柠檬酸在制备定向促进肠道有益菌增殖的产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及柠檬酸在制备定向促进肠道有益菌增殖的产品中的应用。


背景技术：

2.柠檬酸一种重要的有机酸，天然柠檬酸在自然界中分布很广，例如在植物柠檬、柑橘、菠萝等果实中，或在动物的骨骼、肌肉、血液中都含有柠檬酸。人工合成的柠檬酸是用砂糖、糖蜜、淀粉、葡萄等含糖物质发酵而制得的。柠檬酸用途广泛，在食品、化工、化妆品、医药等多种工业具有多种用途，同时含有丰富的药用价值，具有消除和防止皮肤色素暗沉、祛痰、美白、润肤、降低胆固醇等作用。此外，柠檬酸还具有抑制多种病原菌的作用。
3.肠道微生物从功能上可以分为共生菌、有益菌和病原微生物三大类，它们在人体肠道中保持着一种动态的平衡。这群微生物发挥的功能多种多样，包括物质代谢、生物屏障、免疫调控及宿主防御等，肠道微生物不仅帮助人体从食物中吸收营养，还能够合成氨基酸、有机酸、维生素、抗生素等供我们利用，并可以将产生的毒素加以代谢，减少对人体的毒害。
4.不同的饮食习惯和生活方式对人体肠道微生物种类有很大的影响，人的多种疾病与肠道微生物密切相关。因此，肠道微生物和人体存在着互利共生的关系，对于维持人的健康发挥着重要的作用。据文献报道，roseburia与克罗恩、痛风、肝硬化、抑郁和二型糖尿病有关。
5.fmt作为一种新兴的医疗技术，为患者提供对其疾病有改善作用的健康菌群是最重要的一环。通过二代测序技术可以检测出患者的菌群情况，为精准fmt提供更高的需求。因此，定向增殖对患者有益的供体肠道细菌是未来fmt所亟需的技术，但是如何实现有益菌的定向增殖是关键环节。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供柠檬酸在制备定向促进肠道有益菌增殖的产品中的应用。
8.本发明的另一目的在于提供一种用于促进肠道有益菌增殖的产品，旨在显著促进肠道有益菌的增殖。
9.本发明的第三目的在于提供柠檬酸在制备用于治疗肠道有益菌含量降低所导致的疾病的药物中的应用。
10.本发明是这样实现的：
11.第一方面，本发明提供柠檬酸在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用。
12.在可选的实施方式中，肠道有益菌包括roseburia、clostridium、anaerostipes、turicibacter、faecalibacterium和blautia。
13.在可选的实施方式中，肠道有益菌选自roseburia、clostridium、anaerostipes、
turicibacter和faecalibacterium中的至少一种。
14.在可选的实施方式中，肠道有益菌选自roseburia、clostridium、faecalibacterium和turicibacter中的至少一种。
15.在可选的实施方式中，肠道有益菌选自roseburia、clostridium和faecalibacterium中的至少一种。
16.在可选的实施方式中，肠道有益菌选自roseburia和clostridium中的至少一种。
17.在可选的实施方式中，肠道有益菌为clostridium。
18.第二方面，本发明提供一种用于促进肠道某些特定有益菌增殖的产品，包括柠檬酸。
19.第三方面，本发明提供柠檬酸在制备用于治疗肠道某些有益菌含量降低所导致的疾病的药物中的应用；
20.优选地，药物包括用于粪菌移植的菌液或胶囊。
21.在可选的实施方式中，某些肠道有益菌含量降低所导致的疾病包括克罗恩、痛风、肝硬化、抑郁和二型糖尿中的至少一种。
22.本发明具有以下有益效果：发明人创造性地发现，柠檬酸可以对多种肠道有益菌的增殖起到作用，可以制备得到用于促进肠道有益菌增殖的产品，基于很多疾病是由于肠道有益菌含量减少所导致的，可以利用柠檬酸制备成用于治疗肠道某些有益菌含量降低所导致的疾病的药物。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
24.图1为将柠檬酸应用到促进有益菌增殖中的方法的菌群经柠檬酸干预前后的丰度变化示意图。
具体实施方式
25.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
26.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
27.发明人通过长期的探究发现，柠檬酸可以促进多种肠道有益菌的增殖，可以在制备促进肠道有益菌增殖的产品中得到应用。
28.柠檬酸可以促进以下几种肠道有益菌的增殖，包括roseburia、clostridium、anaerostipes、turicibacter、faecalibacterium和blautia。可以对以上几种菌形成的菌群起到增殖作用，具有很好的市场应用前景。
29.在一些实施例中，肠道有益菌选自roseburia、clostridium、anaerostipes、
turicibacter和faecalibacterium中的至少一种。发明人发现，柠檬酸对以上5种菌均表现出较明显的促进增殖的效果，效果要优于blautia。
30.在优选的实施例中，肠道有益菌选自roseburia、clostridium、faecalibacterium和turicibacter中的至少一种。发明人发现，柠檬酸对以上4种菌有显著的促进增殖的效果，效果要优于anaerostipes。
