Tip150蛋白激动剂在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的应用的制作方法

tip150蛋白激动剂在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的应用
技术领域
1.本发明涉及dna重组技术领域，尤其涉及一种tip150蛋白激动剂在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的应用。


背景技术：

2.精子生成是一个复杂的过程，可分为3个阶段：有丝分裂阶段、减数分裂阶段以及精子形成阶段。精原细胞经过有丝分裂分化为初级精母细胞，然后经过两次减数分裂，一个精母细胞分化为4个精子细胞。精子细胞是圆形的，通过一系列变态反应发育成成熟精子。成熟精子由两部分构成：头部(含颈部)和尾部(含中段和主段)组成。而鞭毛的形成起源于早期圆形精子细胞的中心粒结构。鞭毛轴丝内“9+2”微管排列方式为精子运动提供动力。“9+2”微管排列方式是指外周有9对对称排列的微管双联体，其间由动力蛋白相互连接，双联体与2对中央微管呈横向辐式连接。此外，精子尾部鞭毛还存在附属结构：外层致密纤维、纤维鞘、线粒体鞘和质膜等。
3.精子在雌性生殖道内运动并最终与卵细胞结合完成受精，主要依靠精子鞭毛的摆动，所以结构完整的鞭毛对精子到达受精部位、完成受精的全过程至关重要。精子鞭毛多发性形态异常(mmaf)是一种严重的精子鞭毛畸形，典型mmaf患者精子尾部出现缺失，短，卷曲，弯折和不规则等，从而导致精子活力严重不足；透射电镜观察鞭毛横断面出现中心微管缺失，纤维鞘和外层致密纤维结构紊乱，动力蛋白臂缺失等超微结构缺陷。但mmaf的遗传学病因尚未完全明确。
4.有研究报道通过对90例汉族男性mmaf患者进行全外显子测序和遗传学分析，发现5例(5.6％)mmaf患者携带有cfap58基因的双等位突变。研究者利用透射电镜技术和多种分子生物学实验发现，cfap58基因突变患者由于精子尾部轴丝组装异常和中段线粒体鞘发育异常而导致精子运动功能障碍和畸形，从而引起男性不育。小鼠相关实验发现，cfap58基因敲除雄性小鼠完全不育，精子尾部表现为与患者一致的短尾、卷尾等mmaf表型。另外，与精子鞭毛结构的异常相关的基因还包括减数分裂特定核结构蛋白1(mns1)、spag16、kif3a、spef2、klc3等。这些基因的缺陷或突变会引起精子尾部结构异常，如特征性的内外动力臂部分或完全缺失；纤维鞘过度增生、肥厚，组织结构紊乱，纤维鞘发育不良；非特异性鞭毛结构异常，微管结构的随机性、非均一性数量异常等。精子鞭毛结构的异常，最终会导致精子功能的丧失，从而引发一系列的临床疾病。至今，越来越多的基因被证实与精子鞭毛正常运动相关，因此，需要进一步探索这些基因参与精子运动的机制，为临床疾病的早期发现与治疗提供有效的途径。
5.我国拥有世界上面积最大、海拔最高、居住人口最多的高原，高原地区不仅自然资源丰富，也是我国社会经济发展的重要地区和戍守边疆的前沿阵地。高原低氧(低张性缺氧)环境对男性生殖功能有显著负面影响，大量关于人类、羊驼、大鼠与小鼠精子(elongatingspermatid/spermatozoa,也称为长形精子)鞭毛多发形态异常现象已有报道(liu x.etc.biochem biophys res commun,2020)。由高原低氧引起的精子鞭毛多发形态
异常继而造成精子前向运动能力降低严重威胁着高原男性人群生殖健康，其直接后果是畸形精子症、弱畸形精子症，严重者可导致男性不育。
6.由于高原低氧下精子鞭毛多发形态异常(hypoxic multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,hmmaf)药物治疗效果不佳，对于hmmaf的遗传学病因和致病机理并不明确，因此，深入研究hmmaf的表观遗传机制，探索有效控制低氧下精子鞭毛多发形态异常发生的方法，对于设计高原男性生殖防治措施具有十分重要的意义，对于我国高原地区的经济和国防建设也有重大意义。


技术实现要素：

