一种基于人工合成寡核苷酸有效抑制HIV-1病毒组装的方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种可在活细胞中有效干扰hiv-1病毒组装的方法。

背景技术：

1、i型人类免疫缺陷病毒(hiv-1)的组装和释放过程是其生命周期的重要阶段，该过程主要由gag蛋白质介导，gag以病毒rna分子作为骨架，在细胞膜上发生聚合，组装形成病毒颗粒后从宿主细胞的细胞膜释放。迄今为止，有大量研究结果证明gag-rna相互作用对于病毒组装具有关键作用，细胞膜上组装中的gag分子能够与多种rna发生相互作用，包括病毒rna和细胞内源的rna(selective and nonselective packaging of cellular rnas inretrovirus particles.(j virol.2007；81(12):6623-6631.))等。体外水溶液实验显示，在一定的rna长度范围内，与gag互作的rna越长，gag组装的程度越强(self-assembly invitro of purified ca-nc proteins from rous sarcoma virus and humanimmunodeficiency virus type 1(j virol.1995；69(10):6487-6497.))。

2、2014年，chen等提出了利用天然小rna阻断病毒颗粒组装的概念。研究发现，细胞普遍存在的微小rna(mirna)分子能够结合gag蛋白，扰乱gag在病毒rna上的多聚化过程，造成病毒颗粒组装失败。这些组装失败的gag蛋白将被宿主细胞以内吞的途径运输到细胞质中，在溶酶体内进行降解(microrna binding to the hiv-1 gag protein inhibits gagassembly and virus production(proc natl acad sci u s a.2014 jul 1；111(26):e2676–e2683.))。2017年，qu等进一步揭示了自噬在mirna-gag相互作用抑制病毒组装过程中的作用(inhibition of retroviral gag assembly by non-silencing mirnaspromotes autophagic viral degradation(protein cell.2018；9(7):640–651.))。

3、尽管具备上述优点，mirna在用于抑制病毒组装时仍存在一些问题。例如，需要对细胞进行过表达mirna的实验，但难以控制mirna的表达量；所选mirna局限于生物内源的分子种类，因此序列、结构、碱基构成、分子大小和化学修饰类型有限。

4、rna分子碱基互补的特性可以帮助核酸链自组装形成复杂的纳米结构，作为一种天然的生物材料具有可修饰性高、热稳定性好、生物安全性高等优势。研究者已证实可基于碱基的互补特性设计多个核酸链，使其在水溶液中自组装形成大小可控的rna纳米颗粒，并证实某些rna颗粒可在细胞中甚至活体内具有生物学功能。目前，使用特殊rna序列或结构作为自组装材料已经成为一个快速发展的研究领域(advancement of the emergingfield of rna nanotechnology(acs nano.2017；11(2):1142-1164.))。

技术实现思路

1、针对上述用mirna抑制病毒组装的不足之处，本发明设计了一系列人工合成的rna寡核苷酸，发现gag蛋白在细胞膜上对茎环结构的rna寡核苷酸具有结合倾向性，且该结合可以干扰病毒组装。将此概念引入设计可自组装的rna原件，得到空间结构更加复杂、具有多个茎环结构的rna自组装纳米材料，进一步提升人工合成的rna寡核苷酸对hiv-1病毒组装的抑制效果。

2、具体的，本发明首先提供了一种可有效结合hiv-1结构蛋白gag分子的人工合成茎环结构寡核苷酸，这种寡核苷酸可通过自组装(controllable self-assembly of rnatetrahedrons with precise shape and size for cancer targeting(adv mater.2016；28(34):7501-7.))的方法建立空间结构更加复杂的rna自组装纳米材料。

3、可自组装成具有多个茎环结构的rna自组装纳米材料的rna寡核苷酸可以是具有如下特征的寡核苷酸链：

4、1、具有茎环结构，在茎环结构的5’或3’端具有延长的单链，该延长的单链长度优选为16～20nt；

5、2、茎环结构中的环结构由15～25个碱基组成，茎结构的长度至少为4个碱基对；可以通过unafold等软件验证设计的rna寡核苷酸是否具有茎环结构；

6、3、不同rna寡核苷酸之间通过位于茎环结构5’或3’端的单链进行互补，自组装形成空间结构更加复杂的rna自组装纳米材料；可以通过自由设计单链的序列，以碱基互补配对的原理，实现两种、三种甚至更多rna寡核苷酸之间的组装(参见图2)；

