一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒及其制备方法和应用

1.本发明涉及纳微米材料技术领域，具体涉及一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.黄酮醇类(flavonole)是各类黄酮化合物中数量最多、分布最广泛的一类，包括槲皮素(quercetin)、芦丁(rutin)、杨梅黄酮(myricetin)、染料木黄酮(genistein)、木樨草素(luteolin)等。黄酮醇类化合物有提高动物机体抗氧化及清除自由基的能力。其中，部分黄酮醇类化合物常含有多个邻苯酚基团，成为黄酮类多酚，例如槲皮素、芦丁、杨梅黄酮、染料木黄酮都含有一个以上酚羟基，可与过氧自由基结合生成黄酮自由基，进而与其他自由基反应，从而终止自由基链式反应。同时黄酮醇类化合物可提高机体免疫机能，促进机体健康。
3.锌是体内数十种酶的辅酶，可以促进人体的各种物质代谢，促进人的免疫系统的功能，增强对病毒细菌的抗病能力，可以促进皮肤粘膜的发育，在治疗溃疡性肠炎方面具有巨大的潜力。因此，研究黄酮类多酚化合物与锌离子共同作用对于治疗炎症性肠炎具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒及其制备方法和应用，该制备方法利用黄酮醇类化合物与锌离子间金属有机配位作用，在引入磷酸盐的同时，黄酮类多酚化合物调整磷酸锌盐的形貌和粒径，优化其各项性能，制备得到的微米颗粒有效治疗炎症性肠炎并且效果显著。
5.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
6.本发明第一方面提供一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
7.将黄酮类多酚化合物的有机溶液和锌盐的有机溶液混合，得到混合溶液；
8.向混合溶液中添加磷酸盐缓冲液进行反应，得到所述基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒。
9.优选地，所述黄酮类多酚化合物选自槲皮素、芦丁、杨梅黄铜和染料木黄酮中的任意一种；所述锌盐选自氯化锌、硫酸锌、碘化锌和溴化锌中的任意一种。
10.优选地，所述反应为在搅拌条件下反应10min～12h。
11.优选地，所述黄酮类多酚化合物的有机溶液和锌盐的有机溶液中的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯。
12.优选地，所述黄酮类多酚化合物的有机溶液的浓度为1～50mm。
13.优选地，所述锌盐的有机溶液的浓度为1～50mm。
14.优选地，所述黄酮类多酚化合物的有机溶液和锌盐的有机溶液的体积比为1∶(0.5～1.5)。
15.优选地，所述磷酸盐缓冲液与混合溶液的体积比为(1～3)∶1；所述磷酸盐缓冲液的浓度为1～100mm，ph值为5～8。
16.优选地，所述制备方法还包括对反应产物进行离心和洗涤。
17.本发明第二方面提供一种上述制备方法制得的基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒。
18.本发明第三方面提供一种上述制备方法制得的基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒在制备治疗炎症性肠炎药物中的应用。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
20.本发明利用黄酮类多酚与zn
2+
配位，调控磷酸锌盐的形貌和粒径，优化其各项性能，在体外达到高过氧化氢和自由基清除率，能清除炎症细胞内高表达的ros，实现m1型巨噬细胞向m2巨噬细胞的极化，进而有效治疗炎症性肠炎并且效果显著。
21.本发明制备得到的部分微米颗粒带负电荷，可与带正电荷的肠道炎症部位静电结合，能够更好的减少全身暴露的风险。
22.本发明的整个制备过程在室温中进行，制备简单，所需材料安全易得，无毒无害。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
24.图1是对照例1所得zn-pbs的sem图。
25.图2是对照例1所得zn-pbs的dls粒径电位结果图。
26.图3是对照例2所得zn-pbs的eds能谱分析结果。
27.图4是对照例2所得zn-pbs的细胞毒性研究结果。
28.图5是实施例1所得微米颗粒的sem图。
29.图6是实施例1所得微米颗粒的电位结果图。
30.图7是实施例2所得微米颗粒的dls粒径电位结果图。
31.图8是实施例3所得微米颗粒的eds能谱分析结果。
32.图9是实施例4所得微米颗粒的sem图。
33.图10是实施例4所得微米颗粒的电位结果图。
34.图11是实施例5所得微米颗粒的dls粒径电位结果图。