7.针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了tip150蛋白激动剂在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的应用，其解决了现有技术中hmmaf的药物治疗效果不佳，hmmaf的遗传学病因和致病机理不明确的问题。
8.本发明一方面，提供tip150蛋白激动剂在制备药物中的应用，所述药物的功能为如下中的至少一种：
9.1)预防低氧下精子鞭毛多发形态异常；2)治疗低氧下精子鞭毛多发形态异常；3)提高精子运动能力。
10.进一步地，所述tip150蛋白激动剂包括增强tip150蛋白的活性或表达的制剂，其中，所述tip150蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
11.进一步地，所述制剂包括小分子化合物、核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体中的任一种。
12.优选地，所述核酸分子为以tip150蛋白的编码基因为靶序列、通过pcr扩增得到的产物；
13.所述pcr扩增用到的引物如seq id no.2-3所示。
14.优选地，所述表达载体为重组腺病毒载体。
15.本发明另一方面，提供一种tip150蛋白激动剂，所述tip150蛋白激动剂为能增强tip150蛋白的活性或表达的制剂。
16.进一步地，所述制剂为重组腺病毒颗粒。
17.进一步地，所述重组腺病毒颗粒的制备方法为：构建tip150过表达的重组腺病毒载体，经包装得到重组腺病毒颗粒。
18.优选地，所述重组腺病毒载体为adeasy016-padeasy-cmv-mtip150-6his-cmv-egfp。
19.本发明再一方面，提供一种试剂在制备试剂盒中的应用，所述试剂用于定量检测tip150蛋白的表达水平，所述试剂盒用于诊断低氧下精子鞭毛多发形态异常。
20.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
21.本发明首次发现并鉴定了低氧下精子鞭毛多发形态异常新的致病基因tip150基因。本发明通过对低氧下精子鞭毛多发形态异常小鼠精子的tip150基因的过表达，发现其精子的形态异常得到改善。并推测tip150通过影响鞭毛末端动态性、精子鞭毛生长持续时间等，影响鞭毛形态。由此可见，tip150基因在低氧下精子鞭毛多发形态异常中起着重要作用，从而为低氧下精子鞭毛多发形态异常提供了新的治疗途径。
附图说明
22.图1为本发明实施例1中western blot检测小鼠精子细胞和精子中tip150的表达效果图；其中，1a为精子细胞；1b为精子；
23.图2为本发明实施例2中adeasy016-padeasy-cmv-mtip150-6his-cmv-egfp的载体图谱；
24.图3为本发明实施例4中if检测慢病毒感染生精小管及生精小管中tip150表达(555nm)，其中，adv-ctl为对照组，adv-tip150为实验组；
25.图4为本发明实施例4中小鼠精子中tip150表达的western blot效果图；
26.图5为本发明实施例5中巴氏染色观察的精子畸形图；
27.图6为本发明实施例5中透射电镜观察精子中鞭毛中心体结构；
28.图7为本发明实施例5中活体成像检测追踪速度和微管突变频率，其中，5a为追踪速度，5b为微管突变频率。
具体实施方式
29.下面结合附图及实施例对本发明中的技术方案进一步说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均可购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
30.实施例1低氧下小鼠精子中tip150的变化
31.1、制备小鼠低氧hmmaf模型：将小鼠置于模拟海拔5800m高原低压氧舱内(压力：约360mmhg，氧含量10％)，连续低压低氧处理10w来复制小鼠低氧hmmaf模型。经鉴定低氧hmmaf模型复制成功。并设置21％氧浓度暴露10周组小鼠为对照组。
32.2、精子采集：打开腹腔，取出附睾组织，摘取双侧附睾尾进行液化与裂解后，得到精子细胞(圆形精细胞)和精子(长形精子)。western blot检测附睾尾精子细胞和精子中tip150的表达。结果如图1所示。具体方法如下：
