表面蛋白整合素αvβ3，适配体s2.2能特异性的识别并结合恶性肿瘤细胞膜表面蛋白muc1，rgd多肽和适配体s2.2都与纳米硒结合后，赋予纳米硒双靶向性。
18.本发明的制备方法将硒化合物构建出的纳米硒加载阿霉素后，经rgd多肽和适配体s2.2修饰，作为载体携带阿霉素。
19.本发明还提供了根据上述制备方法得到的双靶向纳米硒-阿霉素复合物，负载了阿霉素的纳米硒，经rgd多肽和适配体s2.2修饰，作为载体携带阿霉素。所述纳米硒作为载
体与rgd多肽、适配体s2.2和抗肿瘤药物dox正负电荷吸附结合，形成一个靶向的载药系统，所述rgd多肽能特异性的识别和结合肿瘤细胞膜表面蛋白整合素αvβ3，所述适配体s2.2能特异性的识别和结合肿瘤细胞膜表面的粘蛋白muc1，整合素αvβ3和muc1可以作为恶性肿瘤，尤其是卵巢癌的靶点。
20.本发明还提供了双靶向纳米硒-阿霉素复合物在治疗铂耐药恶性肿瘤，尤其是卵巢癌中的应用，采用上述制备方法得到的双靶向纳米硒-阿霉素复合物，可介导dox靶向运送到耐药卵巢癌后释放，提高肿瘤局部药物浓度，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，并减少化疗药物毒性反应、降低肿瘤细胞耐药性的作用。
21.进一步，所述纳米硒作为载体与rgd多肽、适配体s2.2和抗肿瘤药物dox正负电荷吸附结合，形成一个靶向的载药系统，所述rgd多肽能特异性的识别和结合肿瘤细胞膜表面蛋白整合素αvβ3，所述适配体s2.2能特异性的识别和结合肿瘤细胞膜表面粘蛋白muc1，整合素αvβ3和muc1可以作为恶性肿瘤，尤其是卵巢癌的靶点，其配体rgd多肽和适配体s2.2可用于抗卵巢癌的靶向探针。
22.与现有技术相比，本专利的制备方法和双靶向纳米硒-阿霉素复合物具有的优点是：
23.(1)在我们实验室的前期研究中发现：相比于现有其他纳米载体药物，硒作为人体必需的微量元素，具有高效低毒的抗肿瘤特性。纳米硒携带药物进入机体后能够逃过机体的免疫监控系统，特异的趋化和聚集于肿瘤部位，并释放抗肿瘤药物。本发明制备方法使用rgd多肽能特异性的识别和结合整合素αvβ3，s2.2适配体能特异性的识别和结合muc1与纳米硒相结合，赋予纳米硒靶向肿瘤部位的特性，同时将纳米硒作为载体携带阿霉素运载到肿瘤部位，能更加精准的杀死癌细胞，发挥更佳抗肿瘤效果。
24.(2)本发明通过选取rgd多肽和s2.2适配体修饰纳米硒，作为载体携带阿霉素，创新的制备出双重靶向纳米硒-阿霉素复合纳米材料，通过与单靶向，无靶向纳米硒-阿霉素复合物治疗肿瘤细胞对比实验，得出双靶向纳米硒-阿霉素不仅可以提高肿瘤局部药物浓度，使药物达到更好的肿瘤杀伤效果，也可以减少其对正常组织的毒副作用。将为其他靶向修饰纳米硒材料的制备提供了新的参考研发思路。
25.(3)通过靶向纳米硒携带阿霉素到达肿瘤部位后释放阿霉素治疗铂耐药卵巢癌细胞，我们通过与铂敏感卵巢癌细胞对比实验，得出双靶向纳米硒-阿霉素能够有效逆转铂耐药卵巢癌细胞的耐药性，降低阿霉素化疗药物的使用剂量，也可以减少其对机体的毒副作用。
26.(4)通过在细胞水平与动物水平进行铂耐药卵巢癌实验，我们发现双重靶向纳米硒-阿霉素复合材料能够有效逆转铂耐药卵巢癌细胞的耐药性，从而达到高效治疗铂耐药性卵巢癌，降低患者化疗毒副作用。
27.(5)通过研究结果对比，我们发现，相比于转铁蛋白、叶酸等靶向修饰的纳米硒，本发明制备的双靶向纳米硒-阿霉素复合物在溶液中的粒径更小、稳定性更高，其可通过优化工艺，适当扩大合成规模，实现药物的商业化和应用。
附图说明
28.图1：se-dox@pda-s2.2/rgd复合物的透射电镜图。
29.图2：se-dox@pda-s2.2/rgd复合物的a-bsanp@se的粒度图。
30.图3：se-dox@pda-s2.2/rgd复合物的a-bsanp@se的zeta电位图。