35.图12是实施例6所得微米颗粒的eds能谱分析结果。
36.图13是实施例7所得微米颗粒的sem图。
37.图14是实施例7所得微米颗粒的dls粒径电位结果图。
38.图15是实施例7所得微米颗粒的eds能谱分析结果。
39.图16是实施例7所得微米颗粒对巨噬细胞胞内ros水平的影响。
40.图17是实施例8所得微米颗粒的dls粒径电位结果图。
41.图18是实施例8所得微米颗粒对巨噬细胞极化的影响情况。
42.图19是实施例8所得微米颗粒对胞内ros清除效果。
43.图20是实施例9所得微米颗粒的sem图。
44.图21是实施例9所得微米颗粒的dls粒径电位结果图。
45.图22是实施例9所得微米颗粒的eds能谱分析结果。
46.图23是实施例9所得微米颗粒的xps分析结果。
47.图24是实施例9所得微米颗粒的细胞毒性结果。
48.图25是实施例10所得微米颗粒的sem图。
49.图26是实施例10所得微米颗粒的dls粒径电位结果图。
50.图27是实施例10所得微米颗粒的体外h2o2清除结果。
51.图28是实施例10所得微米颗粒的体外dpph清除结果。
52.图29是实施例11所得微米颗粒的dls粒径电位结果图。
53.图30是实施例11所得微米颗粒抑制炎症细胞因子分泌情况。
54.图31是实施例1、实施例4以及实施例9的微米颗粒的x射线衍射图；
55.图32是实施例1、实施例4以及实施例9的微米颗粒的体外dpph清除结果；
56.图33是实施例1、实施例4以及实施例9的微米颗粒体外h2o2清除结果。
具体实施方式
57.下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
58.需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
59.实施例1
60.本实施例为一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
61.将槲皮素分散于无水乙醇中，使其最终浓度为30mm；
62.将氯化锌溶解于无水乙醇中，使其最终浓度为10mm；
63.将上述溶液各取1ml混匀，加入2ml的50mm，ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1h，离心，用去离子水洗涤，得到上述基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒(znqct)。
64.实施例2
65.本实施例为一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
66.将槲皮素分散于无水乙醇中，使其最终浓度为50mm；
67.将氯化锌溶解于无水乙醇中，使其最终浓度为50mm；
68.将上述溶液各取2ml混匀，加入4ml的100mm，ph 6.0的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌反应10min，离心，用去离子水洗涤，得到上述基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒(znqct)。
69.实施例3
70.本实施例为一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒的制备方法，该制备方
法包括如下步骤：
71.将槲皮素分散于无水乙醇中，使其最终浓度为1mm；
72.将氯化锌溶解于无水乙醇中，使其最终浓度为1mm；
73.将上述溶液各取0.5ml混匀，加入1ml的1mm，ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌反应12h，离心，用去离子水洗涤，得到上述基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒(znqct)。
74.实施例4
75.本实施例为一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
76.将芦丁分散于无水乙醇中，使其最终浓度为30mm；
77.将氯化锌溶解于无水乙醇中，使其最终浓度为10mm；
78.将上述溶液各取1ml混匀，加入2ml的50mm，ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1h，离心，用去离子水洗涤，得到上述基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒(znrt)。
79.实施例5
80.本实施例为一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
81.将芦丁分散于无水乙醇中，使其最终浓度为50mm；