7、4、rna寡核苷酸序列为无义寡核苷酸序列，即应当与人类基因组、病毒基因组没有同源性。

8、基于上述rna寡核苷酸，本发明提供了一种抑制hiv-1病毒组装的方法，包括以下步骤：

9、1)设计能够自组装成具有多个茎环结构的rna自组装纳米材料的至少两种rna寡核苷酸，然后人工合成所述rna寡核苷酸；

10、2)将步骤1)合成的多种rna寡核苷酸在1×tris缓冲液(100mm nacl，50mm tris，ph 8.0)中等摩尔浓度混合后，进行高温解链-缓慢降温退火，通过各个rna寡核苷酸单体中位于茎环结构5’或3’端的单链进行互补，从而实现自组装；然后对产物进行纯化，得到具有多个茎环结构的rna自组装纳米材料；

11、3)用所述rna自组装纳米材料转染感染了hiv-1病毒的细胞，干扰细胞内hiv-1病毒的组装。

12、步骤1)所设计的rna寡核苷酸应为与人类基因组、病毒基因组没有同源性的无义寡核苷酸序列；具有茎环结构，并在茎环结构的5’或3’端具有延长的单链；在步骤2)中，各个rna寡核苷酸单体通过位于茎环结构5’或3’端延长的单链进行互补来实现自组装，例如：两个rna寡核苷酸单体自组装形成哑铃形结构的rna自组装纳米材料，三个rna寡核苷酸单体自组装形成“y”形结构的rna自组装纳米材料。

13、优选地，步骤1)设计的rna寡核苷酸的茎环结构中，环结构由15～25nt组成，茎结构的长度至少为4个碱基对，所述延长的单链长度为16～20nt。

14、进一步地，为在细胞环境中抵抗核酸酶的降解，所述rna寡核苷酸是所有碱基皆为2’-o-甲基化修饰的寡核苷酸。也可以使用其他具有抗核酸酶降解能力的化学修饰，例如硫代磷酸(phosphorothioate，ps)修饰、锁核酸(locked nucleic acid，lna)修饰、吗啉基(morpholino)修饰等。

15、在本发明的实施例中，设计了如序列表中的seq id no：1至seq id no：4所示的四种rna寡核苷酸，其中，将seq id no：1和2所示的rna寡核苷酸等量混合后自组装，可形成哑铃形结构的rna自组装纳米材料；将seq id no：1、3和4所示的rna寡核苷酸等量混合后自组装，可形成“y”形结构的rna自组装纳米材料，如图2所示。

16、优选地，在步骤2)中使用3000nmwl纤维素过滤柱对自组装产物进行纯化。

17、优选地，在步骤3)采用电转染的方法使所述rna自组装纳米材料转染细胞。

18、在本发明的实施例中，通过下述实验验证了本发明技术方案的可行性和有效性：

19、1)培养细胞，转染病毒基因载体pnl43δpolδenv-gag，在细胞中表达病毒rna与gag蛋白质；

20、2)电转染rna寡核苷酸或其自组装纳米材料，进行gag-rna寡核苷酸免疫共沉淀，测定二者的相互作用情况，即用特异性抗体提取细胞膜上的gag蛋白质，检测免疫沉淀物中rna寡核苷酸的富集程度，分析不同寡核苷酸与细胞膜上gag分子结合的能力；

21、3)电转染rna寡核苷酸或其自组装纳米材料，进行病毒颗粒释放效率分析，即通过western blot方法测定hiv-1病毒受到rna寡核苷酸或其自组装纳米材料干扰后的释放效率，证实本方法的有效性。

22、本发明的有益效果：

23、本发明通过自组装的方法构建了具有复杂空间结构的rna自组装纳米材料，进一步提高了人工合成的rna寡核苷酸抑制病毒组装的能力。利用人工合成小分子rna易操作、可控性高的特性，有效抑制hiv-1病毒的释放，拓展了rna寡核苷酸在生物医学领域的应用。这是首次实现使用人工合成的rna寡核苷酸以及自组装纳米材料抑制hiv-1病毒的组装，为疾病治疗提供了新的思路。