31.图4：正常卵巢组织与卵巢癌组织中整合素αvβ3免疫组化结果图。
32.图5：正常卵巢组织与卵巢癌组织中粘蛋白muc1免疫组化结果图。
33.图6：无靶向，单靶向，双靶向纳米硒-阿霉素作用于铂耐药卵巢癌细胞mtt实验图。
34.图7：双靶向纳米硒-阿霉素分别作用于铂敏感与铂耐药卵巢癌细胞mtt实验图。
具体实施方式
35.下面将结合本实施例中的附图，对本专利实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
36.参见图1-7，本发明通过改变探究双重靶向纳米硒-阿霉素的制备方法，基于肿瘤细胞与正常细胞表面分子的表达差异，将纳米硒经过rgd多肽和s2.2适配体修饰后作为载体，介导dox双重靶向运送到耐药卵巢癌组织后释放，明显提高肿瘤局部药物浓度，减低正常组织药物浓度，减轻全身化疗的毒副反应，提高dox抗卵巢癌疗效。
37.本发明实施例一提供所述双靶向纳米硒-阿霉素复合物的制备方法，具体步骤包括：
38.(1)制备负载阿霉素的纳米硒，取3份na2seo3和1份dox溶于水中，配置成亚硒酸钠-阿霉素的储液，然后配制抗坏血酸储备液和吐温80溶液，将亚硒酸钠-阿霉素储液加入到吐温80溶液中，之后向反应中逐渐滴入抗坏血酸1-2份，避光搅拌8-14h后透析过夜，得到负载了阿霉素的纳米硒；
39.(2)se-dox@pda-s2.2/rgd的合成，配置pda的储液，将0.5-0.6份的pda储液逐滴加入到5-6份的所述负载了阿霉素的纳米硒(se-dox)反应体系中充分搅拌反应，等观察到反应溶液变黑，取se-dox@pda溶液，分别加入1-2份的rgd多肽和适配体s2.2，搅拌反应，并进行离心处理，最后得到双靶向纳米硒-阿霉素复合物。
40.具体的，本发明实施例二提供双靶向纳米硒-阿霉素复合物的制备方法，步骤包括：
41.(1)制备负载阿霉素的纳米硒，称取0.017g na2seo3和0.006g dox溶于10ml的水中，配置成亚硒酸钠-阿霉素的储液(na2seo
3-dox 1mm-10mm)，然后配制抗坏血酸储备液和吐温80溶液，将2ml的亚硒酸钠-阿霉素储液加入到6ml吐温80溶液中，之后向反应中逐渐滴入抗坏血酸2ml，避光搅拌12h后透析过夜，最终得到负载了阿霉素的纳米硒2mm(se-dox)。
42.(2)se-dox@pda-s2.2/rgd的合成，配置pda(1mg/ml)的培养基储液，将500μl的pda储液逐滴加入到5ml的se-dox反应体系中充分搅拌反应，可观察到反应溶液变黑。取se-dox@pda溶液，分别加入1ml(5mg/ml)的rgd多肽和适配体s2.2，搅拌反应过夜，离心处理，最后得到双靶向纳米硒-阿霉素复合物。透射电镜观察se-dox@pda-s2.2/rgd形貌结构。
43.本发明根据上述实施例制备方法得到的双靶向纳米硒-阿霉素复合物，负载了阿霉素的纳米硒，经rgd多肽和s2.2适配体修饰，作为载体携带阿霉素。所述纳米硒作为载体与rgd多肽、适配体s2.2和抗肿瘤药物dox正负电荷吸附结合，形成一个靶向的载药系统，所述rgd多肽能特异性的识别和结合整合素αvβ3，所述适配体s2.2能特异性的识别和结合粘蛋白muc1，整合素αvβ3和muc1可以作为卵巢癌的靶点。所述双靶向纳米硒-阿霉素复合材料
能够准确靶向卵巢癌细胞，能够有效逆转耐药卵巢癌细胞的耐药性，减低化疗药物的毒副作用。