82.将氯化锌溶解于无水乙醇中，使其最终浓度为50mm；
83.将上述溶液各取2ml混匀，加入4ml的100mm，ph 6.0的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌反应10min，离心，用去离子水洗涤，得到上述基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒(znrt)。
84.实施例6
85.本实施例为一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
86.将芦丁分散于无水乙醇中，使其最终浓度为1mm；
87.将氯化锌溶解于无水乙醇中，使其最终浓度为1mm；
88.将上述溶液各取0.5ml混匀，加入1ml的1mm，ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌反应12h，离心，用去离子水洗涤，得到上述基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒(znrt)。
89.实施例7
90.本实施例为一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
91.将杨梅黄酮分散于无水乙醇中，使其最终浓度为10mm；
92.将氯化锌溶解于无水乙醇中，使其最终浓度为10mm；
93.将上述溶液各取1ml混匀，加入2ml的50mm，ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1h，离心，用去离子水洗涤，得到上述基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒(znmyr)。
94.实施例8
95.本实施例为一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
96.将杨梅黄酮分散于无水乙醇中，使其最终浓度为20mm；
97.将氯化锌溶解于无水乙醇中，使其最终浓度为10mm；
98.将上述溶液各取1ml混匀，加入2ml的50mm，ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1h，离心，用去离子水洗涤，得到上述基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒(znmyr)。
99.实施例9
100.本实施例为一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
101.将杨梅黄酮分散于无水乙醇中，使其最终浓度为30mm；
102.将氯化锌溶解于无水乙醇中，使其最终浓度为10mm；
103.将上述溶液各取1ml混匀，加入2ml的50mm，ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1h，离心，用去离子水洗涤，得到上述基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒(znmyr)。
104.实施例10
105.本实施例为一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
106.将杨梅黄酮分散于无水乙醇中，使其最终浓度为10mm；
107.将氯化锌溶解于无水乙醇中，使其最终浓度为20mm；
108.将上述溶液各取1ml混匀，加入2ml的50mm，ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1h，离心，用去离子水洗涤，得到上述基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒(znmyr)。
109.实施例11
110.本实施例为一种基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
111.将杨梅黄酮分散于无水乙醇中，使其最终浓度为30mm；
112.将氯化锌溶解于无水乙醇中，使其最终浓度为10mm；
113.将上述溶液各取1ml混匀，加入2ml的50mm，ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌反应0.5h，离心，用去离子水洗涤，得到上述基于黄酮类多酚与锌离子配位的微米颗粒(znmyr)。
114.对照例1
115.本对照例为一种磷酸锌盐(zn-pbs)微米颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
116.将氯化锌溶解于无水乙醇中，使其最终的浓度为10mm；
117.取1ml氯化锌乙醇溶液，加入2倍体积的磷酸盐缓冲溶液(浓度为50mm，ph 7.4)，搅拌反应1h，离心，用去离子水洗涤，得到zn-pbs微米颗粒。