33.(1)蛋白准备
34.1)用37℃温浴的pbs漂洗待处理的细胞，加入预冷的裂解液(现加pmsf，使终浓度为1mm)，在冰上用细胞刮刮下贴壁细胞，转入冰上静置裂解20min；
35.2)4℃低温10000g离心5min；
36.3)吸取上清进行蛋白定量。
37.(2)制胶
38.1)配制10％分离胶，上层用ddh2o密封，静置约60min；
39.2)弃掉上层水并用滤纸吸干，配制5％的积层胶，装配好梳子，静置凝固约40min；sds-page分离胶与积层胶配置体系如表1所示：
40.表1 sds-page分离胶与积层胶配置体系
[0041][0042]
3)每孔加入约5μl蛋白样品，每板胶的两侧的泳道各加蛋白分子量marker 3μl，其余泳道加入相同体积的1
×
上样缓冲液，补足电泳缓冲液，60v恒压预电泳，等样品进入分离胶后换成90v恒压电泳，待溴酚蓝染料电泳至底部时结束电泳。
[0043]
(3)转模
[0044]
取出凝胶，根据凝胶大小剪切大小一致的pvdf膜，将pvdf膜、滤纸放置电泳缓冲液中平衡20min，按照负极-海绵垫-滤纸-凝胶-pvdf膜-滤纸-海绵垫顺序制备三明治夹心，100v稳压转印1h。
[0045]
(4)封闭
[0046]
取出pvdf膜，将膜浸入5％bsa中孵育1h。
[0047]
(5)一抗孵育
[0048]
用一抗稀释液分别配制一抗工作液(tip150为1:1000，130kda，ab229121，abcam；gapdh为1:1000，38kda，ab77109，abcam)，将pvdf膜浸入装有一抗工作液的抗体孵育盒中，4℃过夜。取出pvdf膜，用1
×
tbst洗膜3次，10min/次。
[0049]
(6)二抗孵育
[0050]
加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，hrp)标记的二抗工作液(1:1000)，室温孵育1h，1
×
tbst洗膜3次，10min/次。
[0051]
(7)beyoecl plus显色
[0052]
等体积混合适量beyoecl plus a液和b液(碧云天)，均匀滴加到pvdf膜上，室温避光作用1min后放置凝胶成像分析仪显色观察，拍照保存。结果如图1所示。
[0053]
由结果可知，与21％氧浓度暴露10周组小鼠精子相较，10％氧浓度暴露10周组小鼠精子tip150蛋白表达降低。
[0054]
实施例2过表达tip150载体的构建
[0055]
1、引物设计
[0056]
小鼠tip150基因所在基因组序列是genbank accession no.nm_029920.7(update date2021-06-20)，根据该基因组序列设计引物，所用引物序列如下：
[0057]
正向引物(seq id no.2)：5
′‑
gttttcccagtcacgac-3
′
[0058]
反向引物(seq id no.3)：5
′‑
caggaaacagctatgac-3
′
[0059]
2、pcr扩增目的片段
[0060]
提取小鼠基因组dna，配制表2所示的pcr扩增体系，轻轻混匀，置于pcr仪中，按表3所示的pcr程序进行反应；
[0061]
表2 pcr扩增体系
[0062][0063][0064]
表3 pcr程序
[0065][0066]
该步骤得到tip150基因片段。
[0067]
3、tip150基因片段与载体连接
[0068]
(1)padeasy腺病毒表达载体(购自吉凯基因)酶切
[0069]
根据表4中顺序依次加入试剂，混匀，置于37℃水浴锅中反应1-2h；酶切结束之后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切片段；
[0070]
表4酶切反应体系
[0071]
[0072]
(2)配制表5中的反应体系，采用hb infusiontm一步克隆连接体系在50℃反应30min。
[0073]
表5连接反应体系
[0074][0075][0076]
本步骤最终得到tip150的过表达载体。
[0077]
4、转化
[0078]