31.在更优选的实施例中，肠道有益菌选自roseburia、clostridium和faecalibacterium中的至少一种，柠檬酸对以上3种菌有显著的促进增殖的效果，整体效果要优于turicibacter。虽然，柠檬酸对turicibacter的促进程度最好，但是整体含量非常低，市场应用前景并不理想。
32.在进一步优选的实施例中，肠道有益菌选自roseburia和clostridium中的至少一种，柠檬酸对以上2种菌有显著的促进增殖的效果，要好于faecalibacterium，增殖作用之后这两种有益菌的含量较好，且增殖率可以达到85倍以上。
33.在最优选的实施例中，肠道有益菌为clostridium，柠檬酸对clostridium增值率可以达到350倍以上，且含量较高，具备非常好的应用前景。
34.本发明实施例提供一种用于促进肠道有益菌增殖的产品，包括柠檬酸，该产品可以为柠檬酸单剂，也可以是柠檬酸和其他具有促进肠道有益菌增殖的成分形成的组合物。
35.具体地，该产品可以为食品、保健品或药品，形式不限。
36.在一些实施例中，药物可以为用于粪菌移植的菌液或胶囊，利用柠檬酸定向增殖肠道有益菌的供体菌群为精准fmt提供了更多选择。
37.本发明实施例还提供柠檬酸在制备用于治疗肠道有益菌含量降低所导致的疾病的药物中的应用，根据现有文献的记载，roseburia与克罗恩、痛风、肝硬化、抑郁和二型糖尿病有关。
38.因此，可以利用柠檬酸制备形成药物，用于治疗克罗恩、痛风、肝硬化、抑郁和二型糖尿等疾病。
39.基于现有文献的记载，可以利用柠檬酸促进肠道有益菌roseburia、clostridium、anaerostipes、turicibacter增殖的特性，可以利用柠檬酸制备形成药物，用于治疗克罗恩、痛风、肝硬化、抑郁和二型糖尿等疾病。
40.试验例1
41.为保证检测的准确性，利用人体的肠道菌群在体外进行体内模拟实验，取人体粪便作为肠道菌群样品，观察柠檬酸干预对于肠道菌群的作用，具体操作过程如下：
42.(1)基础培养基配制
43.称取60g改良gam肉汤培养基粉末，倒入1000ml烧杯中。用量筒量取800ml超纯水倒入烧杯中，并放到磁力加热搅拌器上搅拌至完全溶解。将上述完全溶解的溶液引流至1000ml容量瓶，并用少量超纯水冲洗烧杯后倒入容量瓶，重复3次。将容量瓶中的液体用超纯水定容，塞上盖子后上下颠倒10次以确保溶液充分混匀。
44.将定容后的溶液倒入玻璃瓶，每1000ml的瓶子内放500ml培养基，将装有培养基的玻璃瓶，瓶盖拧松，放入脉冲高压灭菌锅，使用液体程序，121℃，15分钟。灭菌完后，拧紧瓶盖，冷却至室温。
45.(2)原始肠道菌的制备
46.称量出10g粪便样品，取适量磷酸缓冲盐溶液(ph＝7.4)加至离心管中，在振荡器上充分混匀。然后将完全混匀的样品平均分装至新50ml离心管中，每管再加适量磷酸缓冲盐溶液。
47.把稀释好的样品依次通过20目、50目、100目、200目的滤网进行过滤，收集滤液至离心管中，将离心管放入离心机，配平，6000g，4℃离心15min，弃上清。将沉淀称量之后，以终浓度为5％用磷酸盐缓冲溶液定容，得到肠道微生物样品。
48.(3)柠檬酸-gam培养肠道细菌
49.量取上述gam培养基分装至玻璃管中，每管2ml，接着取柠檬酸溶液(柠檬酸为市购，纯度99％，用磷酸缓冲盐溶液溶解至质量百分浓度为：5％)，加入上述装有gam培养基的玻璃管中，每管2ml，作为试验组。同时还设置有空白对照组，每组3个重复，分组具体如下：
50.试验组：2ml gam培养基+2ml柠檬酸溶液+1ml磷酸缓冲盐溶液；
51.对照组：2ml gam培养基+3ml磷酸缓冲盐溶液；
52.将玻璃管盖拧紧再转移至厌氧箱传递箱中，放置之前需用84消毒液消毒处理。放入厌氧箱后，拧松瓶盖，置换氧气，需置换12个小时。将上述处理后得到的肠道微生物样品分别接种至试验组(柠檬酸-gam培养基)以及空白对照组(gam培养基-磷酸缓冲盐溶液)中，每管1ml。于厌氧箱中培养72小时后，观察菌群的生长状况。
53.接着分别将试验组样品和对照组样品，10000rpm，3min离心，弃上清，将沉淀用液氮处理，分别测定试验组和对照组中的肠道菌群丰度，即不同肠道微生物在检测到的所有菌种中所占的百分比，其中部分肠道菌群的丰度测定结果如表1所示。
54.表1不同处理组的肠道菌群丰度
55.[0056][0057]
注：促进率的计算按照如下公式计算：(试验组均值-对照组均值)/对照组均值。
[0058]
对部分肠道菌群经柠檬酸干预前后的丰度变化进行显著性分析，分析结果如图1所示，其中**表示p＜0.01，即丰度变化有极显著差异；*表示p＜0.05，即丰度变化有显著差异。
[0059]
从表1和图1可知，柠檬酸对roseburia、clostridium、faecalibacterium、blautia、anaerostipes、turicibacter均有不同程度的促进增殖的效果，但是对blautia、anaerostipes作用不明显，对roseburia、clostridium、turicibacter促进增殖的效果非常理想，但是考虑到含量的问题，对roseburia、clostridium的促进作用更有应用价值。综合含量和促进率，柠檬酸对clostridium的促进效果最为理想。
[0060]
综上所述，本发明通过体外模拟肠道环境，并以健康人体粪便中收集的肠道菌群作为样本，将柠檬酸应用到定向促进有益菌(roseburia、clostridium、turicibacter)增殖发酵，进而可以用于制备得到药品来改善或治疗克罗恩、痛风、肝硬化、抑郁和二型糖尿病等疾病，为临床应用提供科学依据，达到精准制备有益菌剂的目的。
[0061]
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。