118.对照例2
119.本对照例为一种磷酸锌盐(zn-pbs)微米颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
120.将氯化锌溶解于无水乙醇中，使其最终的浓度为5mm；
121.取1ml氯化锌乙醇溶液，加入2倍体积的磷酸盐缓冲溶液(浓度为50mm，ph 5)，搅拌反应12h，离心，用去离子水洗涤，得到zn-pbs微米颗粒。
122.实验例
123.分别按照实施例1～11以及对比例1～2中的制备方法制备得到的微米颗粒；
124.一、对对比例1的微米颗粒进行电子显微镜扫描(sem)和粒径点位分析(dls)，电位
扫描结果如图1所示，dls粒径点位结果如图2所示；
125.由图1、图2可知：其粒径为1833
±
262.7nm，pdi为0.222
±
0.061，电位为-53.4
±
0.265mv。
126.二、对对比例2的微米颗粒进行eds能谱分析和细胞毒性试验，eds能谱分析结果如图3所示，细胞毒性试验结果如图4所示；
127.由图3可知，在微米颗粒中存在元素zn、p、o、c，且这些元素是均匀分布的；
128.由图4可知，当zn-pbs浓度高于12.5μg/ml时，随着浓度的增加细胞活性降低，说明zn-pbs对细胞有明显的毒性。
129.三、对实施例1的微米颗粒进行电子显微镜扫描(sem)以及dls粒径结果如图5所示；电位结果如图6所示；
130.由图5可知，相比于对比例1的微米颗粒，本发明通过加入槲皮素之后制备得到的微米颗粒形貌更加均一。
131.由图6可知，其电位为﹣24
±
0.603mv。
132.四、对实施例2的微米颗粒进行dls粒径电位分析，分析结果如图7所示；
133.由图7可知，其粒径为1787
±
293.3nm，pdi为0.892
±
0.160，电位为2.9
±
1.67mv。
134.五、对实施例3的微米颗粒进行eds能谱分析，分析结果如图8所示；
135.由图8可知，本发明制备得到的微米颗粒中存在元素c、o、zn、p、na。
136.六、对实施例4的微米颗粒进行电子显微镜扫描以及dls粒径电位分析，扫描结果如图9所示；微米颗粒电位分析如图10所示；
137.由图9可知，相比于对比例1的zn-pbs，加入芦丁之后得到的微米颗粒形貌更加均一。
138.由图10可知，其点位为﹣30
±
0.379mv。
139.七、对实施例5的微米颗粒进行dls粒径电位分析，结果如图11所示；
140.由图11可知，其粒径为2366
±
787.8nm，pdi为0.983
±
0.029，电位为0.617
±
0.595mv。
141.八、对实施例6的微米颗粒进行eds能谱分析，结果如图12所示；
142.由图12可知，本发明微米颗粒存在元素o、na、p、zn。
143.九、对实施例7的微米颗粒进行进行电子显微镜扫描(sem)、粒径电位分析(dls)以及eds能谱分析，扫描结果如图13所示，dls电位分析结果如图14所示，eds能谱分析结果如图15所示
144.由图13可知，相比于对比例1的zn-pbs，加入杨梅黄酮之后的微米颗粒形貌更加均一。
145.由图14可知，本发明微米颗粒粒径为2194
±
82nm，pdi为0.482
±
0.224，电位为-39.6
±
0.4mv。
146.由图15可知，本发明微米颗粒存在元素zn、p、o、c，且这些元素是均匀分布的；
147.实施例7制备得到的微米颗粒对巨噬细胞内ros水平的影响研究：
148.巨噬细胞贴壁24h后，加入上述微米颗粒或5-asa与细胞共孵育一定时间，5-asa是治疗肠炎的临床用药，收集细胞染dcfh-da，洗涤固定，用流式细胞仪测其荧光强度进行定量分析，得到微米颗粒对巨噬细胞胞内ros水平的影响。如图16所示，与空白对照以及5-asa
组相比，该微米颗粒提高了巨噬细胞胞内ros水平，说明本发明微米颗粒在该浓度下可激活巨噬细胞。
149.十、对实施例8的微米颗粒剂型dls粒径电位分析，以及对巨噬细胞极化、胞内ros清楚效果的研究；
150.其中，dls粒径电位分析结果如图17所示；
151.由图17可知，该微米颗粒粒径为1741
±
22.34nm，pdi为0.396
±
0.071，电位为-44.5
±
0.3mv。
152.微米颗粒对巨噬细胞极化应影响的研究：
153.巨噬细胞贴壁24h后，加入不同浓度的微米颗粒与细胞共孵育一定时间，收集细胞染cd80和cd206，洗涤固定，用流式细胞仪测其荧光强度进行定量分析得到图18，其中cd80标记m1型细胞，cd206标记m2型细胞。由图18可知，高浓度的微米颗粒可以刺激细胞向m2型极化，从而减少炎症细胞的产生，证实该材料在治疗炎症方面的可行性。
154.微米颗粒对胞内ros清楚效果的研究：