(1)将dh5α感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于冰上融化；
[0079]
(2)待感受态融化后，以每管50μl的体积分装，加5μl过表达载体，冰上放置20-30min；
[0080]
(3)42℃热激90s，热激完之后冰育2-3min；
[0081]
(4)加入500μl lb培养基(无抗)；
[0082]
(5)37℃、230rpm震荡培养45-60min；
[0083]
(6)将菌液涂到ampicillin抗性的lb平板上，涂布均匀，倒置，37℃恒温箱培养12-16h。
[0084]
挑取若干单克隆菌落，接种于ampicillin抗性的培养液中，37℃恒温摇床培养过夜。然后用小量质粒提取试剂盒(invitrogen)提取质粒进行测序，测序结果与目的序列一致，目的质粒构建成功。
[0085]
5、腺病毒载体重组
[0086]
(1)将构建好的过表达载体，选择酶切位点maubi与ecorv,进行线性化，并进行琼脂糖胶回收；
[0087]
(2)使用制备好的含有腺病毒骨架质粒padeasy-1的e.coli bj5183感受态细胞(beyotime)，将回收好的线性化穿梭质粒进行转化，进行细胞内重组；
[0088]
(3)转化之后，涂板，37℃，培养12-16h；
[0089]
(4)选取单克隆进行培养，抽提质粒进行paci酶切验证；
[0090]
(5)验证正确的重组质粒转化e.coli stbl3感受态(百奥莱博)，得到高纯度的重组质粒adeasy016-padeasy-cmv-mtip150-6xhis-cmv-egfp，载体图谱如图2所示；
[0091]
(6)重组质粒paci线性化，待转染细胞。
[0092]
实施例3腺病毒包装
[0093]
1、细胞培养
[0094]
转染前一天，将293细胞接种于60mm培养皿，培养基为dmem+10％hyclon胎牛血清，置37℃含5％co2的培养箱中培养过夜。
[0095]
2、转染
[0096]
待细胞生长至底面积的长满到70～80％时，取重组腺病毒载体线性化质粒，用lipofiter
tm
转染试剂进行转染。具体步骤为：
[0097]
(1)转染前2小时更换完全培养基，取4μg重组腺病毒载体线性化质粒，用300μl的dmem培养液进行稀释，室温放置5min。
[0098]
(2)取15μl的lipofiter
tm
，用300μl的dmem培养液进行稀释，室温放置5min。
[0099]
(3)将两者混和，室温避光放置20min。然后将混合物加入到60mm培养皿中，置于37℃含5％co2的培养箱中培养。转染6小时后，更换新鲜的细胞培养液。反复收毒和冻融3次，得到含重组腺病毒颗粒adv-tip150的裂解上清。
[0100]
3、腺病毒纯化与检测
[0101]
(1)第一次超速离心
[0102]
将离心机预冷到4℃，将8ml cscl 1.4加入离心管中，继续加入10ml cscl 1.2，之后加入约20ml的病毒溶液；100000
×
g 90min，4℃；离心结束后，吸弃离心管上部的废液，病毒沉淀用te稀释得到病毒溶液。
[0103]
(2)第二次超速离心
[0104]
将12ml cscl 1.4加入离心管中，继续加入14ml cscl 1.2，加入8-10ml稀释好的病毒溶液,100000
×
g,16-20小时，4℃；离心结束后，吸弃离心管上部的废液，得到病毒沉淀。
[0105]
(3)透析
[0106]
用200
×
体积的透析buffer，透析三次，间隔一小时换一次液。
[0107]
(4)透析结束后得到adv-tip150，于-80℃保存病毒。
[0108]
同时以空质粒按同样方法转染293细胞得到空病毒，作为阴性对照adv-ctl。对病毒进行热源检测、微生物检测，同时用pcr法检测是否有野生病毒复制(rcl)，确保无热源，无细菌、真菌、病毒等微生物污染，无野生病毒复制。对病毒进行滴度检测，得到滴度为1.8
×
10
11
pfu/ml。
[0109]
实施例4adv-tip150对小鼠精子细胞中tip150基因的表达效果检测
[0110]
1、小鼠精子细胞培养
[0111]