44.参见图1，是se-dox@pda-s2.2/rgd复合物的透射电镜图。通过透射电镜图我们可以看到se-dox@pda-s2.2/rgd复合物是一种均匀分散、表面光滑的纳米球，粒径约为70nm。对se-dox@pda-s2.2/rgd复合物的zeta电位分析结果显示(图2-3)，se-dox复合物的zeta电位为-10mv，在纳米粒子表面连接了pda的zeta电位变为-22mv。在体系中负载了s2.2和rgd后，纳米体系的zeta电位减至-25mv，说明s2.2和rgd存在于se-dox@pda-s2.2/rgd纳米体系中。经过表征，本发明成功制备双重靶向纳米硒-阿霉素。在铂耐药卵巢癌细胞的小鼠模型中验证双重靶向纳米硒-阿霉素能够逆转卵巢癌细胞的耐药性，阿霉素与纳米硒协同作用，发挥硒元素的抗癌、减少化疗药物毒性反应、降低肿瘤细胞耐药性的作用，将化学药物治疗、靶向治疗和硒元素抗癌结合于一体，符合精准医学的观念，有更好的杀伤耐药卵巢癌的效果。
45.参见图4，图5，通过对比实验，免疫组化结果确定卵巢癌组织整合素αvβ3和muc1高表达对比图。
46.图4通过将正常卵巢组织与卵巢癌组织进行免疫组化实验结果显示：卵巢癌组织细胞膜表面较正常卵巢组织高表达整合素αvβ3，证明了整合素αvβ3可以作为卵巢癌细胞膜表面靶点。同理：图5结果显示卵巢癌组织细胞膜表面较正常卵巢组织高表达muc1，证明了muc1同样可以作为卵巢癌细胞膜表面靶点。图4与图5一同证明了卵巢癌细胞膜表面较正常卵巢组织细胞高表达整合素αvβ3和粘蛋白muc1，两种可以作为卵巢癌细胞膜表面靶点。
47.参见图6的mtt结果显示双重靶向纳米硒-阿霉素对铂耐药卵巢癌细胞的治疗效果均优于无靶向，单靶向的纳米硒-阿霉素组。例如：在阿霉素浓度为0.25μm时，skov3细胞的存活率为60％，单独rgd和s2.2靶向的纳米硒-阿霉素复合物作用后skov3细胞的存活率约为57％和55％，然而，双靶向的纳米硒-阿霉素复合物作用后的细胞存活率降低至39％。
48.另外，本专利合成的双重靶向纳米硒-阿霉素体系治疗肿瘤细胞效果明显优于现有技术合成的tf-senps，表明本专利合成的双靶向纳米硒具有更强的抗肿瘤活性。通过实验，我们发现双重靶向纳米硒-阿霉素复合材料能够有效靶向铂耐药卵巢癌细胞，增加纳米硒-阿霉素药物进入卵巢癌细胞的速率，从而达到高效治疗铂耐药卵巢癌，降低化疗药物的使用剂量同时减少化疗毒副作用。
49.参见图7的mtt结果显示dox治疗铂敏感与铂耐药卵巢癌细胞株的浓度有明显差异性，差异有统计学意义(p＜0.05)。分别有双靶向纳米硒-阿霉素治疗铂敏感与铂耐药卵巢癌细胞，治疗两种细胞的双靶向纳米硒-阿霉素的药物浓度差异无统计学意义(p＞0.05)。通过实验，我们发现双重靶向纳米硒-阿霉素复合材料能够有效逆转铂耐药卵巢癌细胞的耐药性。
50.本发明还提供了双靶向纳米硒-阿霉素复合物在治疗铂耐药卵巢癌中的应用，采用上述制备方法得到的双靶向纳米硒-阿霉素复合物，可介导dox靶向运送到耐药卵巢癌后释放，提高肿瘤局部药物浓度，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，并减少化疗药物毒性反应、降低肿瘤细胞耐药性的作用。
51.所述纳米硒作为载体与rgd多肽、适配体s2.2和抗肿瘤药物dox正负电荷吸附结合，形成一个靶向的载药系统，所述rgd多肽能特异性的识别和结合卵巢癌细胞膜表面蛋白
整合素αvβ3，所述适配体s2.2能特异性的识别和结合卵巢癌细胞膜表面蛋白muc1，整合素αvβ3和muc1可以作为卵巢癌的靶点，其配体rgd多肽和适配体s2.2可用于抗卵巢癌的靶向探针。
52.已报道的负载dox的转铁蛋白靶向的硒纳米体系(tf-senps)的抗乳腺癌体系，粒径约为200nm(biomaterials,2013,34,29,7106-7116)，作为对比，本专利实施案例1中所合成的双靶向纳米硒-阿霉素复合物的粒径为80nm左右(图1-2)，本发明制备的双靶向纳米硒-阿霉素复合物在溶液中的粒径更小、稳定性更高，其可通过优化工艺，适当扩大合成规模，实现药物的商业化和应用。
53.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。