155.待巨噬细胞贴壁24h后，用lps刺激细胞2h，分别再加微米颗粒、ha、kpv或5-asa孵育一定时间后，收集细胞染dcfh-da，洗涤固定，用流式细胞仪进行定量检测，并分析得到图19。由图19可知，在经过lps刺激后，raw264.7细胞胞内氧显著升高，证明lps可以有效地刺激细胞胞内氧的产生。5-asa是治疗肠炎的临床用药，ha是透明质酸；kpv是抗炎三肽；相比于阳性对照lps组和5-asa组，经过微米颗粒(znmyr)处理组的raw264.7细胞胞内氧水平明显降低；证明了在4h时znmyr具有清除胞内氧的作用。
156.十一、对实施例9的微米颗粒进行电子显微镜扫描(sem)、dls粒径电位分析以及eds能谱分析和x光电子能谱分析(xps)，其中，sem图如图20所示，dls粒径电位分析图如图21所示，eds能谱分析图如图22所示，xps光电子能谱分析如图23所示；
157.由图20～23可知，相比于对比例1的zn-pbs微米颗粒，本发明加入杨梅黄酮之后微米颗粒形貌更加均一；其粒径为1776
±
169.5nm，pdi为0.184
±
0.112，电位为-25.0
±
0.3mv；元素zn、p、o、c的存在，且这些元素是均匀分布的；杨梅黄酮调控下的微米颗粒的表面c元素含量很高，说明杨梅黄酮主要存在于微米颗粒的表面。
158.对实施例9的微米颗粒进行细胞毒性研究：
159.巨噬细胞贴壁24h后，加入不同浓度的微米颗粒孵育一定时间，加入cck-8溶液共孵育一定时间，用酶标仪测定其450nm处的吸光度值，以没有细胞的孔作为空白对照，以含有细胞，不含微米颗粒的孔作为阴性对照，计算细胞活性。由图4和图24相比较，与对比例2中zn-pbs微米颗粒相比，加入杨梅黄酮进行调控后的材料的细胞毒降低，证实了加入杨梅黄酮后对材料的优化。
160.十二、对实施例10的微米颗粒进行电子显微镜扫描(sem)、dls粒径电位分析，以及体外h2o2、dpph清除效果研究，其体外h2o2、dpph清除效果方法如下：将微米颗粒在体外与一定浓度的h2o2溶液共孵育一定时间之后，采用h2o2检测试剂盒对于孵育后剩余的h2o2浓度进行测定，测定560nm处的吸光度值，以确定材料对于h2o2的清除作用；将微米颗粒在体外与一定浓度的dpph醇溶液共孵育一定时间之后，在515nm处检测各组的吸光度，并以未加入任何药物处理的dpph自由基溶液作为空白对照，来确定材料对于dpph的清除作用，本次实验材料为实施例10的微米颗粒、kpv以及5-asa；
161.其中，电子显微镜扫描结果如图25所示，dls粒径电位分析结果如图26所示，体外h2o2清楚效果如图27所示，体外dpph清除效果如图28所示；
162.由图25、26可知，该微米颗粒的粒径为1741
±
22.34nm，pdi为0.396
±
0.071，电位为-44.5
±
0.3mv；
163.由图27、28可知，该微米颗粒具有很好的体外清除h2o2和dpph的效果。
164.十三、对实施例11的微米颗粒进行dls粒径电位分析以及对诱导巨噬细胞分泌细胞因子的研究；
165.其中，dls粒径电位分析结果如图29所示；
166.由图29可知，该微米颗粒粒径为1167
±
24.85nm，pdi为0.242
±
0.081，电位为-43.1
±
1.3mv。
167.对诱导巨噬细胞分泌细胞因子的研究如下：
168.用lps刺激细胞2h，再加微米颗粒、ha、kpv或5-asa孵育一定时间后，收集细胞上清液，采用elisa法对于il-6、tnf-α检测。实验中未加入任何刺激的细胞组和经lps刺激的细胞组分别作为阴性对照和阳性对照。由图30可以看出，在经过lps刺激后，raw264.7细胞分泌的炎性因子il-6、tnf-α浓度显著升高，证明lps可以有效地刺激细胞分泌炎性因子。相比于阳性对照lps组和5-asa组，经过微米颗粒孵育的raw264.7细胞炎性因子il-6、tnf-α的分泌水平明显降低。证明了该微米颗粒具有显著的抑制炎症反应的作用。
169.十四：对实施例1、实施例4以及实施例9的微米颗粒进行x射线衍射仪技术分析，分析结果如图31所示；
170.由图31可知，znmyr的谱图与pdf#45-0122的谱图一致，即znmyr是晶体na6(znpo4)6·
8h2o；znrt的谱图与pdf#47-0962的谱图一致，即znrt是晶体na3(znpo4)3·
4h2o；znqct的谱图同时含有pdf#47-0962和pdf#42-0439的峰，即由na3(znpo4)3·
4h2o和hznpo4·
h2o共同组成；可见，不同的黄酮类化合物诱导形成的磷酸锌盐也会有所差别。
171.十五：对实施例1、实施例4以及实施例9的微米颗粒进行体外清除dpph自由基和清除过氧化氢实验；
172.实验结果如图32、33所示；
173.由图32、33可知，三者都具有抗炎、抗氧化性能，但黄酮类多酚的种类不同，抗炎抗氧化性能也会略有不同。
174.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。