分别将小鼠精子细胞系(63423，atcc，manassas,virginia，usa)与小鼠睾丸支持细胞系(crl-1715，atcc)共培养于改良dmem培养基(补加1μm睾酮、500miu/ml重组fsh、5μg/ml肾上腺素、10％胎牛血清)中，在32℃、5％co2培养箱中6h得到成熟精子。在培养基中加入实施例3制备的重组腺病毒颗粒adv-tip150，培养12小时后，去除原有培养基，并加入新鲜的egm-2完全培养基继续培养72小时。
[0112]
2、if检测慢病毒感染生精小管及生精小管中tip150表达(555nm)，结果如图3所示；western blot检测tip150表达，方法和步骤同实施例1中western blot检测tip150，结果如图4所示。
[0113]
结果表明，转入adv-tip150的精子细胞的tip150表达量明显高于转入adv-ctl的精子细胞的tip150表达量。本发明成功构建了过表达tip150的表达载体。
[0114]
实施例5adv-tip150对低氧处理小鼠精子鞭毛形态的影响
[0115]
将实施例3制备的adv-tip150以8
×
107tu/只剂量感染小鼠，并设立空病毒对照组，将小鼠放海拔5800米(约11.7％氧含量)低压氧舱饲养10w，并设立20％氧浓度暴露小鼠
10周为对照组，液化并收集附睾尾精子。
[0116]
1、巴氏染色法观察精子形态
[0117]
(1)长形精子分离：附睾尾投入37℃预热的0.5％bsa的f12，剪碎，液化10min。40μm细胞筛过滤，冲洗数次确保足够细胞滤过，转移细胞悬液至15ml离心管。1500rpm离心10min。弃上清，沉淀用红细胞裂解液裂解，大鼠加入裂解液为4ml/只，重悬2min。1500rpm离心10min。用pbs稀释后均匀涂抹于载玻片上，自然干燥。
[0118]
(2)巴氏染色：将玻片置于等量的95％乙醇和乙醚混合成的溶液中，固定5min，将玻片依次浸入80％、70％、50％乙醇溶液各1min，最后放入蒸馏水中1min；把玻片放入苏木精染液中染色3min，蒸馏水冲洗1min；放入0.5％盐酸乙醇中分色，约2min，蒸馏水冲洗1min；将玻片依次浸入50％、70％、80％乙醇溶液各1min；在橘黄g6染液中染色2min，然后将玻片浸入95％乙醇溶液中两次，每次2min；将玻片放入ea36中染色5min，然后浸入95％乙醇中3次，每次1min，再入无水乙醇中浸2min；将玻片放入二甲苯溶液中透明3次，每次1min；干燥后立即显微镜观察。结果如图5所示。
[0119]
2、透射电镜(transmission electron microscopy,tem)观察精子鞭毛轴丝中心体超微结构
[0120]
睾丸切除后，立即将组织切片成小样本(1mm3)，并在4℃下在3％缓冲戊二醛中固定4h；然后将组织样本在1％四氧化锇(oso4)中后固定90min；固定的组织用乙醇脱水，然后组织通过环氧丙烷转移到树脂中。在用纯树脂组织浸渍后，将样品嵌入相同的树脂混合物中。使用配备金刚石刀的超显微切片机(leica,uct)切割样品为60
–
70nm的超薄切片；将切片放置在铜网格上，用醋酸铀酰染色20min，以及采用柠檬酸铅染色5min。用透射电子显微镜(jem-1011,jeol,tokyo,japan)在80kv下观察染色切片。结果如图6所示。
[0121]
结果表明：与对照组相比，tip150过表达的小鼠中精子形态明显改善，精子畸形数量明显减少，精子中鞭毛中心体结构明显改善，正常中心体结构明显增多。
[0122]
3、活体成像检测追踪速度(瞬时加微管末端追踪速度的平均值)和微管突变频率(微管持续生长时间的平均值)检测，结果如图7a、7b所示。
[0123]
结果表明：与对照组相比，小鼠微管生长持续时间延长。
[0124]
由此推测，低氧下鞭毛多发形态异常可能和tip150表达降低有关。低氧下，鞭毛内tip150表达降低，导致mcak-tip150复合物(维持微管正端组装与解聚的平衡)的关联受到影响，从而影响微管末端动态性，以及微管生长持续时间，使得精子鞭毛形态发生改变。而过表达tip150，情况正好相反。
[0125]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。